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¿Es posible insertar ADN sin cortar el sitio de reconocimiento con CRISPR / Cas9?

¿Es posible insertar ADN sin cortar el sitio de reconocimiento con CRISPR / Cas9?


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Estamos buscando una forma de insertar ADN en un genoma, pero nos gustaría hacerlo de manera que el sitio de reconocimiento permanezca intacto para poder agregar nuevamente ADN en la misma ubicación. ¿Sabes si es posible o si ya es como lo hace CRISPR / Cas9? Aparentemente, ya se diseñaron varios sistemas, pero los pocos artículos que leímos no trataban de nuestro problema.

Atentamente,

Emilia


Observe la recombinación específica del sitio. Puede utilizar una recombinasa de sitio específico, específicamente una integrasa, que puede insertar una secuencia de ADN en un determinado sitio de unión. Puede agregar un sitio de conexión idéntico en la secuencia de ADN para insertar, lo que permite la reintegración de un nuevo sitio de conexión. Sin embargo, tenga en cuenta que es posible que obtenga SSR en el plásmido de inserción, así que no haga esto si necesita una cantidad específica de integración.

Mire la subfigura inferior de A para ver un ejemplo de integración. Las recombinasas también pueden hacer otras cosas, como la escisión y la inversión, según la orientación de los sitios de unión.


Las matemáticas explican por qué Crispr-Cas9 a veces corta el ADN incorrecto

Crédito: TU Delft

El descubrimiento de la proteína Cas9 ha simplificado la edición de genes e incluso puede hacer posible eliminar muchas enfermedades hereditarias en un futuro próximo. Con Cas9, los investigadores tienen la capacidad de cortar el ADN en una célula para corregir genes mutados o pegar nuevos trozos de material genético en el lugar recién abierto. Inicialmente, el sistema Crispr-Cas9 parecía ser extremadamente preciso. Sin embargo, ahora es evidente que Cas9 a veces también corta otras secuencias de ADN similares a las secuencias para las que fue programado. Los científicos de la Universidad Tecnológica de Delft han desarrollado un modelo matemático que explica por qué Cas9 corta algunas secuencias de ADN y deja otras en paz.

El sistema Crispr-Cas9 es un mecanismo de defensa que protege a las bacterias de los virus. Si un virus entra en una bacteria pero no se apodera de la célula, el sistema de defensa corta parte del material genético del virus y lo almacena en el propio genoma de la bacteria. El ADN viral incorporado actúa como una memoria genética. Si el mismo virus ataca a la bacteria (o sus descendientes), reconoce rápidamente al atacante y puede enviar proteínas Cas9 para rastrearlo. Usando el ARN viral como una especie de "hoja de trucos", la proteína busca ADN hostil en la célula. Si encuentra una coincidencia, el sistema Crispr-Cas9 corta el ADN viral, incapacitando la amenaza.

Los científicos inicialmente pensaron que Crispr-Cas9 solo escinde un trozo de ADN si coincide exactamente con la hoja de trucos de ARN que lleva. Sin embargo, ahora se ha demostrado que esa suposición es incorrecta. La proteína a veces corta secuencias de ADN que se asemejan al material que está buscando, pero que contienen varias letras diferentes. Según el investigador Martin Depken de la Universidad Tecnológica de Delft, cortar secuencias tan ligeramente diferentes es muy lógico desde un punto de vista evolutivo. "Los virus mutan constantemente y, por lo tanto, pueden tener una estructura genética diferente a la que busca Cas9", dice. "Al cortar también secuencias de ADN que son ligeramente diferentes, el sistema Crispr-Cas9 puede rastrear la evolución de un virus y proteger mejor a la bacteria contra sus enemigos".

Pero en este caso, lo que es bueno para las bacterias es malo para los humanos. Si queremos usar Cas9 para editar genes a partir del ADN, es imperativo que no se corten otros genes que los que apuntan los investigadores. La destrucción de otro material genético puede tener consecuencias nefastas.

Los experimentos han demostrado que es más probable que Crispr-Cas9 corte ciertas secuencias que no coinciden que otras. Científicos del grupo de investigación de Martin Depken, dirigido por Ph.D. La estudiante Misha Klein, se preguntó cuáles eran las físicas subyacentes que determinaban esta preferencia. Depken dice que se trata de la energía que cuesta hacer pares de bases que se desvíen de la plantilla de ARN.

"Cuando Cas9 comprueba si una secuencia de ADN coincide, comienza en un extremo de la hebra", explica Depken. Luego, verifica todas las letras de la hebra por turno. Para cada coincidencia, Cas9 es recompensado con energía, mientras que cualquier desajuste cuesta energía. Cuantos más errores contenga una secuencia de ADN y más cerca estén del inicio de la secuencia, cuanto más probable es que la proteína se abstenga de cortar, en cambio, se desvinculará del ADN y continuará su búsqueda de una pieza de material genético que coincida mejor con su plantilla de ARN.

Según Depken, el modelo matemático simple desarrollado por su grupo predice sorprendentemente bien los datos existentes sobre el comportamiento de corte de Cas9. Si se sitúa un error al final de la secuencia, es probable que la proteína haya acumulado suficiente energía para superar ese obstáculo, lo que aumenta la probabilidad de corte. El modelo también explica por qué Cas9 se abstiene de cortar cuando encuentra un desajuste al comienzo de una secuencia, o cuando dos desajustes están muy juntos.

Cuando se trata de la probabilidad de que se corte una secuencia de ADN, las propiedades físicas de la proteína Cas9 en sí también juegan un papel. Depken y sus colegas ahora buscan incorporar esta variable en su modelo. En última instancia, el modelo debería conducir a mejores predicciones de los errores que es probable que cometa Cas9. "A veces, hay una opción en la ubicación exacta para cortar cuando se fija un gen, y nuestro modelo ayudará a determinar qué ubicaciones son las mejores para apuntar", dice Depken. La comprensión física proporcionada por el modelo también puede ayudar a los esfuerzos para evitar errores potencialmente mortales al editar el ADN.


Preparación de ADN

La clonación molecular implica la introducción de ADN, como un inserto, en una molécula de vector. El ADN que se va a clonar se puede obtener cortándolo de una fuente de ADN mediante digestión con enzimas de restricción, copiándolo de una molécula fuente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la transcripción inversa-PCR (RT-PCR), o ensamblándolo a partir de piezas cortas de ADN (oligonucleótidos). Todos estos métodos requieren que la fuente de ADN esté suficientemente libre de contaminantes que potencialmente podrían inhibir las actividades enzimáticas (endonucleasas, polimerasas) involucradas en el procesamiento del ADN para la clonación.


