Información

Transcripción in vitro, problema de contaminación

Transcripción in vitro, problema de contaminación



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy usando un ARN que se transcribe in vitro antes de comenzar mi proyecto. Resultó que no está preparado correctamente y tiene ADN contaminado.

En lugar de volver a realizar la transcripción in vitro, quiero intentar limpiarla con tratamiento con DNasa y precipitación con LiCl después. ¿Crees que funcionaría?

Y en segundo lugar, el ARN transcipitado in vitro está en diferentes diluciones, por lo que tengo un poco de stock (tal vez 5 uL) que es alrededor de 200 ng / uL y tengo otras diluciones 1 y 0.1 ng / uL. Me gustaría limpiarlos todos. ¿Crees que si solo mezclo todas las diluciones con el caldo, determino la concentración y hago el resto? ¿Es apropiado?

¡Gracias!


El tratamiento con DNasa es en realidad uno de los pasos opcionales si desea deshacerse de la plantilla de ADN original: https://www.neb.com/protocols/2013/04/02/standard-rna-synthesis-e2050

Si sabe que la contaminación ocurrió después de la transcripción, el tratamiento con DNasa obviamente debería ayudar.

Con respecto a las alícuotas: su stock es 200 veces más concentrado que las alícuotas (por lo tanto, para obtener cantidades iguales de ARN que en 1 µl del stock, necesitaría tomar 200 µl de la alícuota de 1 ng / µl). No creo que valga la pena mezclarlos (y la eficiencia de la precipitación de ARN probablemente disminuirá), de lo contrario, simplemente haga otra transcripción.


Capítulo 5 Desadenilación regulada In vitro

La cola 3′-poli (A), que se encuentra en prácticamente todos los ARNm, se acorta enzimáticamente mediante un proceso denominado "desadenilación". La desadenilación es un medio generalizado de controlar la estabilidad y la traducción del ARNm. Las enzimas involucradas, las llamadas deadenilasas, son sorprendentemente diversas. Están controlados por secuencias de ARN que se encuentran comúnmente en las regiones 3 'no traducidas (UTR), que se unen a factores reguladores.

Tanto las proteínas de unión al ARN como los microARN aceleran la desadenilación de ARNm específicos. En algunos casos, los reguladores mejoran la deadenilación uniéndose y reclutando deadenilasas específicas al ARNm diana. Los muchos cientos de reguladores potenciales codificados en genomas de mamíferos (tanto proteínas de unión a ARN como microARN) y las numerosas deadenilasas, junto con los muchos sitios reguladores potenciales representados en las UTR 3 'de los ARNm, proporcionan un terreno fértil para la deadenilación regulada. Estudios globales recientes sobre la regulación de poli (A) apoyan esta conclusión. Los enfoques bioquímicos y genéticos serán esenciales para explorar la desadenilación regulada.

Los métodos que describimos se centran en la reconstrucción in vitro de deadenilación regulada con componentes purificados de levadura. Discutimos ampliamente las estrategias, los problemas y la historia de in vitro sistemas de deadenilación. Combinamos esto con una discusión más detallada de la purificación, actividad y regulación de la Saccharomyces cerevisiae Complejo Ccr4p ‐ Pop2p deadenilasa y su regulación por las proteínas de unión al ARN PUF (factor de unión de Pumilio y Fem ‐ 3).


Producción de ARN puro y funcional para experimentos de reconstitución in vitro

La reconstitución de complejos de proteínas ha sido una herramienta valiosa para probar funciones moleculares e interpretar observaciones in vivo. En los últimos años, se ha identificado un gran número de complejos de ARN-proteína para regular la expresión génica y ser importantes para una variedad de funciones celulares. A diferencia de los complejos de proteínas, los análisis in vitro de complejos de ARN-proteína se ven obstaculizados por el hecho de que la expresión recombinante y la purificación de moléculas de ARN es más difícil y está menos bien establecida que para las proteínas. Aquí revisamos el estado actual de la tecnología disponible para experimentos in vitro con ARN. Describimos las posibilidades para producir y purificar grandes cantidades de ARN homogéneo y realizar los controles de calidad requeridos. Se discuten problemas específicos de ARN tales como degradación, heterogeneidad de los extremos 5 'y 3', coexistencia de diferentes estados de plegamiento y requisitos previos para la reconstitución de ARN con proteínas expresadas de manera recombinante. Además, se explican varias técnicas para la caracterización de interacciones ARN-proteína directas e indirectas.

