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¿Cuáles son las diferencias clave en los procesos de preparación de vesículas unilaminares gigantes y grandes?

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Tengo que estudiar el plegamiento de mi péptido en el mimético de la membrana (membrana modelo) mediante espectros de dicroísmo circular. Ahora estoy buscando métodos adecuados para la preparación de vesículas: LUV, SUV, GUV: vesículas unilaminares grandes, pequeñas y gigantes.

He estudiado varios métodos, pero me cuesta comprender los factores clave que afectan el tamaño de la vesícula resultante (LUV, SUV, GUV, etc.)

Cualquier sugerencia es muy apreciada.


Las vesículas unilaminares gigantes (GUV) se fabrican mediante métodos como la hidratación de la membrana de fosfolípidos generalmente mediante el uso de algún disolvente, el uso de corriente eléctrica, la combinación de vesículas pequeñas, etc.Las vesículas unilaminares grandes (LUV) se obtienen mediante métodos como la evaporación con baja concentración de fosfolípidos diálisis, etc. Las vesículas unilaminares pequeñas (SUV) se fabrican mediante métodos Inyectando solución espontáneamente, métodos microflúdicos, etc. Hay muchos métodos revisados ​​extensamente (solo busque en pubmed y obtendrá muchos de ellos)

Ahora, llegando a su pregunta, el factor que afecta los tamaños depende del método que esté utilizando. Enumeraré algunos, el resto puede verificar las referencias de cada método que mencioné anteriormente. La mayoría de las veces, estos métodos tendrán todo tipo de vesículas. El éxito de estos métodos depende de qué método le proporcione la mayor proporción de tamaño de vesícula que desee.

  • Método microflúdico - caudal total, relación de disolvente a fase acuosa (Kastner et al 2014)
  • Método eléctrico - tasa de aplicación del campo eléctrico (Angelova y Dimitrove 1986)
  • Método de hidratación - cantidad de fosfolípidos, tasa de evaporación (Lasic 1988)

Además de todo esto, la física básica detrás de esto se explica aquí como la diferencia de energía que se muestra a continuación (Imagen tomada de (Lasic 1988))


La vida eucariota contiene arquitecturas vesiculares jerárquicas (es decir, orgánulos) que son cruciales para la producción y el tráfico de materiales, el almacenamiento y el acceso a la información, así como la producción de energía. Para realizar tareas específicas, estos compartimentos se diferencian entre sí en su composición de membrana y su carga interna y también se diferencian de la membrana celular y el citosol. Las estructuras artificiales que reproducen esta arquitectura anidada no solo ofrecen una comprensión más profunda de las funcionalidades y la evolución de la vida eucariota portadora de orgánulos, sino que también permiten la ingeniería de nuevas tecnologías biomiméticas. Aquí, mostramos la técnica de preparación de transferencia de emulsión de vesículas en agua en aceite desarrollada recientemente para dar como resultado vesículas unilaminares gigantes compartimentadas internamente por vesículas unilaminares de diferente composición de membrana y carga interna, es decir, vesículas unilaminares jerárquicas de heterogeneidad de composición controlada. Las vesículas unilaminares gigantes compartimentadas se aislaron posteriormente mediante una etapa de separación aprovechando la heterogeneidad de la composición de la membrana y la carga encapsulada. Debido al carácter controlado, eficiente y técnicamente sencillo de la nueva técnica de preparación, este estudio permite la fabricación jerárquica de vesículas unilaminares gigantes compartimentadas de heterogeneidad composicional controlada y facilitará el desarrollo de imitadores de células eucariotas que se asemejan a sus plantillas naturales, así como la Fabricación de nuevos sistemas de administración de fármacos con múltiples agentes para terapias combinadas y microrreactores artificiales complejos.

Las vesículas unilaminares gigantes (GUV), que representan compartimentos acuosos individuales de un diámetro de 1 a 100 & # x000b5m separados de un entorno acuoso por una sola bicapa de fosfolípidos, se estudian intensamente en diferentes áreas de (bio) química, física y en el campo de la síntesis de células artificiales (para una revisión reciente, ver [1]). Su estrecha analogía con las células naturales hace que las vesículas sean ideales para el análisis ascendente de procesos biológicos [2], [3]. Además, su capacidad para almacenar, transportar y proteger distintas cargas químicas, maquinarias biológicas y bioquímicas y productos de reacción, les permite servir como mini laboratorios [4] y como biorreactores espacialmente confinados [5] & # x02013 [7].