La clonación tradicional mediante digestión con endonucleasas de restricción puede utilizar cualquiera de varios tipos de ADN fuente diferentes. El ADN genómico puede digerirse con una enzima de restricción y clonarse en un sitio de vector compatible para producir una biblioteca de diferentes insertos, todos a partir de la misma fuente de ADN. El ADN ya clonado en un vector se puede transferir (subclonar) a un nuevo vector receptor cortando el ADN con enzimas de restricción y clonando en los sitios correspondientes del segundo vector. Esto se realiza con frecuencia para facilitar la expresión de proteínas o la transcripción de ARN, por ejemplo, lo que podría no ser posible a partir del vector original.

La PCR se usa a menudo para generar ADN para la clonación y con frecuencia se incorporan sitios de restricción en los sitios del cebador para que el ADN amplificado pueda digerirse y clonarse en sitios de restricción compatibles del vector de clonación. Cualquier tipo de ADN que contenga la secuencia deseada puede servir como molde para la PCR. La clonación con dos enzimas de restricción distintas asegura que se generen extremos no compatibles en cada molécula, evitando así la recircularización simple del vector y forzando la clonación direccional de los insertos. Esto puede ser importante para garantizar un marco de lectura abierto de traducción para la expresión de proteínas. La modificación de los extremos del ADN después de la digestión por restricción puede resultar útil en determinadas situaciones. Por ejemplo, en la clonación no direccional, donde se usa una única enzima de restricción, la desfosforilación del ADN del vector digerido evitará la recircularización del vector, aumentando así la proporción de las moléculas de ADN recombinante deseadas.

La PCR se utiliza cada vez más para preparar ADN para aplicaciones de clonación. El ADN amplificado se puede clonar directamente o después de la digestión de restricción con sitios de restricción diseñados en los cebadores utilizados para la PCR. Alternativamente, el ADN amplificado se puede utilizar en estrategias de clonación sin fisuras como NEBuilder HiFi DNA Assembly o en Ligation Independent Cloning. Las moléculas de vector para estos métodos de clonación también pueden producirse mediante PCR. El ADN amplificado con polimerasa Taq tiene una adenosina única (A) independiente de la plantilla agregada en los extremos 3 y rsquo que permite la clonación en vectores complementarios de cola en T. Las polimerasas de corrección de pruebas de alta fidelidad no añaden bases adicionales que permitan la clonación del ADN amplificado en sitios de restricción de extremos romos. Dependiendo de la estrategia de clonación elegida, los extremos del ADN amplificado se pueden modificar mediante cola A, embotamiento o adición o eliminación de grupos 5 & rsquo-fosfato. El ADN complementario (ADNc) generado por transcripción inversa de ARN también puede amplificarse mediante PCR. Esta capacidad de sintetizar ADN a partir de moldes de ARN permite la clonación de secuencias correspondientes a transcripciones de genes.


Instituto amplio

R: “CRISPR” (pronunciado “nítido”) son las siglas de Repeticiones Palindrómicas Cortas Clustered Regularly Interspaced, que son el sello distintivo de un sistema de defensa bacteriana que forma la base de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9. En el campo de la ingeniería del genoma, el término "CRISPR" o "CRISPR-Cas9" se usa a menudo de manera vaga para referirse a los diversos sistemas CRISPR-Cas9 y -CPF1, (y otros) que se pueden programar para apuntar a tramos específicos de código genético. y para editar el ADN en ubicaciones precisas, así como para otros fines, como para nuevas herramientas de diagnóstico. Con estos sistemas, los investigadores pueden modificar permanentemente genes en células y organismos vivos y, en el futuro, pueden hacer posible corregir mutaciones en ubicaciones precisas del genoma humano para tratar las causas genéticas de enfermedades. Ahora hay otros sistemas disponibles, como CRISPR-Cas13, que el ARN objetivo proporciona vías alternativas de uso y con características únicas que se han aprovechado para herramientas de diagnóstico sensibles, como SHERLOCK.

P: ¿De dónde provienen los CRISPR?

R: Los CRISPR fueron descubiertos por primera vez en arqueas (y luego en bacterias) por Francisco Mojica, un científico de la Universidad de Alicante en España. Propuso que los CRISPR sirvan como parte del sistema inmunológico bacteriano, defendiéndose de los virus invasores. Consisten en secuencias repetidas de código genético, interrumpidas por secuencias “espaciadoras”, remanentes de código genético de invasores pasados. El sistema funciona como una memoria genética que ayuda a la célula a detectar y destruir a los invasores (llamados "bacteriófagos") cuando regresan. La teoría de Mojica fue demostrada experimentalmente en 2007 por un equipo de científicos dirigido por Philippe Horvath.

En enero de 2013, el laboratorio de Zhang publicó el primer método para diseñar CRISPR para editar el genoma en células humanas y de ratón.

Para obtener más información sobre muchos de los científicos y equipos que contribuyeron a la comprensión y el desarrollo del sistema CRISPR desde el descubrimiento inicial hasta las primeras demostraciones de la edición del genoma mediada por CRISPR, visite nuestra línea de tiempo CRISPR.

P: ¿Cómo funciona el sistema?

R: Las secuencias “espaciadoras” de CRISPR se transcriben en secuencias de ARN cortas (“ARN CRISPR” o “ARNcr”) capaces de guiar el sistema a secuencias coincidentes de ADN. Cuando se encuentra el ADN objetivo, Cas9, una de las enzimas producidas por el sistema CRISPR, se une al ADN y lo corta, desactivando el gen objetivo. Usando versiones modificadas de Cas9, los investigadores pueden activar la expresión genética en lugar de cortar el ADN. Estas técnicas permiten a los investigadores estudiar la función del gen.

La investigación también sugiere que CRISPR-Cas9 se puede utilizar para apuntar y modificar "errores tipográficos" en la secuencia de tres mil millones de letras del genoma humano en un esfuerzo por tratar enfermedades genéticas.


Representación de un artista del sistema CRISPR en acción.
Ilustración de Stephen Dixon.

P: ¿Cómo se compara CRISPR-Cas9 con otras herramientas de edición del genoma?

R: CRISPR-Cas9 está demostrando ser una alternativa eficiente y personalizable a otras herramientas de edición del genoma existentes. Dado que el sistema CRISPR-Cas9 en sí mismo es capaz de cortar hebras de ADN, los CRISPR no necesitan combinarse con enzimas de escisión independientes como lo hacen otras herramientas. También se pueden combinar fácilmente con secuencias de ARN “guía” (ARNg) hechas a medida diseñadas para conducirlos a sus objetivos de ADN. Ya se han creado decenas de miles de secuencias de ARNg de este tipo y están disponibles para la comunidad de investigadores. CRISPR-Cas9 también se puede usar para apuntar a múltiples genes simultáneamente, que es otra ventaja que lo distingue de otras herramientas de edición de genes.