Palabras clave: ARN Plegamiento de ARN Purificación de ARN Calidad de ARN Interacciones ARN-proteína Reconstitución de RNP.

Copyright © 2013 Los Autores. Publicado por Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.


Sistemas de traducción

Lisado de reticulocitos de conejo
El lisado de reticulocitos de conejo es un sistema de síntesis de proteínas eucariotas in vitro altamente eficaz que se utiliza para la traducción de ARN exógenos (naturales o generados in vitro). In vivo, los reticulocitos son células altamente especializadas principalmente responsables de la síntesis de hemoglobina, que representa más del 90% de la proteína producida en el reticulocito. Estos glóbulos rojos inmaduros ya han perdido su núcleo, pero contienen ARNm adecuado, así como una maquinaria de traducción completa, para una síntesis extensa de globina. El ARNm de globina endógeno se puede eliminar mediante incubación con nucleasa microcócica dependiente de Ca2 +, que luego se inactiva por quelación del Ca2 + por EGTA. Ambion ofrece un lisado de reticulocitos tratado con nucleasa. Este tipo de lisado es el sistema libre de células dependiente de ARN más ampliamente utilizado debido a su bajo fondo y su utilización eficiente de ARN exógenos incluso a bajas concentraciones (Figura 1). Las proteínas exógenas se sintetizan a una velocidad cercana a la observada en las células de reticulocitos intactas.

El lisado de reticulocitos no tratado traduce ARNm de globina endógena, ARN exógeno o ambos. Este tipo de lisado se usa típicamente para estudiar la maquinaria de traducción, p. Ej. estudiar los efectos de los inhibidores sobre la traducción de globina. Tanto los lisados ​​de reticulocitos de conejo sin tratar como los tratados tienen baja actividad nucleasa y son capaces de sintetizar una gran cantidad de producto de longitud completa. Ambos lisados ​​son apropiados para la síntesis de proteínas más grandes a partir de ARN con o sin capa (eucariotas o virales).


Métodos de purificación

Precipitación y extracción por solventes

El aislamiento selectivo de ARN de mezclas complejas es un paso necesario en la mayoría de los protocolos de purificación para lograr una primera, áspero refinamiento de la muestra antes de técnicas de separación más sofisticadas. Los métodos de extracción por precipitación y solvente aprovechan la solubilidad diferencial de biomacromoléculas en diferentes solventes y condiciones iónicas. La precipitación se realiza generalmente después de reacciones enzimáticas in vitro para separar el ARN de interés de los componentes de proteína y ADN o simplemente para el intercambio de tampón, mientras que la extracción con solvente seguida de precipitación es el método de elección para aislar grandes cantidades de ARN total de fuentes naturales. Para obtener una descripción general, consulte la Tabla 2.

Precipitación

La naturaleza polar de la columna vertebral cargada negativamente hace que el ARN sea altamente soluble en agua. Varios cationes utilizados en combinación con etanol helado como codisolvente pueden neutralizar eficazmente las cargas de la columna vertebral y reducir la solubilidad hasta un punto en el que el ARN precipita selectivamente fuera de la solución. Se pueden usar diferentes cationes y sus sales, como el acetato de amonio y el cloruro de litio, dependiendo del tamaño y la concentración del ARN a precipitar. En [93] se puede encontrar un método completo que comprende protocolos paso a paso para la precipitación de ARN.