Las células eucariotas se dividen en compartimentos más pequeños (por ejemplo, núcleo, vacuolas, mitocondrias, endosomas). Estos compartimentos altamente especializados asumen numerosas y cruciales tareas (por ejemplo, producción de ácido nucleico, almacenamiento de material, producción de energía, degradación del material) y su evolución se considera uno de los eventos clave en el origen de la vida de orden superior [8]. Las GUV estructuradas internamente se propusieron no solo para lograr una semejanza más cercana con las células eucariotas naturales, sino también para futuros sistemas de administración de fármacos de múltiples agentes específicos para un sitio [9] con características de liberación ventajosas [10], así como para microrreactores artificiales multicompartimentales complejos [11 ]. En consecuencia, la preparación de vesículas compartimentadas se ha investigado durante las últimas tres décadas. A diferencia de las vesículas multilaminares (MLV), que consisten en muchas membranas concéntricas que exhiben una estructura similar a una & # x0201conion & # x0201d [12], las vesículas multivesiculares (MVV) descritas por primera vez como grandes grupos de compartimentos más pequeños que comparten bicapas comunes [13], han sido redefinido para cubrir todas las estructuras de vesículas no concéntricas dentro de una vesícula más grande [14]. Se informaron varias técnicas de preparación de MVV, incluida la endo-gemación espontánea [15] o inducida [16] & # x02013 [18] de las GUV, la encapsulación de pequeñas vesículas por láminas de lípidos interdigitadas [10], [19], la encapsulación de atados vesículas debido al reconocimiento molecular [20], y la formación de liposomas dobles resultantes de la extensión de películas lipídicas sobre un sustrato de vidrio [21], [22] o de la evaporación en fase inversa [23]. La mayoría de estas técnicas de preparación sufren una intensa manipulación instrumental con procedimientos tediosos y de varias etapas. Además, los procedimientos de preparación carecen de control de la lamelaridad dando como resultado membranas multilaminares biológicamente inverosímiles y técnicamente limitantes, o dan como resultado compartimentos de la misma composición de membrana y / o carga interna que la vesícula de confinamiento. Hasta ahora, se informó que solo la rehidratación de películas lipídicas secas con una solución acuosa que contiene pequeñas vesículas unilaminares da como resultado vesículas compartimentadas de composición heterogénea y de lamelaridad definida, es decir, las vesículas unilaminares pequeñas no concéntricas incorporadas (SUV) difieren de las vesículas unilaminares pequeñas confinantes. vesícula unilaminar (LUV) tanto por su composición de membrana como por su carga interna [11]. Sin embargo, debido al carácter estocástico del proceso de incorporación, la probabilidad de incorporación es baja y tuvo que mejorarse equilibrando la interacción electrostática entre los SUV encapsulados y el LUV confinante ajustando la composición lipídica de los SUV y LUV [24]. Así, la falta de un procedimiento de separación, el pequeño tamaño tanto de los compartimentos (diámetro medio: 250 nm) como de las vesículas compartimentadas (diámetro medio: & # x0003c2 & # x000b5m) y el requisito de determinadas composiciones lipídicas limitan el rango de aplicaciones para la rehidratación de películas lipídicas secas.

Aquí, se informó sobre la transferencia de emulsión de vesícula en agua en aceite (v / w / o) con un procedimiento de separación posterior como un método preparativo recientemente desarrollado para la fabricación jerárquica controlada, eficiente y técnicamente sencilla de gigantes (es decir, 1 & # x02013100 & # x000b5m de diámetro) vesículas unilaminares compartimentadas internamente por vesículas unilaminares gigantes no concéntricas de diferente composición de membrana y carga interna. En el núcleo del nuevo método preparativo se encuentra la aplicación secuencial del método de transferencia de emulsión de agua en aceite (w / o) que, según se informa, da como resultado vesículas gigantes unilaminares y una alta eficiencia de encapsulación [25]. Aquí, para la preparación de los compartimentos internos, las gotitas de emulsión sin / estabilizadas por una única capa de fosfolípidos fueron forzadas por centrifugación a pasar una interfaz entre una fase acuosa y oleosa estabilizada por otra monocapa de fosfolípidos. Durante el paso, las dos monocapas se combinaron y formaron una bicapa que aisló el lumen acuoso de las GUV intermedias, cargadas con sacarosa y un fluoróforo, de la solución de hospedaje acuosa externa que contenía glucosa. Para la encapsulación de estas GUV intermedias en GUV más grandes, las GUV intermedias se extruyeron, se transfirieron a una fase oleosa, se emulsionaron y se encapsularon dentro de una segunda población de GUV utilizando el mismo método. Las GUV se fabricaron con una composición de fosfolípidos diferente como se especifica a continuación. Por lo tanto, los compartimentos internos no solo se cargaron con diferente carga (es decir, sacarosa) sino que también estaban compuestos por diferentes componentes de la membrana (es decir, lípidos biotinilados) que las GUV confinantes. En consecuencia, este método permitió la preparación de lo que denominamos vesículas unilaminares jerárquicas (HUV) con control de la heterogeneidad composicional de las membranas involucradas y la carga a un nivel, que no es posible con los métodos de preparación tradicionales de MVV y MLV. Además, nuestro método de preparación de HUV se caracteriza por un alto rendimiento de HUV, una alta eficiencia de encapsulación y un bajo esfuerzo técnico.


Introducción

Los nanotubos de membrana biológica son estructuras tubulares que se observan comúnmente dentro de la célula y entre las células. Se reconoce cada vez más que la formación y la dinámica de los nanotubos desempeñan un papel importante en una multitud de avances biológicos, como la entrega de antígeno endosómico en células T polarizadas 1, el transporte entre ER y Golgi 2 y entre Golgi y la membrana plasmática 3. Recientemente también demostramos el papel de la dinámica de nanotubos en la reformación del lisosoma autofágico durante la autofagia 4,5 y la remodelación de la red mitocondrial 6. La formación de nanotubos suele ser un proceso activo que requiere obras. McMahon y Gallop han revisado los factores que impulsan la deformación biológica de la membrana, incluida la composición de lípidos, las proteínas de la membrana y las proteínas de andamiaje, así como el citoesqueleto y sus proteínas motoras asociadas 7. Hasta ahora, la comprensión mecanicista de la tubulación de membranas se basa principalmente en in vitro Ensayos de reconstitución, que comprenden dos enfoques 8. En el primer enfoque, los componentes que se cree que están involucrados en la tubulación de la membrana se sintetizan, purifican o incluso se mantienen en extractos celulares y se utilizan para reconstituir el proceso de tubulación. Este enfoque ha ayudado a reducir los componentes necesarios para la formación de nanotubos 9. Como ejemplo, tales ensayos han establecido que los motores de kinesina y los microtúbulos son suficientes para inducir tubos de membrana a partir de vesículas en ausencia de cualquier otra maquinaria o proteínas 10. El otro enfoque se centra más en la respuesta mecánica de la tubulación de la membrana y, por lo tanto, a menudo se realiza con liposomas modelo, a saber, Vesículas Unilaminares Gigantes (GUV) 11,12. Por lo general, en estos ensayos se utilizan técnicas de manipulación directa de una sola vesícula, que incluyen flujo hidrodinámico 13, micropipetas 14 y pinzas ópticas 15,16. Dado que estas técnicas permiten controlar la carga con precisión, se puede estudiar en detalle la respuesta mecánica de la tubulación de membrana.