P: ¿En qué se diferencia CRISPR-Cpf1 de CRISPR-Cas9?

CRISPR-Cpf1 se diferencia en varios aspectos importantes del Cas9 descrito anteriormente, con importantes implicaciones para la investigación y la terapéutica.

Primero, en su forma natural, la enzima de corte de ADN Cas9 forma un complejo con dos ARN pequeños, ambos necesarios para la actividad de corte. El sistema Cpf1 es más simple porque solo requiere un único ARN. La enzima Cpf1 también es más pequeña que la SpCas9 estándar, lo que facilita su administración a las células y tejidos.

En segundo lugar, y quizás lo más significativo, Cpf1 corta el ADN de una manera diferente a Cas9. Cuando el complejo Cas9 corta el ADN, corta ambas hebras en el mismo lugar, dejando "extremos romos" que a menudo sufren mutaciones cuando se vuelven a unir. Con el complejo Cpf1, los cortes en las dos hebras se compensan, dejando pequeños voladizos en los extremos expuestos. Se espera que esto ayude con una inserción precisa, permitiendo a los investigadores integrar un fragmento de ADN de manera más eficiente y precisa.

En tercer lugar, Cpf1 corta lejos del sitio de reconocimiento, lo que significa que incluso si el gen objetivo muta en el sitio de corte, es probable que aún se pueda volver a cortar, lo que permite que se produzcan múltiples oportunidades de edición correcta.

En cuarto lugar, el sistema Cpf1 proporciona una nueva flexibilidad a la hora de elegir los sitios de destino. Al igual que Cas9, el complejo Cpf1 primero debe unirse a una secuencia corta conocida como PAM, y deben elegirse objetivos que sean adyacentes a las secuencias de PAM naturales. El complejo Cpf1 reconoce secuencias de PAM muy diferentes de las de Cas9. Esto podría ser una ventaja para apuntar, por ejemplo, al genoma del parásito de la malaria e incluso al genoma humano.

P: ¿Qué otros usos científicos podría tener CRISPR más allá de la edición del genoma?

R: La edición del genoma CRISPR permite a los científicos crear rápidamente modelos celulares y animales, que los investigadores pueden utilizar para acelerar la investigación de enfermedades como el cáncer y las enfermedades mentales. Además, CRISPR se está desarrollando ahora como un diagnóstico rápido. Para ayudar a fomentar este tipo de investigación en todo el mundo, Feng Zhang y su equipo han capacitado a miles de investigadores en el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR a través de la educación directa y al compartir más de 40.000 componentes CRISPR con laboratorios académicos de todo el mundo.


Llegar a fin de mes: integración dirigida de fragmentos de ADN mediante la edición del genoma

La inserción dirigida de grandes trozos de ADN es un objetivo importante de la ingeniería genética. Sin embargo, este objetivo ha sido difícil de alcanzar ya que los métodos clásicos para la reparación dirigida por homología son ineficaces y, a menudo, no son factibles en muchos sistemas. Aquí se describen avances recientes que permiten la inserción genómica específica del sitio de ADN relativamente grande con una eficiencia mucho mejorada. Utilizando la vía de reparación preferida en la célula de unión de extremos no homólogos, se podría introducir ADN de hasta varios kb con una precisión notablemente buena mediante los métodos de HITI y ObLiGaRe con una eficiencia de hasta el 30-40%. Los avances recientes que utilizan la reparación dirigida por homología (métodos de brazos de homología cortos de PITCh que incluyen ssODN 2H2OP) han aumentado significativamente la eficiencia para la inserción de ADN, a menudo hasta un 40-50% o incluso más, según el método y la longitud del ADN. Se resumen los desafíos restantes de la precisión de la integración y las inserciones en sitios fuera de destino. En general, los avances actuales proporcionan importantes pasos para la inserción específica de un sitio de ADN grande en genomas de una amplia gama de células y organismos.

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Activación y represión de genes diana usando Cas9

Un aspecto único de Cas9 es su capacidad para unirse al ADN objetivo independientemente de su capacidad para adherirse ADN objetivo. En otras palabras, Cas9 que contiene mutaciones que interrumpen la escisión del ADN (D10A y H840A para SpCas9), todavía es capaz de unirse al ADN diana. Además, la llamada Cas9 muerta por nucleasa o "dCas9" se puede utilizar como plataforma para entregar varias cargas a loci de ADN específicos fusionándolos directamente con dCas9. Esta propiedad de dCas9 se ha aprovechado para localizar una serie diversa de proteínas en genes diana, incluidos activadores y represores transcripcionales.

Reprimir genes diana usando represores basados ​​en dCas9

Los primeros experimentos que utilizaron dCas9 en bacterias demostraron que dirigir dCas9 a los sitios de inicio de la transcripción era suficiente para "reprimir" o "derribar" la transcripción bloqueando el inicio de la transcripción. En células de mamíferos, la represión robusta requiere dirigirse a dCas9 marcado con represores transcripcionales a la región promotora del gen de interés. Es posible que desee considerar el uso de represores basados ​​en dCas9, incluido dCas9-KRAB, cuando eliminar el gen objetivo es tóxico para las células. Los plásmidos para reprimir genes diana en una variedad de especies y tipos de células se pueden encontrar en el sitio web de Addgene.

Activación de genes diana usando activadores basados ​​en dCas9

La gama de activadores basados ​​en dCas9 es bastante diversa. El activador más simple consiste en dCas9 fusionado a un solo dominio de activación transcripcional (típicamente VP64). Recientemente se ha desarrollado una segunda generación de activadores que alteran la expresión génica utilizando algunos enfoques diferentes. Por ejemplo, el sistema "SunTag" facilita el reclutamiento de múltiples dominios de activación en el mismo locus genético a través de la coexpresión de dCas9 etiquetado con epítopo y proteínas de fusión de anticuerpo-activador. El complejo Synergistic Activation Mediator consiste en una fusión dCas9-VP64 y un gRNA modificado que es capaz de interactuar con un activador transcripcional de unión a RNA adicional. En el sitio web de Addgene se pueden encontrar plásmidos adicionales para activar genes diana en una variedad de especies y tipos de células.


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CRISPR inspira nuevos trucos para editar genes

REHABILITADO Los ajustes al editor de genes de vanguardia conocido como CRISPR mejoran sus poderes.

