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¿Se puede determinar la estructura de la proteína por difracción de rayos X en una sola imagen?

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Estoy leyendo sobre el uso de la cristalografía de rayos X para determinar la estructura de las proteínas. Según mi libro, los datos se recopilan en ángulos de 30 a 360 (dependiendo de la simetría de la proteína). Se ofrece una ilustración con anillos concéntricos etiquetados con distancias: cuanto más alejados estén los puntos, mayor será la resolución.

¿Es la imagen un compuesto (donde el ángulo del punto desde el centro es equivalente al ángulo de la lectura) o se toma una imagen separada en cada ángulo? ¿Existen otras razones por las que se necesitarían más imágenes?

Gracias.


No se puede resolver una estructura con un solo cuadro, incluso con una difracción perfecta.

La razón por la que necesita imágenes en una gran franja de ángulos es porque el patrón de difracción también está en tres dimensiones, en el llamado "espacio recíproco". Como mínimo, se necesita una rotación de 180 ° del cristal para barrer toda la esfera espacial recíproca con el plano de detección, aunque la simetría en la estructura cristalina puede reducir esto aún más (algunas de mis proteínas solo requieren 90 °, creo que las celdas unitarias hexagonales con simetría de 6 pliegues puede vivir con 30 °). Debido a que los cristales son cosas reales (léase: no ideales, doblemente para los cristales de proteínas), el barrido se extiende para ganar algo de redundancia.


Probablemente no. Si bien se pueden obtener excelentes datos de difracción de un cristal de alta calidad, sería extremadamente difícil resolver el problema de la fase. Los ángulos adicionales ayudarán a restringir las soluciones.


No analizando una sola proteína. Hay trabajo con láseres de rayos X.

Tienes que tomar una imagen simultánea de millones de proteínas y usarla para obtener una estructura. No es el mejor momento. La gente también está haciendo esto con haces de electrones en microscopios electrónicos.

Estos métodos reconstruirán modelos 3D de las moléculas, a veces en estados que no se pueden obtener de la cristalografía. Algunos ejemplos son la estructura del complejo de poros nucleares de muchos megadalton y la fibra de f-actina. El estudio clásico es el modelo 3D de bacteriorrodopsina, la primera estructura de proteína de membrana que estaba en resolución molecular (aunque se trataba de una muestra cristalina).

Si bien, en principio, suena mucho más simple: obtenga una muestra pura de su proteína, o compleja, congélela y aplíquela con una radiografía o un haz de electrones, es mucho más trabajo reconstruir la imagen y puede llevar tanto tiempo o más que obteniendo una estructura de rayos X. La resolución también suele ser pobre, ya que el cristal reforzará la coherencia, es decir, todas las proteínas están alineadas de la misma manera y tienen casi la misma forma 3D en un cristal.


¿Se puede determinar la estructura de la proteína por difracción de rayos X en una sola imagen?

Si. Usando una técnica llamada difracción de Laue, es posible obtener datos suficientes de una sola imagen para resolver una estructura cristalina de proteína. Un ejemplo es el estudio de resolución temporal de la disociación de carbonomonoximioglobina por fotólisis (DOI: 10.1107 / S090904959501661X). Ésta no es la técnica estándar de longitud de onda única que se utiliza habitualmente, pero utiliza rayos X "blancos" con un rango de longitudes de onda disponibles sólo en haces de sincrotrón. Por ejemplo, la instalación de usuario de BioCARS proporciona infraestructura para cristalografía resuelta en el tiempo. También se utiliza en "difracción antes de la destrucción" cuando se trabaja con láseres de electrones libres, véase, por ejemplo, Nature Methods 8, página 283 (2011).

El resto de la respuesta se refiere a la cristalografía convencional de longitud de onda única.

¿Es la imagen un compuesto (donde el ángulo del punto desde el centro es equivalente al ángulo de la lectura) o es una imagen separada tomada en cada ángulo?

La información estructural deseada (densidad de electrones 3D en el espacio real) es una transformada de Fourier de los datos de difracción (espacio recíproco 3D). La palabra "imagen" es una jerga para una sola imagen de difracción, es decir, los puntos de difracción que observa cuando apunta un haz de rayos X a un cristal en una determinada orientación. Con una orientación diferente, obtiene más datos (y también mide algunos puntos varias veces).

¿Existen otras razones por las que se necesitarían más imágenes?

Cuantas más imágenes de difracción se recopilen, mayor será la integridad y la redundancia de los datos. La integridad se refiere a haber medido cada punto de difracción al menos una vez. La redundancia se refiere a la frecuencia con la que se midió un punto en promedio, y el aumento de la redundancia aumenta la calidad de la medición a través del promedio.


¿Se puede determinar la estructura de la proteína por difracción de rayos X en una sola imagen? - biología

Instantánea de datos experimentales

Validación de wwPDB& nbsp & nbspInforme 3D & nbspInforme completo

La primera estructura cristalina de proteína determinada a partir de datos de difracción de rayos X en polvo de alta resolución: una variante del complejo de zinc-insulina humana T3R3 producido por trituración.

(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr & nbsp56: 1549-1553

  • PubMed: & nbsp11092920 & nbsp Buscar en PubMed
  • DOI: & nbsp10.1107 / s0907444900013901
  • Cita principal de estructuras relacionadas: & nbsp
    1FU2, 1FUB
  • Resumen de PubMed: & nbsp

El análisis de difracción de rayos X de la estructura de la proteína a menudo está limitado por la disponibilidad de cristales adecuados. Sin embargo, la ausencia de monocristales no tiene por qué presentar un obstáculo insuperable en la cristalografía de proteínas, como tampoco lo hace en la ciencia de los materiales, donde las técnicas de difracción de polvo se han desarrollado hasta el punto en que el óxido complejo, la zeolita y las pequeñas estructuras moleculares orgánicas a menudo se pueden resolver a partir del polvo. datos solos.