A pesar de todos los hallazgos, no está claro en qué medida el tamaño de una vesícula afecta su tubulación. Esta pregunta es de gran interés ya que el tamaño de las vesículas y orgánulos es heterogéneo en la célula. Aunque un anterior in vitro El estudio indica que la fuerza requerida para iniciar la tubulación se escala con el tamaño de la vesícula, la conclusión se limitó a las GUV que tienen aproximadamente 20 µm de diámetro 15, mucho más grandes que la mayoría de las vesículas y orgánulos intracelulares. Por el contrario, poco se ha logrado para comprender la tubulación de pequeñas vesículas que son fisiológicamente más relevantes.

En este trabajo, nuestro objetivo es determinar cómo el tamaño de la vesícula afecta la tubulación de la membrana dentro de las células vivas utilizando lisosomas y autolisosomas como un conjunto de sistemas modelo. Los autolisosomas son compartimentos degradantes formados por la fusión de un autofagosoma y múltiples lisosomas durante la autofagia. Recientemente descubrimos que en la etapa tardía de la autofagia, las estructuras tubulares se extruyen y se pellizcan de los autolisosomas para formar pequeños proto-lisosomas, que se convierten en lisosomas funcionales después de un proceso de maduración. Este proceso, llamado reformación lisosomal autofágica (ALR), es crucial para que las células retengan su nivel de lisosoma cuando salen de la etapa 4 autofágica. Si bien la composición de la membrana de los autolisosomas es similar a la de los lisosomas, sus tamaños son bastante diferentes. Se sabe que el rango de diámetro del lisosoma está entre 50 nm y 500 nm 17. En el caso de los autolisosomas, su tamaño varía desde unos pocos cientos de nanómetros hasta varios micrómetros, más grande y más variado que el de los lisosomas 17. Especulamos que las células pueden usar el tamaño de las vesículas para distinguir los lisosomas y los autolisosomas para promover la formación de túbulos específicamente en los autolisosomas. Para probar esta idea, primero cuantificamos el porcentaje de tubulación de lisosomas y autolisosomas en la célula. los en vivo Las observaciones revelan que los autolisosomas muestran una probabilidad de tubulación mucho mayor que los lisosomas. La hipótesis de la dependencia del tamaño se refuerza aún más mediante un método de agrandamiento inducido por sacarosa en la célula. Además, con el conocimiento de que la tubulación tanto de los autolisosomas como de los lisosomas es impulsada por motores de kinesina asociados, reconstituimos el proceso de tubulación. in vitro utilizando lisosomas purificados, autolisosomas y liposomas artificiales. El ajuste preciso de la concentración del motor de kinesina permite separar el efecto del tamaño sobre la tubulación de otros factores. Por último, aplicamos Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) para medir cuantitativamente la barrera de fuerza durante el proceso de tubulación y realizar un cálculo simple basado en las mediciones.

En general, estos resultados sugieren que el tamaño de las vesículas afecta la probabilidad de tubulación de los lisosomas y autolisosomas, cuyo tamaño varía entre 50 nm y varios micrómetros. Nuestros ensayos construidos para lisosomas y autolisosomas pueden extenderse fácilmente a otros sistemas de deformación de vesículas. Es importante destacar que el efecto de dependencia del tamaño puede ser uno de los mecanismos de la célula para regular los procesos celulares que implican la deformación de la membrana.


2 TIPOS DE VESÍCULAS EXTRACELULARES

Actualmente asignadas en las categorías amplias de exosomas, MV o cuerpos apoptóticos en función de su mecanismo de formación, modo de liberación de las células y tamaño 2 (Tabla 1), estas clasificaciones desmienten un poco la heterogeneidad que puede existir dentro de las clases de vesículas en términos de tanto carga como funcionalidad. 36 Los exosomas, los mejor caracterizados de los subtipos de EV, se forman primero como vesículas intraluminales dentro de un cuerpo multivesicular (MVB), que se liberan al espacio extracelular al fusionarse MVB con la membrana plasmática. Las 37 MV, a veces denominadas ectosomas o micropartículas, se forman por la formación de ampollas hacia afuera de la membrana plasmática y la posterior fisión de las ampollas de la membrana plasmática. 2 MV derivados de células cancerosas humanas (Figura 1A) han recibido mucha atención debido a su capacidad para participar en la transferencia horizontal de proteínas de señalización entre células cancerosas y contribuir a su actividad invasiva. Los cuerpos apoptóticos se forman durante la formación de ampollas y la fragmentación celular tras la muerte celular 2 (Figura 1B), y su impacto sobre otras células no está bien estudiado. Las vesículas también pueden liberarse de estructuras nanotubulares que irradian desde la membrana plasmática. 38 En la actualidad, parece que la mayoría, si no todos, los tipos de células forman EV, 25, 39 sin embargo, en general, el estrés celular y las enfermedades con frecuencia regulan al alza su formación y alteran la carga contenida en su interior. 40