Extraccion solvente

El aislamiento de ARN mediante extracción ácida con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo se desarrolló inicialmente como una alternativa al tedioso aislamiento total de ARN de tejidos de mamíferos mediante ultracentrifugación. En este método, la muestra se incuba con una mezcla equimolar de fenol y cloroformo, lo que permite desnaturalizar las proteínas con el tiocianato de guanidinio y, en consecuencia, separarlas en la fase orgánica, mientras que el ARN se disuelve en la fase acuosa. Luego, la separación de las dos fases se logra mediante centrifugación, y el ARN puede recuperarse mediante la posterior precipitación con etanol o cloruro de litio. En el ácido tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo, la fase polar se mantiene en condiciones ácidas (pH 4-6), lo que permite que el ARN permanezca soluble mientras que el ADN se reparte en la interfase. Se publicó una versión detallada y reeditada del protocolo original [94], y se encuentran disponibles muchos kits comerciales basados ​​en este método.

Ultracentrifugación

La ultracentrifugación es la forma estándar de purificar grandes máquinas de ARN, como los ribosomas y las subunidades ribosómicas, así como otras macromoléculas de origen biológico en el mismo rango de tamaño. La ultracentrifugación con un gradiente de un soluto como la sacarosa se ha utilizado durante más de medio siglo [95]. Para el aislamiento de ribosomas completos, polisomas o subunidades ribosómicas individuales, se lisan mecánicamente grandes cantidades de células del organismo de interés, el lisado se centrifuga posteriormente a baja velocidad para eliminar los restos celulares y luego se ultracentrifuga a alta velocidad. gramo (aproximadamente 10 5 gramo) encima de una sacarosa amortiguar para formar un sedimento de los ribosomas necesarios [96]. El material puede luego purificarse adicionalmente mediante ultracentrifugación en una variedad de gradientes de sacarosa tamponada con diferente contenido de sal. La capacidad del ribosoma para mantener juntas sus dos subunidades depende en gran medida del magnesio y, al ajustar el contenido de Mg 2+ del gradiente de sacarosa utilizado para la purificación, se pueden obtener ribosomas completos o subunidades individuales. Una concentración de iones de magnesio más baja (1 mM) ayudará a separar las subunidades individuales, mientras que una concentración más alta promoverá el aislamiento de los ribosomas completos [97]. Después de la separación de los componentes ribosómicos, se mide la absorbancia UV del contenido de los tubos de centrifugación y se fracciona el contenido. A partir de los perfiles de absorbancia, se puede deducir el contenido de la fracción [96]. Aunque tradicionalmente se utiliza mucho en el campo de la biología estructural en cristalografía de rayos X y crio-EM, la técnica de ultracentrifugación también se ha abierto camino en otros campos de investigación. Múltiples métodos en los que se aíslan los ribosomas para investigar el ARN mensajero que se traduce en un momento específico, el translatome, también utilizan la técnica de ultracentrifugación [98, 99]. La ultracentrifugación también ha demostrado ser útil para la nanotecnología relacionada con los ácidos nucleicos o Origami de ADN, donde la ultracentrifugación en gradientes de glicerol se ha utilizado como un buen complemento a los métodos de purificación por electroforesis en gel de agarosa más convencionales y establecidos [100].