El análisis de difracción de rayos X de la estructura de la proteína a menudo está limitado por la disponibilidad de cristales adecuados. Sin embargo, la ausencia de monocristales no tiene por qué presentar un obstáculo insuperable en la cristalografía de proteínas, como tampoco lo hace en la ciencia de los materiales, donde las técnicas de difracción de polvo se han desarrollado hasta el punto en que el óxido complejo, la zeolita y las pequeñas estructuras moleculares orgánicas a menudo se pueden resolver a partir del polvo. datos solos. Aquí, ese hecho se demuestra con la solución de estructura y el refinamiento de una nueva variante del complejo de insulina humana T (3) R (3) Zn producido por trituración mecánica de una muestra policristalina. Se utilizaron datos de difracción de polvo de rayos X de sincrotrón de alta resolución para resolver esta estructura cristalina mediante reemplazo molecular adaptado para el refinamiento de Rietveld. Se logró un refinamiento completo de Rietveld de la proteína de 1630 átomos combinando 7981 restricciones estereoquímicas con un patrón de difracción de polvo de 4800 pasos (d (min) = 3.24 A) y se obtuvieron los residuos R (wp) = 3.73%, R (p) = 2,84%, R (F) (2) = 8,25%. Se determinó que el cambio de fase inducido por la molienda va acompañado de rotaciones de 9,5 y 17,2 grados de los dos complejos T (3) R (3) que componen la estructura cristalina. El material se revierte durante 2-3 d para recuperar la estructura cristalina original de T (3) R (3). Un refinamiento de Rietveld de esta proteína de 815 átomos mediante la combinación de 3886 restricciones estereoquímicas con un patrón de difracción de polvo de 6000 pasos (d (min) = 3.06 A) produjo los residuos R (wp) = 3.46%, R (p) = 2.64%, R (F) (2) = 7,10%. La capacidad demostrada para resolver y refinar una estructura de cristal de proteína a partir de datos de difracción de polvo sugiere que este enfoque se puede emplear, por ejemplo, para examinar cambios estructurales en una serie de derivados de proteína en los que la estructura de un miembro se conoce a partir de un monocristal. estudio.


Artículo de Investigación Original

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  • 6 División de Biología Estructural, Centro Wellcome de Genética Humana, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido
  • 7 Departamento de Biología Estructural, Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Estados Unidos

MicroED ha surgido recientemente como un método poderoso para el análisis de estructuras biológicas a resolución atómica. Esta técnica se ha limitado en gran medida a los nanocristales de proteínas que crecen como agujas o placas que miden solo unos pocos cientos de nanómetros de espesor. Además, el procesamiento de datos microED tradicional utiliza un software de cristalografía de rayos X establecido que no está optimizado para manejar efectos compuestos que son exclusivos de los datos de difracción de electrones. A continuación, presentamos un flujo de trabajo integrado para microED, desde la preparación de muestras mediante molienda por haz de iones crioenfocado, pasando por la recopilación de datos con un detector Ceta-D estándar, hasta el procesamiento de datos utilizando el paquete de software DIALS, lo que permite la determinación rutinaria de la estructura atómica de los cristales de proteína. de cualquier tamaño y forma utilizando microED. Demostramos la eficacia del flujo de trabajo determinando la estructura de la proteinasa K a una resolución de 2,0 & # x00C5 y mostramos la ventaja de utilizar laminillas de cristal de proteínas sobre los nanocristales.


La forma de una proteína se especifica por su secuencia de aminoácidos

Recuerde del Capítulo 2 que hay 20 tipos de aminoácidos en las proteínas, cada uno con diferentes propiedades químicas. Una molécula de proteína está formada por una cadena larga de estos aminoácidos, cada uno unido a su vecino a través de un enlace peptídico covalente (Figura 3-1). Por lo tanto, las proteínas también se conocen como polipéptidos. Cada tipo de proteína tiene una secuencia única de aminoácidos, exactamente la misma de una molécula a la siguiente. Se conocen muchos miles de proteínas diferentes, cada una con su propia secuencia de aminoácidos particular.

Figura 3-1

Un enlace peptídico. Este enlace covalente se forma cuando el átomo de carbono del grupo carboxilo de un aminoácido comparte electrones con el átomo de nitrógeno. (azul) del grupo amino de un segundo aminoácido. Como se indicó, una molécula de agua se pierde en esta condensación (más.)

La secuencia repetida de átomos a lo largo del núcleo de la cadena polipeptídica se denomina estructura polipeptídica. Unidas a esta cadena repetitiva están las porciones de los aminoácidos que no participan en la formación de un enlace peptídico y que dan a cada aminoácido sus propiedades únicas: las 20 cadenas laterales de aminoácidos diferentes (Figura 3-2). Algunas de estas cadenas laterales son no polares e hidrófobas (& # x0201c-temerosas del agua & # x0201d), otras tienen carga negativa o positiva, algunas son reactivas, etc. Sus estructuras atómicas se presentan en el Panel 3-1, y en la Figura 3-3 se proporciona una lista breve con abreviaturas.

Figura 3-2

Los componentes estructurales de una proteína. Una proteína consta de una estructura polipeptídica con cadenas laterales unidas. Cada tipo de proteína difiere en su secuencia y número de aminoácidos, por lo tanto, es la secuencia de las cadenas laterales químicamente diferentes (más.)

Panel 3-1

Los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas.