  • Desconocido en la actualidad
  • Comunicación intercelular
  • Promover la progresión del cáncer
  • Vesículas intraluminales de cuerpo multivesicular
  • Liberado tras la fusión MVB con membrana plasmática
  • Comunicación intercelular en células sanas y enfermas.
  • Acondicionar / educar al microambiente extracelular
  • Puede promover la patogenia de la enfermedad.
  • Brotación directa de la membrana plasmática
  • Liberado a través de fisión impulsada por acto-miosina en el espacio extracelular
  • Comunicación intercelular en células sanas y enfermas.
  • Acondicionar / educar al microambiente extracelular
  • Puede promover la patogenia de la enfermedad.
  • Ampollas aleatorias de citoplasma y fragmentos de orgánulos en la membrana plasmática
  • Desglose de células apoptóticas
  • Posible transducción de señales intercelulares
  • Brotación directa de la membrana plasmática
  • Comunicación intercelular enviada desde células cancerosas.
  • Acondicionar / educar al microambiente extracelular
  • Puede promover la patogenia de la enfermedad.
  • Formado por células estimulantes artificialmente para eliminar las ampollas de la membrana plasmática rica en lípidos
  • Estudiar el comportamiento de las proteínas de la membrana plasmática
  • Estudiar la organización de los lípidos de la membrana plasmática
  • Sintetizado in vitro como mezclas de colesterol y fosfolípidos en un disolvente orgánico. Puede requerir procesamiento sónico o mecánico para formar vesículas de bicapa de lípidos simples (unilaminares) o multicapa (multilaminares)
  • Estudiar las propiedades de la membrana plasmática como las balsas lipídicas y la separación de fases.
  • Entrega de terapéuticos

En general, los vehículos eléctricos comprenden un amplio espectro de vesículas que van desde 8 nm hasta varias micras. Los MV generalmente varían de 200 nm a varias micras de diámetro, mientras que los exosomas son más pequeños y varían de 50 a 100 nm de diámetro. 2, 41 También se han descrito recientemente nanovesículas que varían de 8 a 12 nm en sangre periférica, 42 y estas vesículas muy pequeñas pueden aislarse errantemente con exosomas usando muchos de los protocolos de aislamiento actualmente utilizados. Debido a la considerable heterogeneidad en el tamaño de las VM, es probable que haya subpoblaciones dentro de esta categoría de vesículas. El término "oncosomas" se ha utilizado para describir MV o incluso todos los EV que se han liberado de las células cancerosas. 43 Sin embargo, es de destacar que los oncosomas grandes (LO) se refieren a un subtipo de VM derivadas de la membrana plasmática, de 1 a 10 μm de diámetro, que se liberan de las células tumorales. 44, 45 La nomenclatura, así como los tamaños atribuidos a varios subtipos de vehículos eléctricos, no han estado exentos de debate. 46, 47 Para complicar este asunto está el hecho de que los métodos de aislamiento para los subtipos de EV aún están en desarrollo y aún no se han alcanzado las mejores prácticas de consenso, lo que lleva a diferencias en las poblaciones de vesículas que se evalúan entre los estudios. 36, 48 Como resultado de la falta de una distinción clara entre los subtipos de EV, en muchos estudios se han utilizado poblaciones colectivas de EV. Para los propósitos de esta revisión, usamos el término "vesículas extracelulares" para todos los estudios que no se han atribuido a una población determinada o cuando los métodos de aislamiento sugieren que probablemente se estaban investigando múltiples subtipos. Hemos atribuido características a las “microvesículas” si las metodologías de aislamiento de vesículas se han enriquecido para la fracción MV.

Es probable que el modo de biogénesis y la carga de vehículos eléctricos desempeñen un papel fundamental en la definición de los criterios de clasificación. En este sentido, recientemente, se han descrito subpoblaciones de vehículos eléctricos mediante la caracterización de la carga, el tamaño y la densidad36, 49, 50, así como sus efectos sobre las células receptoras. 49 Es posible, si no probable, que a medida que el campo avanza, surjan clases de vesículas adicionales o modificaciones a los sistemas de clasificación actuales.

Aunque no se clasifican junto con los anteriores, se han descrito tipos de vesículas adicionales principalmente como herramientas de investigación para estudiar el comportamiento de los lípidos y las proteínas. Estos pueden formarse tras la estimulación artificial de las células, como en las vesículas gigantes de membrana plasmática (GPMV), que se forman tras el tratamiento de células vivas con estímulos como irradiación con láser, tratamiento con sales o los productos químicos paraformaldehído y ditiotreitol. 51-53 Esto da como resultado la formación de vesículas grandes (de tamaño micrométrico) que se utilizan con frecuencia para estudiar la organización de lípidos y proteínas en la membrana plasmática 52, 54, 55 (Figura 2). Otros tipos de vesículas se preparan de forma totalmente sintética in vitro, como en las vesículas lipídicas unilaminares y multilaminares pequeñas, grandes y gigantes, 56 incluidas las variantes denominadas vesículas de membrana plasmática artificial. 57 Estas vesículas sintéticas también se han utilizado con fines terapéuticos, proporcionando una mejor estabilidad y absorción de fármacos y ácidos nucleicos, 58, 59 probablemente explotando los mismos mecanismos utilizados por las vesículas de origen natural.