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Durante décadas, la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) fue el método estándar para purificar grandes cantidades de ARN (escala de microgramo a miligramo) con resolución de un solo nucleótido, ya que se puede aplicar fácilmente a una amplia gama de tamaños de ARN y requiere una configuración mínima con un costo -reactivos efectivos. Como todas las técnicas electroforéticas, PAGE usa una malla polimérica para separar moléculas por tamaño y / o conformación, ya que las macromoléculas cargadas migran a través de un campo eléctrico. La malla se prepara mediante polimerización de una solución de acrilamida / bisacrilamida. Las concentraciones de monómeros de acrilamida / bisacrilamida se pueden variar para obtener el tamaño de poro deseado y el poder de resolución en la malla final. Las concentraciones típicas de monómeros oscilan entre el 5% y el 20% para geles de ARN con una relación relativa de acrilamida / bisacrilamida 1:19. En este rango, los ARN de longitud corta a intermedia (5-500 nucleótidos) pueden resolverse [101]. La solución de acrilamida se puede complementar con un agente desnaturalizante (más comúnmente urea 8 M, llamada "PAGE desnaturalizante") para desplegar completamente el ARN migrante y separar las moléculas únicamente por tamaño. Con este enfoque, la resolución de un solo nucleótido se puede lograr fácilmente en preparaciones a gran escala y es un método analítico común. Cuando no se utiliza ningún agente desnaturalizante y el aparato de electroforesis se enfría externamente para evitar el sobrecalentamiento causado por la corriente eléctrica que fluye a través del gel, se pueden resolver los confórmeros con diferentes radios hidrodinámicos de una construcción de ARN determinada. Este es también el principio subyacente de los ensayos de cambio de movilidad electroforética [ 102]. El aislamiento del ARN de interés se obtiene mediante la escisión de la banda de interés del gel, seguida de electroelución o extracción por aplastamiento y remojo [103]. La escisión en gel se usa de manera rutinaria y solo requiere una lámpara UV para identificar la banda de interés mediante sombreado UV sobre papel fluorescente y un bisturí para extirpar la banda. La banda escindida se trata luego para permitir la difusión del ARN desde la malla de gel a la solución, y el ARN se purifica posteriormente mediante precipitación con etanol y se resuspende en un tampón de elección. Recientemente se ha abordado el impacto de la sombra UV en la integridad del ARN, revelando que las lámparas y los tiempos de exposición de uso común pueden provocar un fotodaño mínimo pero detectable de la muestra y, por lo tanto, potencialmente corromper los estudios estructurales posteriores [104]. La electroelución requiere un aparato dedicado que permita la recolección de las especies correspondientes a la banda de interés que se eluye de las piezas de gel. La PAGE preparativa de ARN se ha utilizado durante décadas, y su uso se ha descrito bien en los libros de texto; sin embargo, recientemente se ha publicado un protocolo paso a paso más completo que se centra en la preparación de ARN para la aplicación de biología estructural [105].

Cromatografía líquida

Las técnicas de cromatografía líquida están bien establecidas para la purificación y análisis de ácidos nucleicos y oligonucleótidos que abarcan una amplia gama de tamaños. Sobre la base del concepto de permitir que los solutos en un solvente (fase móvil) corran a través de una columna que contiene un material sólido (fase estacionaria) que interactúa con los solutos en diferente medida, se logra la separación [106]. Aquí nos centramos en los métodos cromatográficos que son relevantes para la preparación de muestras de ARN (Fig. 4). Entre las técnicas de separación por sorción comúnmente utilizadas para la separación de ácidos nucleicos se encuentran HPLC de emparejamiento de iones de fase inversa (RP-IP-HPLC), HPLC de intercambio iónico (IE-HPLC) y cromatografía líquida de intercambio iónico de rendimiento rápido (IE-FPLC). ) [107]. Últimamente, los métodos de cromatografía de afinidad, que pertenecen a la categoría de técnicas de sorción, se han utilizado cada vez más para la preparación de ARN. Además, hay ejemplos de métodos de purificación de ARN exitosos que utilizan cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), en los que las moléculas se separan en función del tamaño molecular en lugar de interacciones químicas con la fase estacionaria [106]. Todas estas técnicas y su relevancia para la preparación de muestras de ARN se han revisado recientemente [46, 108,109,110,111]. A continuación se ofrece una descripción más detallada de los diferentes métodos.