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Los científicos generalmente evitan usar la palabra milagro - a menos que estén hablando de la herramienta de edición de genes llamada CRISPR / Cas9. “Puedes hacer cualquier cosa con CRISPR”, dicen algunos. Otros simplemente lo llaman asombroso.

CRISPR puede manipular rápida y eficazmente prácticamente cualquier gen de cualquier planta o animal. En los cuatro años desde que existe CRISPR, los investigadores lo han utilizado para corregir enfermedades genéticas en animales, combatir virus, esterilizar mosquitos y preparar órganos de cerdo para trasplantes humanos. La mayoría de los expertos piensan que eso es solo el comienzo. Las poderosas posibilidades de CRISPR, incluso las controvertidas nociones de crear "bebés de diseño" y erradicar especies enteras, son asombrosas y, a veces, aterradoras.

Hasta ahora, el mayor impacto de CRISPR se ha sentido en los laboratorios de biología básica de todo el mundo. El editor de genes económico y fácil de usar ha hecho posible que los investigadores profundicen en los misterios fundamentales de la vida de formas que habían sido difíciles o imposibles. El biólogo del desarrollo Robert Reed compara CRISPR con un mouse de computadora. "Puedes apuntarlo a un lugar del genoma y puedes hacer lo que quieras en ese lugar".

Cualquier cosa, es decir, siempre que implique cortar el ADN. CRISPR / Cas9 en su encarnación original es un dispositivo de localización (la parte CRISPR) que guía las tijeras moleculares (la enzima Cas9) a una sección objetivo de ADN. Juntos, funcionan como un misil de crucero de ingeniería genética que desactiva o repara un gen, o inserta algo nuevo donde corta.

Incluso con todas las proezas genéticas que puede hacer el sistema CRISPR / Cas9, “hubo deficiencias. Había cosas que queríamos hacer mejor ”, dice el biólogo molecular del MIT Feng Zhang, uno de los primeros científicos en manejar las tijeras moleculares. Desde su primer informe en 2013 sobre el uso de CRISPR / Cas9 para cortar genes en células humanas y de ratón, Zhang ha descrito formas de hacer que el sistema funcione de manera más precisa y eficiente.

No está solo. Una ráfaga de artículos en los últimos tres años ha aportado mejoras detalladas al editor. Yendo aún más lejos, un grupo de científicos, incluido Zhang, han ideado formas de hacer que CRISPR haga el trabajo de una caja de herramientas.

Para convertir CRISPR en una multitarea, a menudo se comienza con el embotamiento de la tecnología de vanguardia. En muchas de sus nuevas adaptaciones, las tijeras Cas9 "muertas" no pueden cortar el ADN. Las tijeras rotas pueden parecer inútiles, pero los científicos las han reciclado en pintores de cromosomas, correctores de errores tipográficos, estimuladores e inhibidores de la actividad genética y modificadores del genoma en general.

"El Cas9 original es como una navaja suiza con una sola aplicación: es un cuchillo", dice Gene Yeo, biólogo de ARN de la Universidad de California en San Diego. Pero Yeo y otros investigadores han atornillado otras proteínas y sustancias químicas a las hojas desafiladas y han transformado el cuchillo en una herramienta multifuncional.

Zhang y sus colegas también están explorando intercambiar la parte Cas9 del sistema por otras enzimas que podrían expandir los tipos de manipulaciones que los científicos pueden realizar en el ADN y otras moléculas. Con la caja de herramientas ampliada, los investigadores pueden tener el poder de abrir secretos sobre el cáncer y otras enfermedades y responder nuevas preguntas sobre biología.

Haciendo mas

CRISPR / Cas9 tradicional es una cosa: unas tijeras específicas. Un ARN guía conduce la enzima Cas9 a un tramo específico de ADN. Luego, Cas9 escinde el ADN para desactivar o reparar un gen.

E. Otwell

Ahora los investigadores están ampliando lo que CRISPR / Cas9 puede hacer al convertir el cortador en una plataforma para una gran cantidad de herramientas especializadas.

E. Otwell

Un Cas9 desactivado o "muerto" puede corregir un error tipográfico de una sola base en las instrucciones genéticas del ADN. A través de una serie de pasos, la enzima citidina desaminasa atornillada a Cas9 muerta convierte un par de bases de ADN C-G en un par de bases T-A.

E. Otwell

Al colocar etiquetas fluorescentes en Cas9 muerto, los investigadores pueden localizar y observar ciertos tramos de ADN (izquierda) o ARN (derecha) en una célula viva.

E. Otwell

Dead Cas9 puede impedir que la ARN polimerasa active un gen, un proceso llamado CRISPRi (por interferencia CRISPR). En CRISPRa (activación de CRISPR), una proteína que activa los genes se fusiona con Cas9 muerto.

E. Otwell

Las proteínas modificadoras epigenéticas fusionadas con Cas9 muerto unen etiquetas químicas al ADN o a las histonas (proteínas que empaquetan el ADN). Las etiquetas afectan la actividad de los genes pero no cambian las instrucciones del gen.

Orientación flexible

Muchas enzimas pueden cortar el ADN. Las primeras fueron descubiertas en la década de 1970 y ayudaron a lanzar todo el campo de la ingeniería genética. Lo que hace especial a CRISPR / Cas9 es su precisión. Los científicos pueden hacer cortes quirúrgicos en un lugar seleccionado, a diferencia del enfoque más disperso de las primeras herramientas. Algunas tecnologías recientes de edición de genes, como las nucleasas con dedos de zinc y las TALEN, también podrían centrarse en un solo objetivo. Pero esos editores de genes son difíciles de redirigir. Un científico que quiera recortar un nuevo lugar en el genoma tiene que crear un nuevo editor. Eso es como tener que montar un misil guiado único para cada objetivo posible en un mapa. Con CRISPR / Cas9, eso no es necesario.

El secreto de la flexibilidad de CRISPR es su sistema de orientación. Un pequeño fragmento de ARN conduce la enzima de corte Cas9 a su ADN objetivo. El "ARN guía" puede ubicarse en cualquier lugar que un investigador seleccione al emparejarse químicamente con los bloques de construcción o bases que contienen información del ADN (indicados por las letras A, T, C y G). Hacer un nuevo ARN guía es fácil, los investigadores a menudo simplemente solicitan uno en línea escribiendo la secuencia deseada de bases.

Ese sistema de orientación está llevando a los ingenieros genéticos a lugares donde nunca han estado. “Con CRISPR, literalmente de la noche a la mañana, lo que había sido la mayor frustración de mi carrera se convirtió en un proyecto secundario de pregrado”, dice Reed, de la Universidad de Cornell. "Fue increíble."