3. & emspConclusions

Hemos demostrado aquí que la capacidad de modular espacialmente la densidad de reticulación de un gel delgado aporta un control de tamaño sin precedentes en la formación asistida por gel de vesículas de una sola capa. Al modelar la densidad de reticulación en geles delgados de PNIPAAm, hemos obtenido vesículas ancladas gigantes esencialmente monodispersas con una variación en los diámetros menor al 10%.

La estrategia desarrollada en este artículo se basó en las relaciones diferenciales de hinchamiento entre las regiones de gel de densidades de reticulación altas y bajas. Después de la hinchazón, las regiones muy hinchadas del gel aparecieron como pilares decorados con una vesícula gigante, las regiones duras que rodean los pilares no condujeron al crecimiento de vesículas gigantes. Esto sucedió porque el proceso de formación de vesículas depende en gran medida del grado de reticulación y la relación de hinchamiento incluso para geles PNIPAAm no estructurados (consulte la Figura S2 y la Información complementaria para obtener más detalles). Si bien se forma una gran cantidad de vesículas con varios tamaños en dichos geles, existe una tendencia general a que el tamaño promedio y la fracción de vesículas grandes disminuyan gradualmente con el aumento de la densidad de reticulación (Figura S2). Por tanto, los parámetros del patrón de la máscara óptica que controla la geometría de las regiones reticuladas alta y baja se traducen directamente en tamaño y posicionamiento de vesículas gigantes. La transferibilidad del diseño del patrón a las propiedades de las vesículas gigantes es una característica intrínsecamente flexible y poderosa del método, ya que permitirá preparar no solo vesículas gigantes de un tamaño específico, sino también mezclas más complejas pero bien definidas de diferentes tamaños con posiciones predeterminadas.

De hecho, al contrario del crecimiento asistido por gel con otros geles de polímero, las vesículas gigantes aquí permanecieron unidas al sustrato y colocadas en los pilares. Como resultado, se forman miles de vesículas gigantes ancladas y colocadas con precisión con la simple adición de la solución al gel estampado en seco donde se extendió el lípido. El anclaje se debe a la penetración de lípidos en el gel seco e hinchado, lo que cambia las condiciones de límite capilar entre las bicapas y el sustrato. Aunque es probable que la estructura detallada de la región de anclaje determine qué tan bien se sella el interior de las GUV con respecto a las diferentes moléculas, no compromete la pureza de las GUAV formadas ya que el gel está químicamente reticulado. Es importante subrayar que la estabilidad de esta plataforma de vesículas gigantes está asegurada también por la reticulación química de la película de gel con el sustrato, lo que resulta en una plataforma de formación y observación muy robusta para los GUAV.

Las mediciones físicas realizadas en GUAV revelaron también las posibilidades que ofrece esta plataforma con respecto al control de posición y las mediciones paralelas bajo un microscopio. Las mediciones de FCS se pudieron realizar en condiciones muy estables durante varios minutos, proporcionando coeficientes de difusión de lípidos de acuerdo con los valores de la literatura. La fotosensibilización de las vesículas también se logró fácilmente, y las transformaciones resultantes pudieron seguirse simultáneamente y evaluarse cualitativamente en muchas vesículas. Curiosamente, estos logros son un paso clave hacia el desarrollo en un futuro cercano de mediciones automatizadas bajo un microscopio óptico en matrices masivas de membranas lipídicas biomiméticas.


Caracterización de vesículas gigantes formadas por procesos de transferencia de fase

Las vesículas son de gran interés como sistema de administración de fármacos o como modelos de membranas celulares. Para muchas aplicaciones, es necesario producir vesículas que sean unilaminares, monodispersas, fáciles de ajustar en tamaño y que puedan llenarse con varios tipos de compuestos activos. En una serie de experimentos, producimos vesículas gigantes con una dimensión de varios milímetros mediante procesos de transferencia de fase. Esta nueva técnica permitió sintetizar vesículas definidas con membranas lipídicas y tensioactivas. La preparación de estos agregados se realizó en dos pasos. Primero, llenamos una cantidad de agua en una cubeta y cubrimos este líquido con una fase oleosa. Los tensioactivos o lípidos se disolvieron en el agua o en la fase oleosa. En el segundo paso, se formó una gota de agua llena de azul de metilo y sacarosa con una jeringa en la fase oleosa. Debido a la diferencia de densidad, la gota de agua pasó por la interfaz del avión aceite / agua y durante este proceso se transformó en una vesícula. Los liposomas gigantes así formados mostraron una alta sensibilidad frente a las variaciones de la presión osmótica y su estabilidad alcanzó de segundos a horas. Debido al proceso de transferencia de fase, las membranas de las vesículas a menudo contenían lentes de aceite incorporadas. Si este líquido hidrófobo se liberaba de la membrana, las vesículas se descomponían en liposomas más pequeños con una amplia distribución de tamaño de partícula.