Métodos de cromatografía líquida. a Cromatografía de emparejamiento de iones en fase inversa, la fase estacionaria lipófila retiene el ARN gracias a un agente de emparejamiento de cationes lipófilos (se representa el tetrabutilamonio). B En la cromatografía de intercambio iónico, una fase estacionaria cargada positivamente interactúa y retiene las moléculas de ARN cargadas negativamente. C Cromatografía de afinidad: una fase estacionaria funcionalizada con poliuridina (poli (U)) interactúa selectivamente con las colas de poliadenosina (poli (A)) de los ARN mensajeros (ARNm). D Cromatografía de exclusión por tamaño Los ARN grandes se eluyen a través del medio poroso de la fase estacionaria con tiempos de retención cortos, y los ARN más pequeños se absorben en el medio poroso, lo que resulta en tiempos de retención más largos.

Cromatografía líquida de alta resolución con emparejamiento de iones en fase inversa

Esta técnica se basa en el uso de cationes lipófilos. Se utilizan comúnmente compuestos de amonio cuaternario que se emparejan con la estructura de azúcar-fosfato cargada negativamente del oligonucleótido. Estos complejos de pares de iones se vuelven lipofílicos y pueden interactuar con la fase estacionaria de una columna de cromatografía de fase inversa (Fig. 4a). El complejo de oligonucleótidos lipófilos, una vez unido a la columna, se eluye y se separa con un gradiente de disolvente orgánico, normalmente con acetonitrilo [107]. Como se describió anteriormente [108, 109], aunque RP-IP-HPLC se ha utilizado con éxito para la separación de oligonucleótidos durante casi 40 años para cantidades más pequeñas de material (escala analítica), la ampliación del método es rara (escala preparativa). Se pueden encontrar ejemplos de métodos de emparejamiento de iones en fase inversa, que purifican cantidades mayores de oligonucleótidos, en la escala preparativa de alrededor de 1 mg [112, 113], pero para estos y otros ejemplos similares, el material purificado son exclusivamente oligonucleótidos sintéticos, que ya son inherentemente puro. Los métodos RP-IP-HPLC se desarrollan comúnmente con fines analíticos [114, 115]. Algunos trabajos recientes en la escala analítica también podrían ser aplicables a la preparación de muestras de ARN: por ejemplo, RP-IP-HPLC se ha utilizado para analizar y purificar ARN bicatenario (dsRNA) a partir de material expresado en E. coli [116]. En este trabajo se extrajo el ARN total de las bacterias y se analizó mediante RP-IP-HPLC. Se aprovechó el hecho de que el ARN monocatenario se puede degradar posteriormente para aislar el ARNdc. Este método ejemplifica la usabilidad de RP-IP-HPLC para evaluar la presencia y pureza de dsRNA así como el RNA nativo de la célula (por ejemplo, separación de tRNAs y los diferentes RNAs ribosómicos). Otro método aborda la separación de estereoisómeros para producir de forma sintética ARN que contienen grupos fosforotioato en el esqueleto mediante RP-IP-HPLC [117]. Este trabajo muestra que es posible separar estereoisómeros usando químicos de apareamiento de iones de fase inversa y agentes de apareamiento de iones clásicos. El acetato de trietilamina en combinación con el modificador orgánico acetonitrilo fue la combinación más exitosa.

Cromatografía líquida de intercambio iónico de alta resolución

Al igual que el método RP-IP-HPLC, IE-HPLC e IE-FPLC están igualmente establecidos como una técnica para la separación de oligonucleótidos. En esta técnica, la fase estacionaria ya contiene los grupos catiónicos con los que el oligonucleótido aniónico interactúa y se une (Fig. 4b). A continuación, el polímero se eluye y se separa en la columna con el uso de un gradiente de sal [107]. IE-HPLC se ha utilizado con éxito en el campo de la biología estructural del ARN, y IE-FPLC [109, 118] podría ser una de las opciones más atractivas para purificar cantidades de miligramos de ARN transcrito in vitro. Sin embargo, incluso con este método, las transcripciones abortivas pueden estar presentes en el material purificado final para moléculas de menos de 30 nucleótidos cuando se comienza con una muestra de ARN heterogénea. IE-HPLC también se ha utilizado con éxito junto con trans- ribozimas de cabeza de martillo que actúan (ver “Escisión de ribozimas y ligadura de T4”) para purificar el ARN transcrito in vitro en una escala de miligramos [62]. El hecho de que la ribozima sea trans-actuar puede hacer que este enfoque sea atractivo para purificar muestras de ARN marcadas isotópicamente, ya que la ribozima de escisión se puede transcribir sin marcar en una reacción de transcripción completamente independiente. Se han revisado varios aspectos importantes de IE-HPLC con respecto a cómo diferentes cationes soportan diferentes confórmeros de ARN que posteriormente influyen en la separación de IE-HPLC [119].