Figura 3-3

Los 20 aminoácidos que se encuentran en las proteínas. Se enumeran las abreviaturas de tres y una letra. Como se muestra, hay el mismo número de cadenas laterales polares y no polares. Para conocer sus estructuras atómicas, consulte el Panel 3-1 (págs. 132 & # x02013133).

Como se discutió en el Capítulo 2, los átomos se comportan casi como si fueran esferas duras con un radio definido (su radio de van der Waals). El requisito de que no se superpongan dos átomos limita en gran medida los posibles ángulos de enlace en una cadena polipeptídica (figura 3-4). Esta restricción y otras interacciones estéricas restringen severamente la variedad de arreglos tridimensionales de átomos (o conformaciones) que son posibles. Sin embargo, una cadena larga y flexible, como una proteína, todavía puede plegarse de muchas formas.

Figura 3-4

Limitaciones estéricas de los ángulos de enlace en una cadena polipeptídica. (A) Cada aminoácido aporta tres enlaces (rojo) a la columna vertebral de la cadena. El enlace peptídico es plano (sombreado gris) y no permite la rotación. Por el contrario, la rotación puede ocurrir sobre (más.)

Sin embargo, el plegamiento de una cadena proteica se ve aún más limitado por muchos conjuntos diferentes de enlaces no covalentes que se forman entre una parte de la cadena y otra. Estos involucran átomos en la estructura polipeptídica, así como átomos en las cadenas laterales de aminoácidos. Los enlaces débiles son de tres tipos: enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, y atracciones de van der Waals, como se explica en el Capítulo 2 (ver p. 57). Los enlaces no covalentes individuales son 30 & # x02013300 veces más débiles que los enlaces covalentes típicos que crean moléculas biológicas. Pero muchos enlaces débiles pueden actuar en paralelo para mantener juntas dos regiones de una cadena polipeptídica. Por lo tanto, la estabilidad de cada forma plegada está determinada por la fuerza combinada de un gran número de tales enlaces no covalentes (Figura 3-5).

Figura 3-5

Tres tipos de enlaces no covalentes que ayudan a las proteínas a plegarse. Aunque uno solo de estos enlaces es bastante débil, muchos de ellos a menudo se forman juntos para crear un arreglo de enlace fuerte, como en el ejemplo que se muestra. Como en la figura anterior, R se usa como un general (más.)

Una cuarta fuerza débil también tiene un papel central en la determinación de la forma de una proteína. Como se describió en el Capítulo 2, las moléculas hidrófobas, incluidas las cadenas laterales no polares de aminoácidos particulares, tienden a ser forzadas juntas en un ambiente acuoso para minimizar su efecto disruptivo en la red de moléculas de agua con enlaces de hidrógeno (ver pág. Panel 2-2, págs.112 & # x02013113). Por tanto, un factor importante que gobierna el plegamiento de cualquier proteína es la distribución de sus aminoácidos polares y apolares. Las cadenas laterales no polares (hidrófobas) de una proteína, que pertenecen a aminoácidos como fenilalanina, leucina, valina y triptófano, tienden a agruparse en el interior de la molécula (al igual que las gotas de aceite hidrófobo se fusionan en el agua para formar una gota grande). . Esto les permite evitar el contacto con el agua que los rodea dentro de una celda. Por el contrario, las cadenas laterales polares, como las que pertenecen a la arginina, la glutamina y la histidina, tienden a organizarse cerca del exterior de la molécula, donde pueden formar enlaces de hidrógeno con el agua y con otras moléculas polares (figura 3-6). Cuando los aminoácidos polares están enterrados dentro de la proteína, generalmente están unidos por enlaces de hidrógeno a otros aminoácidos polares o al esqueleto polipeptídico (Figura 3-7).

Figura 3-6

Cómo una proteína se pliega en una conformación compacta. Las cadenas laterales de los aminoácidos polares tienden a acumularse en el exterior de la proteína, donde pueden interactuar con el agua; las cadenas laterales de los aminoácidos no polares están enterradas en el interior para formar una estructura hidrófoba muy compacta (más.)

Figura 3-7

Enlaces de hidrógeno en una molécula de proteína. Se forman un gran número de enlaces de hidrógeno entre las regiones adyacentes de la cadena polipeptídica plegada y ayudan a estabilizar su forma tridimensional. La proteína representada es una parte de la enzima lisozima y el hidrógeno (más).


¿Se puede determinar la estructura de la proteína por difracción de rayos X en una sola imagen? - biología

1 Solo como ejemplo: suponiendo una celda unitaria con 100 & # 8197 & # 197 ejes en un cristal de proteína bien ordenado, y una distancia mínima preferida de cinco píxeles entre picos de Bragg adyacentes, la resolución máxima alcanzable para un solo quad es aproximadamente 3,5 & # 8197 & # 197 si el haz directo está centrado en el detector. Para el mismo cristal, colocar en mosaico cuatro quads como se presenta aquí aumentaría la resolución máxima a la que los puntos de Bragg pueden identificarse más allá de 1.0 & # 8197 & # 197, nuevamente asumiendo un haz directo central.

Agradecimientos

Agradecemos a Wolfgang Kabsch por un programa para corregir las distorsiones elípticas y por las discusiones sobre el procesamiento de datos. Agradecemos a Kay Diederichs y Sven Hovm & # 246ller por las discusiones sobre el procesamiento de datos. Agradecemos a Henning Stahlberg y Kenneth Goldie por el apoyo y las discusiones. Agradecemos a Rishi Matadeen, Sacha de Carlo, Thorsten Blum e Igor Nederlof por su ayuda con la preparación de muestras y la adquisición de datos. Agradecemos a Robbie Joosten y Garib Murshudov por las discusiones sobre el refinamiento del modelo. Agradecemos a ASI (Amsterdam Scientific Instruments) por su apoyo con detectores, lectura y software. Agradecemos a Jan Visser y Bas van der Heijden (NIKHEF, Amsterdam) por el soporte, el diseño y las pruebas iniciales.