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Partición de la sonda fluorescente en vesículas unilaminares gigantes de mezclas de "balsa de lípidos"

La visualización directa de dominios l o (ordenados por líquido) en forma de balsa en sistemas modelo y células que utilizan técnicas microscópicas requiere sondas de fluorescencia con preferencia de partición conocida para una de las fases presentes. Sin embargo, las sondas fluorescentes pueden mostrar preferencias de partición diferentes en diferentes sistemas de lípidos y también pueden afectar el comportamiento de fase de la bicapa de lípidos del huésped. Por lo tanto, una comprensión detallada del comportamiento de las sondas fluorescentes en sistemas de bicapa lipídica definidos con comportamiento de fase conocido es esencial antes de que puedan usarse para identificar estados de fase de dominio. Utilizando vesículas unilaminares gigantes compuestas por la mezcla de lípidos ternarios DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) / DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina) / colesterol, para el cual la fase Se conoce el comportamiento, examinamos nueve sondas fluorescentes de uso común utilizando microscopía de fluorescencia confocal. La preferencia de partición de cada sonda se asignó sobre la base de la cuantificación de las fracciones del área del dominio o mediante el uso de un marcador de fase l d (líquido desordenado) bien caracterizado. Las sondas fluorescentes se examinaron tanto individualmente como utilizando enfoques de etiquetado dual o triple. La mayoría de las sondas se dividieron individualmente en la fase ld, mientras que solo NAP (nafto (2,3-a) pireno) y NBD-DPPE (1,2-dipalmitoil-sn -glicero-3-fosfoetanolamina-N - (7-nitro -2-1,3-benzoxadiazol-4-ilo) prefirió la fase inferior. Encontramos que Rh-DPPE (lisamina y rodamina comercial B y ndash1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) aumentaba la temperatura de transición de miscibilidad, mezcla T. Curiosamente, la partición de DiIC 18 (1,1 & prime-dioctadecyl-3,3,3 & prime, 3 & prime-tetramethylindocarbocyanine perclorate) fue influenciada por Bodipy & reg-PC (2- (4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora -3a, 4a-diaza- s -indaceno-3-pentanoil) -1-hexa-decanoil- sn -glicero-3-fosfocolina). El uso específico de cada una de las sondas fluorescentes está determinado por su fotoestabilidad, preferencia de partición, capacidad para detectar separaciones de fase lipídica y cambios inducidos en la mezcla T. Demostramos la importancia de probar una sonda fluorescente específica en un sistema de membrana modelo dado, en lugar de suponer que etiqueta una fase lipídica particular.

Diario

Revista bioquímica y ndash Portland Press

Publicado: 15 de septiembre de 2010

Palabras clave: microscopía de fluorescencia confocal, sonda fluorescente, vesícula unilaminar gigante, balsa lipídica, fase líquida ordenada, partición


Investigar

La investigación en el laboratorio de la Prof. Dra. Kirsten Bacia se enfoca en membranas biológicas y herramientas biofísicas para estudiar proteínas y membranas.

  • Realizamos experimentos de reconstitución para aprender cómo las proteínas remodelan las bicapas lipídicas y cómo las proteínas y las moléculas polifílicas sintéticas interactúan con los conjuntos lipídicos.
  • Seguimos desarrollando modelos de membranas, así como herramientas basadas en microscopía y espectroscopía para estudiar estos ensamblajes supramoleculares y sus interacciones.

Somos miembros del Instituto de Química, Depto. De Química Física (Facultad de Ciencias Naturales II). Nuestro laboratorio está ubicado en el Charles-Tanford-Protein Center, junto con los laboratorios de la Facultad de Ciencias Naturales I (Ciencias de la Vida) y la Facultad de Medicina, y es parte del Centro de Competencia en Innovación (Zentrum f r Innovationskompetenz) HALOmem .

Intereses de investigación: Estudiamos bicapas lipídicas, interacciones de proteínas y moléculas sintéticas con membranas y proteínas en solución. Aplicamos y desarrollamos modelos de herramientas de membrana y herramientas ópticas, así como nuevas combinaciones de las mismas.

Intereses de investigación: Estudiamos bicapas lipídicas, interacciones de proteínas y moléculas sintéticas con membranas y proteínas en solución. Aplicamos y desarrollamos modelos de herramientas de membrana y herramientas ópticas, así como nuevas combinaciones de las mismas.

Remodelación de membranas

El transporte intracelular requiere la remodelación de las membranas lipídicas. En el retículo endoplásmico (RE) de las células eucariotas, un conjunto de proteínas se ensambla en un complejo, el complejo COPII, que forma una capa de proteína alrededor de un brote de membrana lipídica naciente. Estamos interesados ​​en los mecanismos fisicoquímicos detrás de este asombroso proceso de remodelación de la membrana y en lo que realmente se requiere para que la yema proceda a través de la fisión bicapa. Ésta es una cuestión de larga data en el campo del tráfico intracelular.

Remodelación de la membrana por proteínas Izquierda: Purificación de proteínas por cromatografía ( KTA FPLC). Medio: Imagen de microscopía confocal de la capa de COPII reconstituida en liposomas gigantes (Bacia et al., Sci. Rep.2013), barra de escala = 10 μm. Derecha: Organización del COPII en un túbulo de membrana lipídica de microscopía crioelectrónica (Zanetti et al., ELife 2013), barra de escala = 100 nm.

Remodelación de membranas por proteínas
Izquierda: Purificación de proteínas por cromatografía ( KTA FPLC). Medio: Imagen de microscopía confocal de la capa de COPII reconstituida en liposomas gigantes (Bacia et al., Sci. Rep.2013), barra de escala = 10 μm.
Derecha: Organización del COPII en un túbulo de membrana lipídica de microscopía crioelectrónica (Zanetti et al., ELife 2013), barra de escala = 100 nm.