Técnicas de cromatografía de afinidad

Como se indicó anteriormente, la técnica de cromatografía de afinidad cae dentro de la categoría de técnicas de sorción, es decir, el compuesto que se va a separar interactúa químicamente con la fase estacionaria (Fig. 4c). La principal diferencia en comparación con la cromatografía de intercambio iónico y de fase inversa es que el modo de interacción entre el analito y la fase estacionaria es muy específico y, a menudo, se inspira en interacciones biológicas [120]. El tipo de moléculas en la fase estacionaria, los ligandos de afinidad, que interactúan con la molécula que se va a separar en la fase móvil, pueden diferir ampliamente: anticuerpos, proteínas, oligonucleótidos, colorantes, grupos boronato o iones metálicos quelados están unidos a un sólido. soporte como perlas de agarosa o material de sílice y constituyen la fase estacionaria [121]. Esta versatilidad de las fases estacionarias ha dado lugar a una serie de diferentes enfoques de purificación de ARN, algunos de los cuales se revisaron recientemente [111]. A menos que el ARN que se va a purificar contenga de forma natural una secuencia con fuerte afinidad por una diana que pueda inmovilizarse en la fase estacionaria, el ARN se puede etiquetado con una secuencia específica para hacerlo, análoga a la etiqueta de polihistidina utilizada en la ciencia de las proteínas. Hay varias formas de lograrlo. Las etiquetas de afinidad se pueden desarrollar mediante la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) [122]. Un enfoque desarrolló secuencias de ARN que se unen a estreptavidina y Sephadex. El ARN marcado se eluyó del ligando de afinidad mediante la unión competitiva del ligando natural d-biotina o dextrano [123]. En otro enfoque elegante, la etiqueta se puede combinar con ribozima activada por compuesto para escindir el producto de interés de la fase estacionaria [124].

Cromatografía de exclusión por tamaño

Como su nombre lo indica, la separación SEC se basa en la diferencia de tamaño o radio hidrodinámico de las moléculas. Cuando se utiliza una fase estacionaria porosa, las moléculas grandes no pueden entrar en los poros y pasan a través de la fase estacionaria, mientras que las moléculas más pequeñas quedan retenidas (Fig. 4d). Sobre la base de este principio, se logra la separación y las moléculas más grandes se eluyen primero [106]. Los sistemas SEC se han utilizado con éxito para la preparación de muestras de ARN a escala preparativa [125, 126]. Se han investigado efectos importantes de la estructura del ARN, como la influencia de la estructura secundaria de oligonucleótidos y su influencia en las separaciones de SEC [127]. Para los oligonucleótidos de fosforotioato, se han investigado recientemente las propiedades de separación de SEC [128]. Este trabajo concluyó que los oligonucleótidos de fosforotioato pueden separarse de manera eficiente mediante SEC, aunque esto se complica por la lipofilicidad adicional causada por los átomos de azufre en la columna vertebral del oligonucleótido.


Conceptos básicos de la transcripción in vitro

La transcripción in vitro utiliza ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago, como la ARN polimerasa de T7, T3 o SP6, para sintetizar ARN a partir de una plantilla de ADN. El ADN molde para reacciones de transcripción in vitro incluye un promotor de ARN polimerasa cadena arriba de la secuencia de interés. La ARN polimerasa correspondiente se usa luego para producir transcritos de ARN sintéticos para su uso como sondas de hibridación, como plantillas para aplicaciones de traducción in vitro o en estudios estructurales (cristalografía de rayos X y RMN). Las transcripciones de ARN sintetizado también se utilizan para estudiar la funcionalidad del ARN celular en procesos tales como empalme, procesamiento de ARN, transporte intracelular, infectividad viral y traducción.