Referencias

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Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia Creative Commons Attribution (CC-BY), que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se citen los autores originales y la fuente.


La biología estructural incorpora técnicas y principios de biología molecular, bioquímica y biofísica como un medio para dilucidar la estructura molecular y la dinámica de moléculas biológicamente relevantes. Los avances recientes en la instrumentación han respaldado un nuevo impulso en la biología estructural, ya que ahora se pueden analizar moléculas biológicas complejas con una facilidad y eficiencia sin precedentes. La estructura tridimensional de las proteínas y los complejos de proteínas proporcionan una gran comprensión de las leyes de las actividades de la vida y el mecanismo de las enfermedades, lo que permite el diseño racional de nuevos agentes terapéuticos y de diagnóstico. Existen tres técnicas principales de investigación para la biología estructural: difracción de rayos X de cristal único (SC-XRD), resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica (Cryo-EM). Sin embargo, no existe un método "para todo uso", ya que los tres ofrecen ventajas y limitaciones únicas.

Figura 1. Tres técnicas principales de investigación para la biología estructural. Según las estadísticas de PDB (https://www.rcsb.org/), más de 120.000 estructuras de proteínas resueltas por SC-XRD, representan casi el 90% del total. Y hay alrededor de 12.000 estructuras de proteínas obtenidas por RMN. Aunque el número total de estructuras proteicas resueltas por Cryo-EM no es comparable al de las dos primeras técnicas, el crecimiento explosivo de estructuras de esta técnica es notable en los últimos años.

La cristalografía de rayos X utiliza rayos X para determinar la posición y disposición de los átomos en un cristal. El método más clásico de cristalografía de rayos X es la difracción de rayos X de cristal único, en la que los átomos de cristal hacen que el haz de rayos X incidente produzca haces dispersos. Cuando los rayos dispersos aterrizan en el detector, estos rayos producen un patrón de difracción de puntos. A medida que el cristal gira gradualmente, se puede medir el ángulo y la intensidad de estos haces difractados y luego se genera una imagen tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal. Con base en esta densidad de electrones, se puede determinar la posición promedio de los átomos en el cristal, los enlaces químicos, las barreras de cristal y diversa información. Para un monocristal con suficiente pureza, homogeneidad y regularidad, los datos de difracción de rayos X pueden determinar el ángulo y la longitud de enlace químico promedio dentro de unas pocas décimas de grado y unas pocas milésimas de angstrom, respectivamente.

Figura 2. Los principios físicos y matemáticos de la cristalografía de rayos X para resolver una estructura.

La técnica de difracción de rayos X monocristalino fue propuesta y desarrollada en 1912, y se ha convertido en la herramienta más importante y útil para determinar la estructura de la proteína, ya que la estructura de la proteína de la mioglobina se determinó por primera vez en 1958. Hoy en día, más de 140.000 estructuras de proteínas han se han depositado en el banco de datos de proteínas (https://www.rcsb.org/), casi el 90% de las cuales se resuelven mediante la técnica de difracción de rayos X de cristal único, lo que sugiere sus ventajas en el estudio de la estructura de los cristales de macromoléculas biológicas.

El proceso de la técnica de difracción de rayos X monocristalino se puede dividir aproximadamente en cuatro pasos. El primer paso es obtener monocristales de alta calidad de la proteína objetivo, lo que se denomina cristalización de proteínas. Cuando la solución de la proteína solubilizada alcanza la sobresaturación, promueve la agregación y nucleación de proteínas. En última instancia, las moléculas de proteínas individuales se organizan en una serie repetida de células unitarias adoptando una orientación uniforme. Los cristales calificados deben tener un tamaño suficiente (normalmente mayor de 50 μm en todas las dimensiones) y calidad (estructura regular, sin grietas ni gemelos). La obtención de monocristales de alta calidad es el paso límite para resolver una estructura con este método.

Después de obtener un monocristal, se requiere un experimento de difracción. El cristal se inmoviliza en un haz de rayos X intenso, produciendo un patrón de difracción, que se registra como los datos de difracción (ángulo e intensidad de los rayos X difractados). A medida que el cristal gira gradualmente, los reflejos anteriores desaparecen y surgen nuevos reflejos. La intensidad de difracción en cada punto se registra desde cada dirección del cristal.

Posteriormente, los datos de difracción obtenidos del patrón de difracción se combinan con varios métodos de análisis estructural y ajuste de datos para analizar la distribución de la densidad de electrones en el espacio tridimensional dentro de la celda unitaria.

In the last step, based on the electron density map, a model of atomic arrangement in the crystal can be produced and refined.

Fig.3. The process of single crystal X-ray diffraction technique

This method may yield high atomic resolution and is not limited by the molecular weight of the sample. It is suitable for water-soluble proteins, membrane proteins as well as macromolecular complexes. When manipulated properly, it becomes a powerful tool to deliver reliable structural data of biological macromolecules and determine the position and structure of the active center, and helps understand how the protein recognizes and binds ligand molecules at the atomic level.

However, the single crystal X-ray diffraction method also has several disadvantages. First, the sample must be crystallizable, but crystallization of biological macromolecules with large molecular weight can be difficult, particularly, membrane proteins are more challenging to crystallize because of its large size and poor solubilization. Second, an organized single crystal must be obtained to allow appropriate diffraction. Finally, the obtained three-dimensional structure of biological sample only represents a static form of the tested molecule (one of many possibilities), rather than a dynamic one.