CRISPR / Cas9 puede manipular genéticamente mariposas cortando un gen llamado Menos distal provoca más manchas en los ojos (derecha) de las que aparecen en un ala normal (izquierda). L. Zhang y R.D. Reed /Comunicaciones de la naturaleza 2016

Reed estudia cómo se pintan los patrones en las alas de las mariposas y las polillas. El patrón de color es una de las preguntas fundamentales que los biólogos evolutivos y del desarrollo han estado tratando de responder durante décadas. En 1994, Sean B. Carroll y sus colegas descubrieron que un gen llamado Menos distal se enciende en alas de mariposa en los lugares donde más tarde se forman las manchas oculares. El gen parecía ser necesario para la formación de manchas oculares, pero la evidencia era solo circunstancial. Ahí es donde los investigadores han estado estancados durante 20 años, dice Reed. No tenían forma de manipular los genes en las alas de las mariposas para obtener una prueba más directa del papel de los diferentes genes en la pintura de los patrones de las alas.

Con CRISPR / Cas9, el colega de Reed y Cornell Linlin Zhang cortó y deshabilitó el Menos distal gen en una etapa temprana del desarrollo de las alas y obtuvo un resultado inesperado: en lugar de causar manchas en los ojos, Menos distal los limita. Cuando CRISPR / Cas9 noquea Menos distal, aparecen más y más grandes manchas oculares, informaron los investigadores en junio en Comunicaciones de la naturaleza. Reed y sus colegas han recortado genes no solo en una, sino en seis especies de mariposas diferentes utilizando CRISPR, dice.

CRISPR corta genes muy bien, quizás demasiado bien, dice el neurocientífico Marc Tessier-Lavigne de la Universidad Rockefeller en la ciudad de Nueva York. “La enzima Cas9 es tan prolífica. Corta y recorta y recorta ”, dice. Ese corte constante puede resultar en mutaciones no deseadas en genes que los investigadores están editando o en genes que nunca tuvieron la intención de tocar. Tessier-Lavigne y sus colegas descubrieron cómo domesticar la enzima demasiado ávida y evitar que destruya los genes de las células madre humanas cultivadas en placas de laboratorio. Con un mejor control, los investigadores podrían hacer una o dos mutaciones en dos genes involucrados en la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano, informaron en el 5 de mayo. Naturaleza. El crecimiento de las células madre mutadas en células cerebrales mostró que el aumento del número de copias mutadas de los genes también aumenta la producción del péptido beta amiloide que forma placas en los cerebros afectados por la enfermedad de Alzheimer. La tecnología podría hacer que las células madre imiten mejor las enfermedades humanas.

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Controlando el editor

Los investigadores domesticaron el cortador Cas9 para que cortara una o ambas copias de un gen y luego se detuviera. Cortando el APLICACIÓN y PSEN1 los genes producen mutaciones que imitan a las de las personas propensas a la enfermedad de Alzheimer de inicio temprano. Las neuronas produjeron más un péptido formador de placa anormal con dos mutaciones (barras más oscuras) que con una mutación.

E. Otwell

Fuente: D. Paquet et al / Naturaleza 2016

Mientras Tessier-Lavigne y otros están trabajando para mejorar el sistema CRISPR / Cas9, construyendo mejores ARN guía y aumentando la especificidad de sus cortes, algunos investigadores se están alejando por completo de Cas9.

Ediciones matizadas

Cas9 no es el único culpable del desorden creado cuando causa una ruptura de doble hebra al cortar ambos rieles de la escalera de ADN. "La respuesta de la célula a las roturas de doble cadena es la fuente de muchos problemas", dice David Liu, biólogo químico de la Universidad de Harvard. El método de referencia de una célula para reparar una brecha de ADN es pegar los extremos cortados nuevamente. Pero a menudo faltan algunas bases o las partes se atascan donde no pertenecen. El resultado es más "vandalismo del genoma que edición", dice Liu, citando a su colega de Harvard George Church.

Liu quería un editor de genes que no causara brechas destructivas: uno que pudiera A) ir a un sitio específico en un gen y B) cambiar una base de ADN particular allí, todo sin cortar el ADN. La herramienta no existía, pero en Cas9, Liu y sus colegas vieron los ingredientes de una, si pudieran modificarla un poco.

Comenzaron por embotar la vanguardia de Cas9, matando efectivamente la enzima. El Cas9 "muerto" aún podía agarrar el ARN guía y llevarlo a su destino, pero no podía cortar las hebras dobles del ADN. Luego, Liu y sus colegas adjuntaron una enzima de autostop, cuyo trabajo es iniciar una serie de pasos para cambiar la base del ADN C en una T, o una G en una A. Los investigadores tuvieron que modificar el sistema de otras formas para obtener el cambio. pegarse. Una vez que resolvieron los problemas, pudieron realizar cambios permanentes de un solo par de bases en el 15 al 75 por ciento del ADN al que se dirigieron sin introducir inserciones y eliminaciones como lo hace a menudo la edición CRISPR tradicional. Liu y colaboradores informaron el logro en Naturaleza En Mayo. Un editor de base similar, informado en Ciencias en agosto por investigadores en Japón, puede ser útil para editar el ADN en bacterias y otros organismos que no pueden tolerar que se les corte el ADN.

Hay 12 combinaciones posibles de intercambios de bases de ADN. La enzima de autostop que utilizó Liu, citidina desaminasa, puede hacer dos de los intercambios. Liu y otros están trabajando para fusionar enzimas a Cas9 que pueden hacer las otras 10. Otros autoestopistas enzimáticos pueden hacer posible editar bases de ADN individuales a voluntad, dice Liu. Dicho editor de base podría usarse para corregir mutaciones únicas que causan enfermedades genéticas como la fibrosis quística o la distrofia muscular. Incluso podría corregir las mutaciones que conducen al cáncer de mama hereditario.

Reescribiendo la partitura

Dead Cas9 ya está ayudando a los investigadores a manipular el ADN de formas que antes no podían. Las variaciones en la hoja desafilada pueden ayudar a los científicos a resolver uno de los grandes misterios de la biología: ¿cómo el mismo conjunto de 20.000 genes da lugar a tantos tipos diferentes de células en el cuerpo?

El genoma es como un piano, dice Jonathan Weissman, bioquímico de la Universidad de California en San Francisco. "Puedes tocar una gran variedad de música diferente con solo 88 teclas según la fuerza con la que presionas las teclas, las teclas que mezclas y la sincronización". Al reducir o aumentar la actividad de combinaciones de genes en momentos precisos durante el desarrollo, las células se convencen para que se conviertan en cientos de tipos diferentes de células corporales.