FONDOS

Financiamiento para el cargo de acceso abierto: Oxford University Press ha renunciado al cargo por publicación de acceso abierto para este artículo; los miembros del Consejo Editorial de NAR tienen derecho a un artículo gratis por año en reconocimiento a su trabajo en nombre de la revista.

Declaracion de conflicto de interes. Ninguno declarado.

Dirección actual: Sonja Petkovic, Institut für Molekulare Medizin, UK S-H, Campus Lübeck, Universität zu Lübeck, Ratzeburger Allee 160, 23538 Lübeck, Alemania.


MICROPROPAGACIÓN Y EL PAPEL DEL AGENTE GELANTE

Coordinadores: Barbara M. Reed, USDA, Valerie C. Pence, Cincinnati Zoo and Botanical Gardens, y Michael J. Bosela, Indiana University-Purdue University en Fort Wayne

1:30 p. M. - 3:00 p. M.
Simposio de plantas Gran 1

El papel de los agentes gelificantes en la respuesta de plantas y células en cultivo a menudo se pasa por alto. Este simposio explorará los efectos de los distintos tipos de agentes gelificantes sobre la micropropagación y la regeneración. Aparte de los efectos obvios sobre la disponibilidad de agua y la dureza del medio, los agentes gelificantes pueden afectar la disponibilidad de nutrientes y, en el caso del agar, las fracciones no gelificantes del producto (agaropectina, alginato, etc.) pueden influir en la morfogénesis de la planta. Esta sesión también proporcionará información básica sobre la química de los agentes gelificantes, incluida una evaluación de sus requisitos de pH y sal, y discutirá cuestiones de variabilidad del producto tanto entre fabricantes como entre lotes.

1:30 Introducción (B. M. Reed, V. C. Pence y M. J. Bosela)
1:35 P-4 El ABC de los geles de polisacáridos
Rengaswami Chandrasekaran
, Purdue Universidad Whistler Centrar para la investigación de carbohidratos
2:00 P-5 Modificación del agente gelificante para la multiplicación de brotes axilares a gran escala y la embriogénesis somática de Pinus radiata para la silvicultura comercial
Dale Smith,Meta genética
2:25 P-6 Una revisión de los agentes gelificantes utilizados para el cultivo de tejidos vegetales: sus fuentes y características
Ken Torres, PhytoLaboratorios de tecnología
2:50 Discusión


Amplificación de ADN isotérmico in vitro: el sistema de amplificación dependiente de helicasa

Desde el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación de ácidos nucleicos ha surgido como una herramienta elemental para la biología molecular, la genómica y la biotecnología. Los métodos de amplificación a menudo utilizan ciclos de temperatura para amplificar exponencialmente los ácidos nucleicos; sin embargo, también se han desarrollado métodos de amplificación isotérmica que no requieren calentar el ácido nucleico bicatenario para disociar los productos sintetizados de las plantillas. Entre los diversos métodos utilizados para la amplificación del ADN isotérmico, en esta revisión se analiza la amplificación dependiente de helicasa (HDA) con énfasis en el sistema de replicación del ADN reconstituido. Dado que la ADN helicasa puede desenrollar el ADN de doble hebra sin necesidad de calentarlo, el sistema HDA proporciona una herramienta muy útil para amplificar el ADN in vitro en condiciones isotérmicas con un esquema de reacción simplificado. Esta revisión describe los componentes y los aspectos detallados de los sistemas HDA actuales que utilizan Escherichia coli Helicasa UvrD y helicasa gp4 del bacteriófago T7 teniendo en cuenta la procesividad y la eficacia de la amplificación del ADN.