The second method is nuclear magnetic resonance (NMR). Nuclei are charged, fast spinning particles, which are similar to outer electrons. The gyromagnetic ratios of different atomic nuclei are different and therefore have different resonance frequencies. The movement of the nucleus is not isolated--it interacts with the surrounding atoms both intra- and inter-molecularly. Therefore, through nuclear magnetic resonance spectroscopy, structural information of a given molecule can be obtained. Taking protein as an example, its secondary structure, such as α-helix, β-sheet, turn, circular, and curl, reflect the different arrangement of the main chain atoms of protein molecules three-dimensionally. The spacing of the atomic nuclei in different secondary domains, the interaction between nuclei, and the dynamic characteristics of polypeptide segments all directly reflect the three-dimensional structure of proteins. These nuclear features all contribute to spectroscopic behaviors of the analyzed sample, thus providing characteristic NMR signals. Interpretation of these signals by computer-aided methods leads to deciphering of the three-dimensional structure.

Fig.4. Nuclear spin

Since the first observation of condensed-state NMR signals in 1946, NMR technology has experienced a rapid development for over 70 years, and its application has been extended from the area of physics such as nuclear magnetic moment determination to chemistry, medicine, material science, life science and many others. Notably, in the 1980s, NMR technology was applied in the structural analysis of protein creatively, thus promoting the application of NMR in biological field. Although the amount of three-dimensional structure data of proteins obtained by NMR technology is not comparable to that of single crystal X-ray diffraction, the unique advantages of NMR technology have been widely noticed: NMR is able to provide information on a kinetic basis, such that the internal movement of proteins over multiple time scales and their binding mechanism to ligands can therefore be solved.

There are four main steps in an NMR experiment: sample preparation, data acquisition, spectral processing, and structural analysis. NMR analysis is performed on aqueous samples of protein with high purity, high stability, and high concentration. A sample volume ranging from 300 to 600 μL with a concentration range of 0.1-3 mM. The use of stable isotopes 15N, 13C and 2H for protein labeling can effectively increase signal intensity and resolution. Selective labeling of certain amino acids or chemical groups of proteins can greatly reduce signal overlap. Multidimensional NMR experiments are utilized to acquire information about the protein. The spectral processing is then performed to determine the atoms of the protein corresponding to each spectral peak on different NMR spectra. Finally, a series of spatially structured information such as NOE and J coupling constants are used to calculate the spatial structure using distance geometric or molecular dynamics methods.

Fig.5. The process of nuclear magnetic resonance technology

The most important feature of the NMR method is that the three-dimensional structure of macromolecules in the natural state can be measured directly in solution, and NMR may provide unique information about dynamics and intermolecular interactions. The resolution of the macromolecular three-dimensional structure can be as low as sub nanometer.

However, the NMR spectrum of biomolecules with large molecular weight is very complicated and difficult to interpret, thereby limiting the application of NMR in analyzing large biomolecules. Additionally, this technique requires relatively large amounts of pure samples (on the order of several mg) to achieve a reasonable signal to noise level.

The third approach is the cryo-electron microscopy (Cryo-EM) technique, which includes three different methods: single particle analysis, electron tomography and electron crystallography. The essential mechanism of Cryo-EM is electron scattering. The basic principle is described as follows. Samples are prepared through cryopreservation prior to analysis. The coherent electrons are used as a light source to measure the sample. After the electron beam passes through the sample and the nearby ice layer, the lens system converts the scattered signal into a magnified image recorded on the detector. And signal processing is performed to obtain the three-dimensional structure of the sample.

Electron microscopy three-dimensional reconstruction technology was first discovered in 1968. The three-dimensional structure of T4 phage tail was reconstructed by electron micrographs. And then the general concept and methods of three-dimensional reconstruction of electron microscopy were proposed. For reducing the radiation damage, cryogenic electron microscopy was created in 1974. After more than 30 years of development, Cryo-EM has become a powerful tool for studying the structure of biological macromolecules. In recent years, the Cryo-EM technology has made revolutionary progress, particularly in the single particle analysis. Since 2013, with the tremendous advances in electron detector and image processing, Cryo-EM single particle analysis has progressed so rapidly that the resolution of Cryo-EM is now comparable to single crystal X-ray diffraction. At present, Cryo-EM is becoming a powerful tool for determining high resolution structure of biological macromolecules.

Before using the Cryo-EM to observe the sample, negative staining EM can be utilized for rapid screening of homogeneous sample. The Cryo-EM single particle analysis technique begins with the sample vitrification. During this process, the protein solution is instantly cooled, so that the water molecules do not crystallize, forming an amorphous solid. The frozen sample is then screened and data is collected in the system. A series of two-dimensional images can be taken during this period. Next, based on plenty of two-dimensional images acquired, particle alignment and classification are carried out. In the end, the data is processed by reconstruction software to generate a three-dimensional structural model.

Fig.6. The process of Cryo-EM single particle analysis technique

Compared to single crystal X-ray diffraction, the rapid freeze treatment of the sample maintains its closer-to-native state. Moreover, this method requires only a small amount of sample (about 0.1 mg), is more forgiven on sample purity, and does not need the protein to crystalize.

The main defect in this technique is that the particles are detected in unknown orientations. High levels of noise, due to the use of limited electron doses to minimize radiation damage, especially at high resolution, tends to complicate the determination of these orientations, and this is particularly a concern for smaller particles. Hence, structure determination of biological macromolecules by Cryo-EM was limited to large complexes or low-resolution models over the last few years.