Durante los últimos 20 años, los investigadores han estado aprendiendo más sobre ese proceso al observar cuándo ciertos genes se activan y desactivan en diferentes células. La actividad genética está controlada por una vertiginosa variedad de proteínas conocidas como factores de transcripción. Cuándo y dónde actúa un factor de transcripción está determinado, al menos en parte, por etiquetas químicas en el ADN y las proteínas histonas que lo empaquetan. Esas etiquetas se conocen colectivamente como marcas epigenéticas. Trabajan algo así como la partitura musical de una orquesta, diciéndole al factor de transcripción "músicos" qué notas tocar y qué tan alto o suave tocar. Hasta ahora, los científicos solo han podido escuchar la música. Con Cas9 muerto, los investigadores pueden crear moléculas que cambiarán las notas epigenéticas en cualquier lugar de la partitura, dice Weissman, lo que permite a los investigadores organizar su propia música.

Se alega que las marcas epigenéticas están relacionadas con la adicción, el cáncer, las enfermedades mentales, la obesidad, la diabetes y las enfermedades cardíacas. Scientists haven’t been able to prove that epigenetic marks are really behind these and other ailments, because they could never go into a cell and change just one mark on one gene to see if it really produced a sour note.

One such epigenetic mark, the attachment of a chemical called an acetyl group to a particular amino acid in a histone protein, is often associated with active genes. But no one could say for sure that the mark was responsible for making those genes active. Charles Gersbach of Duke University and colleagues reported last year in Nature Biotechnology that they had fused dead Cas9 to an enzyme that could make that epigenetic mark. When the researchers placed the epigenetic mark on certain genes, activity of those genes shot up, evidence that the mark really does boost gene activity. With such CRISPR epigenetic editors in hand, researchers may eventually be able to correct errant marks to restore harmony and health.

Weissman’s lab group was one of the first to turn dead Cas9 into a conductor of gene activity. Parking dead Cas9 on a gene is enough to nudge down the volume of some genes’ activity by blocking the proteins that copy DNA into RNA, the researchers found. Fusing a protein that silences genes to dead Cas9 led to even better noise-dampening of targeted genes. Los investigadores informaron en Celda in 2014 that they could reduce gene activity by 90 to 99 percent for some genes using the silencer (which Weissman and colleagues call CRISPRi, for interference). A similar tool, created by fusing proteins that turn on, or activate, genes to dead Cas9 (called CRISPRa, for activator) lets researchers crank up the volume of activity from certain genes. In a separate study, published in July in the procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias, Weissman and colleagues used their activation scheme to find new genes that make cancer cells resistant to chemo­therapy drugs.

RNA revolution

New, refitted Cas9s won’t just make manipulating DNA easier. They also could revolutionize RNA biology. There are already multiple molecular tools for grabbing and cutting RNA, Yeo says. So for his purposes, scissors weren’t necessary or even desirable. The homing ability of CRISPR/Cas9 is what Yeo found appealing.

He started simple, by using a tweaked CRISPR/Cas9 to tag RNAs to see where they go in the cell. Luckily, in 2014, Jennifer Doudna at the University of California, Berkeley — one of the researchers who in 2012 introduced CRISPR/Cas9 — and colleagues reported that Cas9 could latch on to messenger RNA molecules, or mRNAs (copies of the protein-building instructions contained in DNA). In a study published in April in Celda, Doudna, Yeo and colleagues strapped fluorescent proteins to the back of a dead Cas9 and pointed it toward mRNAs from various genes.

CRISPR attaches fluorescent tags to chromosome endcaps, called telomeres, in a cell’s nucleus (top, green) as well as to centromeres, where chromosomes are pinched together (center, red). Combining images shows where the structures are in relation to each other. S. Wang et al/Scientific Reports 2016

With the glowing Cas9, the researchers tracked mRNAs produced from several different genes in living cells. (Previous methods for pinpointing RNA’s location in a cell killed the cell.) In May, Zhang of MIT and colleagues described a two-color RNA-tracking system in Informes científicos. Yet another group of researchers described a CRISPR rainbow for giving DNA a multicolored glow, also in living cells. That glow allowed the team to pinpoint the locations of up to six genes and see how the three-dimensional structure of chromosomes in the nucleus changes over time, the researchers reported in the May Nature Biotechnology. A team from UC San Francisco reported in January in Investigación de ácidos nucleicos that it had tracked multiple genes using combinations of two color tags.

But Yeo wants to do more than watch RNA move around. He envisions bolting a variety of different proteins to Cas9 to manipulate and study the many steps an mRNA goes through between being copied from DNA and having its instructions read to make a protein. Learning more about that multistep process and what other RNAs do in a cell could help researchers understand what goes wrong in some diseases, and maybe learn how to fix the problems.

Zhang wants to improve Cas9, but he would also like other versatile tools. He and colleagues are looking for such tools in bacteria.

CRISPR/Cas9 was first discovered in bacteria as a rudimentary immune system for fighting off viruses (SN: 12/12/15, p. dieciséis). It zeroes in on and then shreds the viral DNA. Researchers most often use the Cas9 cutting enzyme from Estreptococo pyogenes bacterias.

But almost half of all bacteria have CRISPR immune systems, scientists now know, and many use enzymes other than Cas9. In the bacterium Francisella novicida U112, Zhang and colleagues found a gene-editing enzyme, Cpf1, which does things a little differently than Cas9 does. It has a different “cut here” signal that could make it more suitable than Cas9 for cutting DNA in some cases, the team reported last October in Celda. Cpf1 can also chop one long guide RNA into multiple guides, so researchers may be able to edit several genes at once. And Cpf1 cuts DNA so that one strand of the DNA is slightly longer than the other. That could make it easier to insert new genes into DNA.

Zhang more recently found an enzyme in the bacterium Leptotrichia shahii that could tinker with RNA. The RNA­ cutting enzyme is called C2c2, he and colleagues reported August 5 in Ciencias. Like Cas9, C2c2 uses a guide RNA to lead the way, but instead of slicing DNA, it chops RNA.

Zhang’s team is exploring other CRISPR/Cas9-style enzymes that could help them “edit or modulate or interact with a genome more efficiently or more effectively,” he says. “Our search is not done yet.”

The explosion of new ways to use CRISPR hasn’t ended. “The field is advancing so rapidly,” says Zhang. “Just looking at how far we have come in the last three and a half years, I think what we’ll see coming in the next few years will just be amazing.”

This article appears in the September 3, 2016, issue of Noticias de ciencia with the headline, “CRISPR gets a makeover: The gene-editing tool does one thing well, but that’s just the beginning.”