Sistemas de membranas artificiales

Liposomas se puede preparar en varios tamaños, desde decenas de nanómetros hasta decenas de micrómetros. La reconstitución de las proteínas integrales de la membrana en liposomas (es decir, la formación de proteoliposomas) así como la unión periférica de las proteínas de la cubierta a los liposomas se analiza utilizando ensayos tanto bioquímicos como biofísicos.

(A) Análisis FCS (espectroscopia de correlación de fluorescencia) de la reconstitución de proteínas de membrana. La proteína lleva una etiqueta fluorescente. La proteína libre en solución se difunde rápidamente (curva roja), mientras que los proteoliposomas se difunden mucho más lentamente (curva púrpura). (B) Ensayo bioquímico para la reconstitución de proteínas de membrana.

(A) Análisis FCS (espectroscopia de correlación de fluorescencia) de la reconstitución de proteínas de membrana. The protein carries a fluorescent label. Free protein in solution diffuses fast (red curve), whereas proteoliposomes diffuse much more slowly (purple curve). (B) Biochemical assay for membrane protein reconstitution.

Using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), the success of membran protein reconstitution can be assessed within minutes. (from Simeonov et al., Biophys. Chem. 2013, doi: 10.1016/j.bpc.2013.08.003)

Using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), the success of membran protein reconstitution can be assessed within minutes. (from Simeonov et al., Biophys. Chem. 2013, doi: 10.1016/j.bpc.2013.08.003)

Dual-color FCCS (see below) allows to obtain quantitative binding curves of protein (or ligand) binding to freely diffusing liposomes (from Kruger et al., BioRxiv 2017, DOI 10.1101/146464 , now published in Biophys. J. 2017, doi: 10.1016/j.bpj.2017.06.023)

Dual-color FCCS (see below) allows to obtain quantitative binding curves of protein (or ligand) binding to freely diffusing liposomes (from Kruger et al., BioRxiv 2017, DOI 10.1101/146464 , now published in Biophys. J. 2017, doi: 10.1016/j.bpj.2017.06.023)

Very large liposomes, so-called Giant Unilamellar Vesicles (GUVs), prepared by the electroformation method are on the order of 10 m in size, making them well-suited for studies by confocal fluorescence microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS, see below).

(A) Electroformation setup for producing Giant Unilamellar Vesicle (B) Dye-labeled Giant Unilamellar Vesicles in a test tube (C) Confocal slice image of Giant Unilamellar Vesicles

(A) Electroformation setup for producing Giant Unilamellar Vesicle (B) Dye-labeled Giant Unilamellar Vesicles in a test tube (C) Confocal slice image of Giant Unilamellar Vesicles

Langmuir monolayers are prepared at the buffer/air interface. The interaction of proteins with the monolayers can be studied using infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS).

Determination of the orientation of the COPII-protein Sar1p at a lipid monolayer by IRRAS (from Schwieger et al., Polymers 2017, doi: 10.3390/polym9110612)

Determination of the orientation of the COPII-protein Sar1p at a lipid monolayer by IRRAS (from Schwieger et al., Polymers 2017, doi: 10.3390/polym9110612)

Lipid phase behavior We are interested in dynamic lateral heterogeneities in membranes from natural components (proteins, lipids) and synthetic components (artificial amphiphiles and polyphiles).

Dendritic, star-shaped domains with sixfold symmetry formed in membranes from DPPC and X-shaped bolapolyphiles (from Werner et al., Polymers 2017, doi:10.3390/polym9100476, see also Werner et al., Chem. Eur. J. 2015, doi 10.1002/chem.201405994). The molecular structure of the bolapolyphile influences the domain shape.

Dendritic, star-shaped domains with sixfold symmetry formed in membranes from DPPC and X-shaped bolapolyphiles (from Werner et al., Polymers 2017, doi:10.3390/polym9100476, see also Werner et al., Chem. Eur. J. 2015, doi 10.1002/chem.201405994). The molecular structure of the bolapolyphile influences the domain shape.

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a very useful tool for examining mobility and interactions in a variety of systems including membranes. FCS is highly sensitive to small differences in the diffusion rates of proteins and lipids, which allows for instance to characterize differences in phase behavior of lipid bilayers. FCS is used to analyze the binding of diffusible ligands to membrane receptors, such as membrane proteins or glycolipids. Changes in the fluorescence brightness parameter reveal membrane protein oligomerization. Moreover, the use of dual-color fluorescence cross-correlation (dcFCCS) allows to assess protein-protein binding in cases, where binding does not lead to significant changes in diffusion rates. The dual-color cross-correlation technique can also be employed to detect dynamic co-localization of labeled cargo molecules in small, mobile carriers, such as transport vesicles. Owing to the use of fluorescent labels, FCS is highly specific and can be applied both to artificial, reconstituted systems and directly to living cells.

Parameters accessible by FCS (for details see: Bacia et al., Nat. Methods 2006)

Parameters accessible by FCS (for details see: Bacia et al., Nat. Methods 2006)

Schematic view of an FCS setup with dual color FCCS capability

Schematic view of an FCS setup with dual color FCCS capability

FCS is typically performed on a setup that is similar to a confocal microscope. One or more laser lines are focused in the sample and the fluorescence is collected through the same objective. A pinhole serves to delimit the detection volume. The fluorescence emission(s) from the label(s) are selected by means of emission filter(s) and the fluorescence intensity as a function of time is recorded by avalanche photodiode detectors. Different methods of analysis are available to extract information from the fluorescence fluctuations, which occur as labeled molecule diffuse through the focus. Correlation analysis yields an autocorrelation curve, whose amplitude is inversely related to the concentration of the fluorescent particles. The decay time of the correlation curve reflects the diffusional mobility of the particles. In dual-color FCCS, the relative amplitude of the cross-correlation curve depends on the fraction of double-labeled (i.e., bound) particles.