Fig.7. Cryo-electron microscopy

In summary, each technology has its own advantages in certain applications such that one method might be used extensively in some cases but rarely in others. Thus, understanding the nature of the analysis is the key in method selection. Not only will the inappropriate selection of method produce compromised results, it may also cause significant delays of the project, and result in financial losses. For more information, please see Table 1.


Abstracto

Single-crystal X-ray diffraction analysis was performed on a magnetically oriented microcrystal array (MOMA a composite in which microcrystals are oriented three-dimensionally in a polymer matrix) to demonstrate its potential to determine protein structure from a powder sample. Recrystallized hen egg-white lysozyme was pulverized to prepare a microcrystalline powder as a model system from which a MOMA was prepared. The microcrystalline powder was suspended in an ultraviolet (UV)-curable monomer and rotated nonuniformly in a static magnetic field (8 T), and then, the crystalline alignment was consolidated by UV light irradiation. The obtained sample was subjected to conventional single-crystal X-ray diffraction measurement. The structure determined for the MOMA was found to belong to the space group PAG212121 with unit-cell dimensions a = 51.26, B = 59.79, and C = 29.95 Å, in agreement with the structure of the single crystal from which the MOMA was prepared. The protein structure was refined at the highest resolution of 3.0 Å, which agreed with that determined with an independently grown single crystal under comparable conditions. The fabrication method presented here provides a powerful means of determining the structure of proteins that do not crystallize to sizes suitable for conventional single-crystal X-ray analyses.


Abstracto

We demonstrate that ion-beam milling of frozen, hydrated protein crystals to thin lamella preserves the crystal lattice to near-atomic resolution. This provides a vehicle for protein structure determination, bridging the crystal size gap between the nanometer scale of conventional electron diffraction and micron scale of synchrotron microfocus beamlines. The demonstration that atomic information can be retained suggests that milling could provide such detail on sections cut from vitrified cells.

Despite the explosive growth in cryoelectron microscopy (cryo-EM) following the “resolution revolution” (1), X-ray methods were responsible for nearly 20-fold as many macromolecular structure depositions as single-particle cryo-EM in 2017, and diffraction remains the favored method for genuine atomic resolution analysis. Crystal growth is often a bottleneck for such analyses, and it can sometimes be difficult to grow crystals of sufficient size for analysis at conventional synchrotron macromolecular crystallography (sMX) beamlines. This has led to the development of microfocus beamlines that can routinely analyze crystals down to ∼5 μm (2). However, it is unknown how often crystallographic analyses fail due to the failure to recognize smaller crystals. The next generation of synchrotron beamlines may reduce the size requirement to around 1 μm, and the potential for structure determination from submicron crystals has been demonstrated by application of X-ray free electron laser (XFEL) sources, which achieve a brightness ∼10 8 -fold greater than a typical synchrotron beamline (3). XFEL sources also sometimes mitigate, by achieving “diffraction before destruction,” the radiation damage problem that limits the collection of synchrotron X-ray data (4, 5).

Electron diffraction (ED) can provide high-resolution structure determination from 3D crystals (6 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –12). Electrons have potential advantages over X-rays for the analysis of very small crystals: Their interaction with matter is sufficiently strong for a measurable signal to be obtained from a typical laboratory instrument the experiment is performed in a vacuum, thereby reducing background scatter and the useful data obtained before radiation damage occurs are much greater (6, 13, 14). However, the strong interaction with matter is also a limitation for ED, since the beam is absorbed very strongly by a few hundred nanometers of crystal. Furthermore, it has often been held that kinematic theories of diffraction, upon which X-ray analysis rests, are useless for crystals of such thickness (15, 16). For protein crystals, due to the large size of the unit cell, many diffracted beams are stimulated simultaneously and, through conservation of energy, the amplitude of each is greatly reduced, mitigating the effects of multiple scattering. Although dynamical effects have been observed with thicker protein crystals (6), the utility of the kinematic theory for thin crystals is shown in our study below, where systematic absences, which would be polluted by multiple scattering, are maintained. Indeed, in recent years, the power of ED to analyze nanometer-sized crystals has been amply demonstrated (6, 12, 17) however, there remains a significant range of size, from a few hundred nanometers to a few microns, that is accessible only using XFEL radiation, which is both hard to access and extremely expensive.

Micromachining using a focused ion beam (FIB milling) has been established in physical science applications for many years (18), and, although far from routine, cryo-FIB milling is now increasingly applied in the life sciences, for instance, to create thin lamella milled from frozen, hydrated cells to reveal cellular architecture (19). Cryo-FIB milling has been shown to preserve the structure of frozen, hydrated biological samples better than mechanical cryosectioning, although how far the preservation of order extends has not been established (19).


Métodos

Expresión y purificación de proteínas

HCA II was expressed in BL21 DE3 pLysS E. coli cells that were transformed with an expression plasmid based on pET31F1 coding for protein with UniProt accession code P00918 45 . The cells were grown in shaker incubators at 180 rpm and 37 °C in LB media supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin. Once the cells reached an optical density of

1 at 600 nm, protein expression was induced with the addition of 1 mM isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) and 1 mM ZnSO4. Protein expression was allowed to continue for 3 h. At this point, the cells were harvested by centrifugation in a JLA 8.1 rotor (Beckman) at

6800 × gramo for 20 min and frozen at −20 °C. Cells were resuspended in buffer A (0.2 M Na2ASI QUE4, 100 mM Tris, pH 9.0) and lysed by addition of lysozyme while stirring in the cold room for 3–4 h. The cell lysate was centrifuged in a JA-25.50 rotor (Beckman) at