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A version of this article appears in the September 3, 2016 issue of Noticias de ciencia.

Citas

H. Yin et al. La edición del genoma con Cas9 en ratones adultos corrige una mutación y un fenotipo de la enfermedad. Nature Biotechnology. Vol. 32, June 2014, published online March 30, 2014, p. 551. doi:10.1038/nbt.2884.

C. Long et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Ciencias. Vol. 351, January 22, 2016, published online December 31, 2015, p. 400. doi: 10.1126/science.aad5725.

C. E. Nelson et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Ciencias. Vol. 351, January 22, 2016, published online December 31, 2015, p. 403. doi: 10.1126/science.aad5143.

M. Tabebordbar et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Ciencias. Vol. 351, January 22, 2016, published online December 31, 2015, p. 407. doi: 10.1126/science.aad5177.

D. Paquet et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Naturaleza. Vol. 533, May 5, 2016, published online April 27, 2016, p. 125. doi:10.1038/nature17664.

D. A. Nelles et al. Programmable RNA tracking in live cells with CRISPR/Cas9. Celda. Vol. 165, April 7, 2016, p. 488. doi: 10.1016/j.cell.2016.02.054.

S. Wang et al. An RNA-aptamer-based two-color CRISPR labeling system. Informes científicos. Vol. 6, May 27, 2016, p. 26857. doi: 10.1038/srep26857.

I. B. Hilton et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology. Vol. 33, May 2015, published online April 6, 2015, p. 510. doi:10.1038/nbt.3199.

C. J. Braun et al. Versatile in vivo regulation of tumor phenotypes by dCas9-mediated transcriptional perturbation. procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias. Vol. 113, July 5, 2016, p. E3892, published online June 20, 2016. doi: 10.1073/pnas.1600582113.

A. C. Komor et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Naturaleza. Vol. 533, May 19, 2016, published online April 20, 2016, p. 420. doi:10.1038/nature17946.

H. Ma et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nature Biotechnology. Vol. 34, May 2016, p. 528, published online April 18, 2016. doi:10.1038/nbt.3526.


Understanding genome editing

Modifying a DNA sequence in a targeted way

Genome editing consists of modifying a cell’s genome with great precision. It is possible to deactivate a gene, introduce a targeted mutation, correct a specific mutation or insert a new gene. This genetic engineering technique uses modified nucleases, known as molecular scissors.

These nucleases cut the DNA at a predefined location in the genome, depending on its sequence. A system of natural DNA repair, known as non-homologous end-joining (NHEJ), is then activated in order to "reattach" the two free extremities generated by the cut. But this system introduces errors, leading to the mutation of the gene targeted by the nuclease. In this case, the mutation introduced is therefore random.

It is also possible to modify the targeted sequence according to one’s requirements. This requires delivering to the cell, in addition to the nucleases, a strand of DNA which presents the desired sequence, flanked by ends which are homologous to those of the site of the cut. Another cellular repair system (homologous recombination) then comes into play, "incorporating" the DNA sequence supplied at the time of the repair, leading to its definitive insertion into the genome.

Base editing: genome editing without DNA cutting

Recently, Cas nucleases have been transformed so that they no longer cut the recognized genome site: the nuclease serves as an anchor point for the transport of other proteins capable of transforming one DNA base into another, thereby inducing a targeted mutation without cutting. This technique, called base editing, could prove to be particularly interesting in cells in which the natural repair processes of DNA breaks are inefficient, rendering traditional genome editing (with double-stranded cutting) ineffective.

These various techniques work in all cell types: human, animal, plant, bacterial, adult or embryonic.

Various types of molecular scissors available

The nucleases used in genome editing are all derived from natural bacterial systems. These so-called restriction enzymes are capable of cutting double-stranded DNA at specific locations. These enzymes are modified in the laboratory in order to recognize and cut the required sequences in the DNA.

Meganucleases

These proteins are extremely specific restriction enzymes, capable of recognizing and cleaving a DNA sequence by assembling themselves in pairs of identical subunits (homodimers). Since their natural repertoire is limited, it is necessary to engineer new meganucleases in order to target a specific site within a genome. As a result, this approach is difficult and reserved for specialists of this system. Their use is very limited.

Zinc-finger nucleases

These artificial proteins are comprised of so-called zinc-finger peptides, which recognize a DNA sequence, and a nuclease (Fok1), which cuts the DNA. Each zinc-finger peptide recognizes a short sequence of three nucleotides and assembling several of these makes it possible to target longer sequences, in a more specific way. Furthermore, in order to cut, zinc-finger nucleases act in pairs on two sites close to each other. This enables the catalytic action of the Fok1 enzymes. Therefore, a genome modification requires two zinc-finger nucleases, whose construction and assembly are very complex. This restricts their use.

Zinc-finger nucleases, based on a figure by Addgene (www.addgene.org)

TALENs

TALENs (transcription activator like-effectors) are also used in pairs, targeting two close DNA sequences. They comprise a DNA binding domain made up of a combination of four peptides, each of these peptides specifically recognizing one of the four bases of the DNA. By acting on the linkage of these peptides, it is possible to target a specific DNA sequence. This binding domain is associated with a Fok1 nuclease which ensures double-strand cutting.

As with zinc-finger nucleases, protein engineering is necessary to construct and assemble the TALENs intended for genome editing. Computer programs such as E-Talen facilitate this task and a library of TALENs capable of recognizing more than 18,700 genes is available. TALENs are easier to produce than zinc-finger nucleases and offer very good efficacy.

TALEN nucleases, based on a figure by Addgene (www.addgene.org)

CRISPR-Cas

This time it is a guide RNA (CRISPR, which stands for clustered regularly interspaced short palindromic repeats) and not a protein which recognizes the target sequence to be cut. It is associated with a Cas nuclease, generally Cas9, which cuts the DNA at this precise location.

Available since 2012, the simplicity of the CRISPR-Cas9 system has revolutionized genome editing. Scientists now use it daily in all areas of research: medicine, agronomy, environment, etc. Producing guide RNA is infinitely easier than producing proteins. It is also a lot faster (requiring a few days as opposed to a few weeks or months for the production of zinc-finger nucleases or TALENs) and a lot less costly.

Barely three months after this tool was developed, several laboratories were already publishing results obtained with this technique, confirming its potential. Five years later, several thousands of research articles - concerning basic or applied research, conducted in countless species, targeting all sorts of applications - had been published.