Principle of FCS and dcFCCS measurements, for details see Bacia et al., Nat. Methods 2006

Principle of FCS and dcFCCS measurements, for details see Bacia et al., Nat. Methods 2006

Methods and instrumentation

We are interested in working out other applications of the methods we use in the lab, e.g. in cell biology and plant biology through active collaborations. Please get in touch if any of the following spectroscopic methods are of interest for your research:

  • Fluorescence Fluctuation Spectroscopy (particle diffusion/mobility analysis in solution, in model system and inside live cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS), binding analysis using dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), diffusion/mobility analysis using raster image correlation spectroscopy (RICS))
  • Confocal Fluorescence Microscopy
    • Laser Scanning Microscopy (LSM) on an Inverse or Upright Scope
    • Zeiss Airy Scan (improved spatial resolution)
    • Spinning Disc (fast scanning for dynamic processes)
    • Confocal fluorescence microscopy on cryo-fixed samples (in liquid nitrogen)
    • Confocal anisotropy imaging
    • Total Internal Fluorescence (TIRF) and single molecule localization microscopy (Zeiss Elyra)

    The same applies to methods for producing and characterizing model membrane systems, e.g. monolayers on a Langmuir film balance (stand-alone or combined with widefield or confocal microscopy), giant unilamellar vesicles (GUVs), membrane protein reconstitution into liposomes, flotation assays, dynamic light scattering, sample preparation for cryo-EM at HALOmem (Lab of Prof. Dr. Kastritis) or the EM facility (Dr. Gerd Hause) and more.

    We are able to collaborate on a range of projects. For core facility type services in light microscopy, please refer to the CFI (Core Facility Imaging) of the Medical Faculty in the same building.

    Interested in joining the lab?

    Being an interdisciplinary team, we welcome contributions from biology, biochemistry, chemistry, physics, medical physics, pharmacology, engineering and other relevant backgrounds.

    Students interested in joining the lab during their Soltero o Masters program should feel free to contact Prof. Kirsten Bacia. Periodically, listings of exemplary Bachelor thesis projects are available at the Institute of Biochemistry/Faculty of Natural Sciences I and the Institute of Chemistry/Faculty of Natural Sciences II, respectively.

    Students interested in a PhD project y Postdocs are also welcome to inquire about opportunities.

    Job announcements at the University of Halle can be found at the Human Resource Department.


    Large Scale Conformational Transitions

    Large scale conformational transitions can occur in lipid bilayers. These include bud formation, formation of vesicles which split off from the membrane, and fusion of membrane vesicles, all of which are important biologically. To some extent, the tendency to engage in these larger shape transitions depends on the local curvature of the vesicle, which depends on the local phospholipid composition and fluidity of the membrane. We have previously seen that segregation of lipids into rafts (or domains) within a leaflet depends on the phospholipid content. Baumgart et al. have made giant unilamellar vesicles (GUV) containing a mixture of three lipids: sphingomyelin (SM), dioleylphosphatidylcholine (DOPC), and cholesterol (C) to study transitions in the bilayers. SM and C segregate laterally into a "liquid phase" domain characterized by significant order (Lo) while DOPC forms a "liquid phase" with more disorder (Ld). They could detect the different phases through fluorescence microscopy of GUV's labeled with fluorophores (molecules that absorb visible or UV light and emit photons of lower energy (higher wavelength). The first, N-lissamine rhodamine dipalmitoylphosphatidylethanolamine (red fluorescence), partitions almost exclusively into the Ld phase. The second, perylene (blue fluorescence), partitioned with great selectivity into the Lo phase. The results of their studies are shown in the figures below. This images provide stunning visualization of lipid domains (rafts) including those in the shapes of circles, stripes, and rings. Their works shows that the boundary between the domains is important in determining lipid structures. Structures are favored which reduce the perimeter at the boundaries of the phases. It appears that the Ld phase (and associated lipids) is found preferentially in area of high membrane curvature, while the Lo phase is found is regions of lower curvature. The two figures below are reprinted with permission of Nature and the authors: Baumgart, Hess, and Webb, W. Imaging coexisting fluid domains in biomembrane models coupling curvature and line tension. Nature. 425, pg 821 (2003)

    Figure: Equatorial cross sections of GUVs with multiple phases

    Figure: GUVs structures with multiple phases

    Movie: Molecular Dynamics Simulation of vesicle fusion (scroll down to 52: Control of Membrane Fusion Reaction..)


    Applying pattern matching analysis to lifetime images for studying bead diffusion dynamics

    The diffusion behavior of two types of dye-labeled beads was monitored via rapidFLIM, as above. Doubling the image acquisition speed by reducing the pixel dwell time towards 4 µs (about 6 frames per second) results in more noise in the FastFLIM image leading to a lower FLIM contrast, as can be seen in the top video.

    The lifetime contrast can be enhanced by applying the pattern matching approach. For each species, a lifetime pattern was generated (shown below: green curve = Dragon Green, red curve = Nile Red) and the recorded FLIM data was analyzed, resulting in the second video with improved lifetime contrast.


    Ver el vídeo: Clase Celula Membrana funciones (Agosto 2022).