18,000 × gramo for 60 min at 4 °C, and the supernatant containing the soluble cellular fraction was loaded onto affinity resin (paraca-aminomethylbenzensulfonamide, Sigma Aldrich A0796). Unbound protein and nucleic acids were removed by repeated wash steps with buffer A, followed by buffer B (0.2 M Na2ASI QUE4, 100 mM Tris, pH 7.0). Bound HCA II was eluted with 50 mM Tris, pH 7.8, and 0.4 M NaN3. The eluted protein was concentrated with Amicon Ultra concentration devices (10 kDa molecular weight cutoff), purified, and buffer-exchanged by size-exclusion chromatography on HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Life Sciences) in 50 mM Tris, pH 8.5. Fractions were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis to assess protein purity and homogeneity prior to crystallization. Eluted fractions containing HCA II were pooled and concentrated to

20 mg/ml by using Amicon Ultra Centrifugal Filter Units (Merck) with a molecular weight cutoff of 10 kDa.

Cristalización

Crystals of HCA II were grown in sitting-drop vapor-diffusion setups using microbridges (Hampton Research) and 24-well Linbro crystallization plates (Hampton Research). The drops were prepared by mixing 10 μl of protein solution (20 mg/ml) with 10 μl of precipitant solution (2.8 M (NH4)2ASI QUE4, 0.1 M Tris, pH 8.5), and were equilibrated against 1 ml of reservoir solution of the precipitant. Plates were incubated at 20 °C, and crystals appeared in 2–3 days. Crystals were harvested by crushing and repeated pipetting into 1.5 ml Eppendorf tubes to collect slurries of small crystals in mother liquor and stored at 20 °C until cryo-grid preparation.

Sample preparation

Complexes of HCA II with inhibitor AZM (Sigma Aldrich, A6011) were prepared by soaking the crystal slurries with inhibitor solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO) for 20 min, with a final concentration of 0.5 mM HCA II and 4.5 mM AZM. Grids were prepared by pipetting 3 μl on a QUANTIFOIL 1.2/1.3 (300 mesh) Cu holy carbon TEM grid. Excess liquid was removed via pressure-assisted backside blotting using Preassis 46 . The grid was vitrified manually by flash-cooling in liquid ethane. The sample was transferred to a Gatan 914 cryo-transfer holder.

Adquisición de datos

Microcrystal electron-diffraction data were collected on a JEOL JEM-2100 (LaB6 filament) TEM operated at 200 kV equipped with a Timepix hybrid pixel detector (Amsterdam Scientific Instruments). Grids were screened for suitable microcrystals in defocused diffraction mode, and diffraction data were collected from an area of 1.5 μm diameter defined by a selected-area aperture using the Instamatic software interface 40 . The effective sample-to-detector distance was 1481.74 mm. Data were collected using continuous rotation with an angular increment of 0.68° and an exposure time of 1.5 s per frame. Individual crystal datasets were typically collected over a tilt range of on average 10–30°, with an acquisition time of 22–66 s per crystal dataset. The total range of tilt angles covered during data collection from several crystals was −60 to +60°. The electron dose rate applied during data collection was approximately 0.1 e − /Å 2 /s, and the total exposure dose for each crystal dataset was within 2.0–6.0 e − /Å 2 .

Data processing

Data were integrated using XDS 47 with the Laue group constrained to 2/metro. Reflections from different crystal datasets were merged in XSCALE 47 using a weighted average of the unit-cell parameters obtained from individual crystal processing (see Supplementary Tables 1 and 2). Selection criteria for including data were based on merging statistics and correlation coefficients between individual datasets as reported by XSCALE. A cutoff value of 0.7 was used for the ligand-bound HCA II data for the native HCA II data, a cutoff of 0.6 was used. Data were truncated at approximately I/ σI ≥ 1.0 and CC1/2 ≥ 0.4 with a correlation significant at the 0.1% level 48 (see Supplementary Tables 3 and 4). Data were merged and converted into MTZ format using AIMLESS 49 .

Structure solution

A search model of the apo structure with the metal cofactor, ligands, and water removed was generated from a high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4 29 ) using Sculptor 50 . The structure was solved using maximum-likelihood molecular replacement in Phaser 36 using the MicroED reflection intensities. For both native and ligand-bound data, a well-contrasting single solution was found with LLG = 1871, TFZ = 18.6, and LLG = 2494, TFZ = 19.6, respectively.

Model building and refinements

Starting electrostatic potential maps were generated from the molecular replacement solution using rigid-body refinement in phenix.refine 51 . The starting model and maps were used for remodeling several side chains and manually placing the metal cofactor Zn 2+ using Coot 37 . After restrained reciprocal space refinement in phenix.refine, the resulting map was inspected for any difference potential, indicating the presence of the bound inhibitor. The AZM ligand was imported in Coot using the get monomer command, and we used the find ligands command to fit the ligand using the precalculated mFo–DFc difference potential map at 2.8σ.

Furthermore, upon inspection of the map, a clear blob of difference potential was observed in the solvent region, appropriate for accommodating a single DMSO molecule that was used as solvent to solubilize the ligand. The DMSO molecule was manually fitted using the get monomer command in Coot. Its position is in agreement with the neutron structure (PDB ID 4g0c) 30 where the space is occupied by three waters, and with a glycerol (GOL) solvent molecule occupying the same region in the high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4) 29 .

The HCA II:AZM model was then completed, automatically placing water molecules, and using restrained reciprocal space refinement in phenix.refine 51 . All refinement steps were preformed using a test set representing 5% of all reflections, atomic scattering factors for electrons, automatic weighting of the experimental data to stereochemistry and atomic displacement parameter terms, and group B-factor refinement per residue 51 .