Use in all domains of life and particularly in biomedical research

Genome editing is used in various domains: agri-food to produce improved species (for example, sheep and veal with increased muscle mass in South America), agronomy (for example, with the genetic modification of invasive plant species, to restrict their growth) and, of course, health. And this is taking place at all levels of research: fundamental, applied and clinical. However, this research is all still very much at the experimental stage.

To produce animal models

Genome editing enables the development of new animal models (sheep, cows, ferrets, rabbits, pigs, etc.) by modifying the genetic heritage of embryos using the CRISPR-Cas9 system before transferring them to the females. In this way, the researchers can have at their disposal unlimited and varied animal models suitable for the study of development, diseases or for use in therapeutic trials.

Two genetically modified macaque monkeys were, for example, born in 2014 following the introduction of mutations in two different genes, one involved in metabolism and the other in immunity. These births have proven that it is possible to obtain genetically modified non-human primates for the study of diseases. Up until then, this type of research was more or less only possible with mice, drosophila and zebrafish.

To produce cell models

In addition to animal models, it is possible to produce tailor made cell culture models. Up until then, the study of rare diseases was notably limited by the difficulty of having homozygous cells for a rare recessive mutation. Now it is possible to create these mutations from healthy cells or to deactivate one of the alleles in heterozygous individuals for this rare mutation.

To treat using gene therapy

By making it possible to introduce a healthy gene or to correct a mutation in the cells of a patient, genome editing paves the way for potential gene therapies. But it faces the same difficulties as the other gene therapy techniques, particularly in regard to the vectorization of the therapeutic DNA and the nucleases (the step which consists of incorporating this material into the cells to be treated).

Several possibilities are available for researchers for an ex vivo procedure (the cells to be treated are taken from the patient, modified in the laboratory and then re-administered). The Cas nuclease can be delivered in various forms (DNA, RNA or protein) with the guide RNA, and several delivery methods are possible, such as the application of an electrical field (electroporation) or the use of chemical vectors which increase the permeability of the cell membranes. Nevertheless, the viral vectors remain highly efficient, particularly the lentiviruses and adenoviruses for tests conducted en vivo.


Regulatory Concepts and Concerns

Although several European authorities proposed ways, how to handle and interpret new plant breeding technologies in the current or an updated European legal framework (e.g., Advisory Committee on Releases to the Environment [ACRE], 2013 Swedish Board of Agriculture [SBA], 2015 Commissie Genetische Modificatie [COGEM], 2017 Federal office for consumer protection and food safety [BVL], 2017) the European court of justice (ECJ) decided fairly unscientifically on July 25th this year, that plant products derived from Genome Editing processes (other than modified by chemical or physical mutagenesis) fall under the strict regulatory framework applied for GMOs (ECLI:EU:C:2018:583) 1 . The judgment triggered strong displeasure in the European scientific community, who forecasts noticeable economic disadvantages for European plant- and seed industry (European Plant Science Organization [EPSO], 2018 European Seed association [ESA], 2018 Vlaamsche Institute Biologie [VIB], 2018). Additionally, also the Scientific advise mechanism of the European commission published a statement on the ruling in which they recall the product-based aspects of the European gene technology law and recommend “revising the existing GMO Directive to reflect current knowledge and scientific evidence, in particular on gene editing and established techniques of genetic modification” (The Scientific Advice Mechanism [SAM], 2018). Due to the ruling European plant breeders need to undergo expensive and time-consuming approval procedures before their products improved by GEENs can be placed on the market. In particular, for DNA-free Genome Editing approaches, this regulation is intangible due to the lacking difference to a conventionally bred plant, as no DNA from non-related crops or organisms is introduced into the plant genome and detectable, neither in the final plant product, nor in its progenies. At no time-point during generation process, the plant genome encounters foreign, recombinant DNA, which usually triggers current European GMO-regulations. The genome edits are usually indistinguishable from natural mutations (Cao et al., 2011). In addition, off-targets play a minor role in DNA-free approaches: compared with stable and transient expression, GEENs are degraded within hours and thus the GEEN’s mode of action is only present in the original cells (protoplasts) of the edited plant (Liang et al., 2015). However, as long Europe sets its focus on the generation process during approval of new plant products, also DNA-free genome edited plants will fall within the same scrutiny as the few legal GMO-plants grown in Europe. This could lead to potential trade issues and impede innovation as stated by members of the WTO lately (World trade organization [WTO], 2018).

Notwithstanding, several countries started to update their legal interpretation of GEEN. Among them are the South-American ABC: Argentina, Brazil, Chile - the United States, Canada and Israel while in Japan and Australia new regulations and a possible exemption of Genome Editing approaches from strict rulings adopted for conventional genetically modified plants are still under discussion. Giving rise to a worldwide regulatory patchwork for genome-edited plants with a diverse set of interpretations and definitions for genome-edited plants resulting in reservations between international trade partners and trade restraints between economic regions. International harmonization of regulations and definitions thus is essential to close the risk-benefit gap between precaution and innovation potential of genome edited plants (Duensing et al., 2018). Argentina pioneered with a straightforward regulation for the new Genome Editing technologies already in 2015, 2 years after the first application of CRISPR in plants. The Resolución 173/2015 2 defines a case-by-case dependent approach, in which applicants can request the responsive authority CONABIA already during product development to determine if their products will fall under GMO regulation. Following the Cartagena protocol definitions for living modified organisms this is only the case when the new plant product contains a -novel- combination of genetic material – similar to conventional transgenic approaches when a transgene is permanently detectable in the final plant product. In case of SDN-1 (NHEJ based deletion/change of a few, often less than 20 nucleotides (Lusser et al., 2011) DNA-free Genome Editing approaches act without introducing foreign DNA that would be detectable in the final plant product. SDN-2 approaches (HDR based replacement of usually less than 20 nucleotides) using a short repair DNA sequence as template, are accordingly not completely DNA-free, although in the final plant product the template is not traceable anymore. In Argentina, plant products derived from GEENs thus will become less strictly regulated than classical GMOs. Likewise, similar guidelines are expectable in Brazil and Chile, which subsequently introduced similar case-by-case, mainly product-focused regulations. Brazil for example interprets GEENs explicitly as SDN as one of several “new precision breeding innovation technologies,” which may create a product not considered a GMO in the annex I of the normative resolution no. 16/2018 3 . Recently, together with the former mentioned ABC, also Paraguay and Uruguay declared their intention to harmonize their Genome Editing-friendly regulations and to establish genome-edited plants analogous to conventionally bred plants 4 . This initiative will transform South America into a hot spot for further Genome Editing innovations. Plant products derived by GEENs still lack on the market in these countries, but it is commendable that more and more countries worldwide clarify their legal status to pave the way for the next green revolution.



Comentarios:

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