Validación

The geometry of the native and ligand-bound structural models was validated using MolProbity 52 (Table 1). A simulated annealing (SA) composite omit map was calculated using phenix.composite_omit_map 51 by sequentially omitting 5% fractions of the structure. No missing reflections were filled in for map calculations. The MicroED model of the native structure shows a backbone Cα root-mean-square (r.m.s.) deviation of 0.23 Å with a structure from joint refinement against neutron and X-ray diffraction data (PBD ID 3tmj) 27 , and 0.22 Å with an X-ray structure of native HCA II (PBD ID 3ks3) 53 . The inhibitor-bound MicroED model shows a backbone Cα r.m.s. deviation of 0.29 Å with a previously determined model from joint X-ray and neutron refinement (PDB ID 4g0c 30 ), and of 0.22 Å with a high-resolution X-ray model of the same inhibitor-bound complex (PDB ID 3hs4) 29 , that was used as search model for molecular replacement. Root-mean-square deviation values between structural models were calculated by the secondary-structure matching (SSM) tool 54 .

Cifras

Figures 2–4 were prepared using the PyMOL Molecular Graphics System, version 2.2.3 Schrödinger, LLC.

Reporting summary

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.


Docking of X-Ray Crystallographic Structures Within Cryo-EM Maps

In the past decade, the most widely accepted combinatorial approach of X-ray crystallography and cryo-EM technique has been the practice of docking X-ray crystallographic atomic models into a cryo-EM map at low resolution. 5 This practice started in 1990s when crystal structures were attempted to be docked into low-resolution cryo-EM maps of icosahedral viruses or cytoskeletal helical filaments. 6 In the past two decades, several dozen docking software packages have been developed but only a few are still being actively developed today. The docking methods can be classified mainly into two categories: rigid-body docking and flexible docking. Rigid-body docking is used to find the optimal orientation and position of sub-component atomic crystallographic structures in the cryo-EM map. The most popular docking software packages include Situs, 7 EMfit, 8 and UCSF Chimera docking utility. 9 In cases where some minor conformational differences exist between the crystal structure of an individual component and its counterpart in the cryo-EM map, flexible docking algorithms, such as normal mode analysis and molecular dynamic simulation, are used by introducing conformational changes to the X-ray structure to fit into the cryo-EM map while maintaining the stereo-chemistry of the atomic models. Some flexible docking software packages include Situs, Flex-EM, 10 MDFF, 11 iMODFIT 12 and more recently Rosetta. 13

The docking can be quite useful in defining the protein location and protein–protein interface within a complex and new interaction modes that are not revealed by X-ray crystallography. If the cryo-EM density is of good enough quality, the docking can be quite precise even at lower resolution. In a recent example, the crystal structure of Ryanodine receptor 1's SPRY2 domain (∼50 kDa) was docked as a rigid body into a 10 Å resolution cryo-EM map of the entire complex (∼1.5 MDa) (Fig. 2). 14 The best scored result by the Colores program of Situs turned out to define the domain's location and orientation quite precisely to agree with the same domain in the high resolution structure of the complex in a 3.8 Å structure solved more recently by single particle cryo-EM. 15 The RMSD between the Cα atoms of the docked SPRY2 model and the high resolution atomic model of the complex was only 2.1 Angstrom. This underscores both the quality of the low-resolution cryo-EM map and the robustness of the docking algorithm.

Docking of atomic models into the 3D cryo-EM map of Ryanodine receptor 1 complex at 10 Angstrom resolution. The 3D EM map of the Ryanodine receptor 1 (EMD-5041) is shown in semi-transparent rendering in two orthogonal views. The atomic model of a ryanodine receptor monomer (grey) is docked in the map. The atomic model of SPRY2 domain docked in the map with rigid docking algorithm is shown in red color. Its equivalent domain in the atomic model of the full-length protein is shown in blue color. The atomic models of the two SPRY2 domain are in very similar orientation and location.

In our study, elucidating the architecture of yeast RNA exosome complex, docking of atomic models into low-resolution EM 3D reconstruction maps was critical for us to uncover new mechanistic insights of the complex's function. We solved a 3D reconstruction of the yeast exosome complex comprising ten subunits using single particle EM at about 18 Angstrom resolution, in which we were able to dock homologous atomic models of the nine-subunit human core complex and bacterial RNase III protein determined by X-ray crystallography. 16 This allowed us to reveal the mode of interaction between the Rrp44 subunit and the core complex. In a later study, we docked the crystal structure of RNA-bound yeast exosome 10-mer 17 into a 3D EM reconstruction of the complex in conformations induced by different lengths of RNA substrates with high fidelity. 18 Alternatively, we revealed a different conformation of the exosome bound by RNAs with short 3′-ss tails and built atomic models by docking available crystal structures of the core complex and Rrp44 separately in the 3D EM reconstruction. The two docking results allowed us to reveal distinct pathways of RNA substrate recruitment and processing within the complex. Interestingly, the most recent near-atomic-resolution structure of the apo-exosome complex (PDBID: 5G06) 19 verified the interfaces between the subunits calculated from the previous docking models in the low-resolution cryo-EM map of the apo-exosome complex.


Protein Mapping

Mapping of the location and expression level of proteins in specific cells, tissues, and organs aids in the functional study of the proteome. Spatial distribution of proteins is key to protein function, with improper localization or expression triggering various disease states. Mapping projects such as the Human Protein Atlas provide a proteomic resource for biomarker discovery and aid in the understanding of disease pathology. Mapping of the interactome helps define the molecular interactions that occur on a cellular level, assisting in the understanding of protein function and providing valuable potential drug targets for disease.



Comentarios:

  1. Doramar

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  2. Taji

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  3. Stuart

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  4. Odakota

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