Esta es una vista previa del contenido de la suscripción, acceda a través de su institución.


COMENTARIO

Información de contexto

Los protocolos presentados en este artículo se basan en métodos de producción de muestras publicados previamente por nuestro grupo (Feyrer et al., 2020 Karlsson et al., 2020). Son una consolidación de los avances previos de la producción de ARN con T7 IVT y se agrupan en un protocolo coherente y robusto. Además, describimos cómo diseñar un fragmento de ARN, que debería preservar la estructura de un ARN biológico más grande para estudios estructurales (Fig. 1). Este enfoque compara la estructura simulada del ARN nativo más grande con la del fragmento de interés que se va a producir. Las simulaciones se realizan con el software MC-Fold, ya que tiene en cuenta los pares de bases no canónicos. Se puede hacer una inferencia sobre la estabilidad termodinámica y el conjunto conformacional de ambas construcciones de ARN analizando las estructuras simuladas en un amplio rango de energía (Fig. 2). Usando este enfoque, la probabilidad de un plegado correcto del fragmento de ARN producido puede aumentarse antes de comenzar la producción de la muestra.

A pesar de las muchas ventajas del enfoque descrito, el método tiene varias limitaciones. La predicción de la estructura secundaria no puede garantizar un plegado exacto, lo que deja cierta incertidumbre y la necesidad de un mayor sondeo de la estructura. Además, incluso con la introducción de secuencias 5'-GG o utilizando el enfoque de transcripción en tándem, la dependencia de la secuencia no se puede eliminar por completo, dando lugar a una cierta variación en el rendimiento entre diferentes construcciones de ARN. Además, el paso de HPLC RP-IP reduce el desgaste de la columna IE, pero agrega más tiempo al protocolo e incluso puede provocar la pérdida de producto. A lo largo de los protocolos, hemos sugerido sistemáticamente el uso de geles de poliacrilamida teñidos con bromuro de etidio. A pesar de los conocidos peligros para la salud de estos productos químicos y del hecho de que ahora se dispone de alternativas más modernas como la serie SYBR® de tinciones de ácidos nucleicos, hemos elegido el bromuro de etidio para la tinción debido a su robustez y facilidad de uso. Se ha realizado una discusión detallada sobre el uso de bromuro de etidio (Karlsson et al., 2020). Sin embargo, los protocolos de tinción que utilizan tinciones diferentes proporcionan una sensibilidad similar y no limitan la aplicabilidad del protocolo.

Parámetros críticos

Diseño de construcción y secuencia

El desempeño de la reacción de transcripción de T7 dependerá de la secuencia del ARN a transcribir. Como se menciona en el Protocolo básico 1, una secuencia que comience con 5′-GG se transcribirá mejor (Price et al., 1995). Como se enfatiza en el Protocolo básico 1, es importante considerar el comportamiento de plegado de posibles productos de eliminación y adición. Incluso si los protocolos descritos aquí darán como resultado fracciones finales de alta pureza, los productos de deleción y adición pueden estar presentes hasta cierto punto.

Diseño de guía de escote

La transcripción en tándem sobresale sobre la IVT convencional porque la RNasa H produce sitios de escisión más precisos que la polimerasa T7 que produce extremos 5 'y 3' definidos. Por tanto, la escisión fuera del objetivo debido a la unión inespecífica de la guía de escisión es perjudicial para el método. Examine la secuencia en busca de coincidencias complementarias del fragmento de ADN central y en las regiones flanqueantes. Sin embargo, no hemos experimentado este problema, Duss, Maris, von Schroetter y Allain (2010) mencionaron que extender los flancos puede aumentar la especificidad en caso de clivaje incompleto o fuera del objetivo.

Optimización de la transcripción in vitro

El objetivo de los pasos de optimización de IVT (Protocolo básico 2 pasos 8 a 11) es maximizar el rendimiento de la transcripción de ARN en relación con la cantidad / costo de los reactivos. En los protocolos descritos aquí, cuando se utiliza electroforesis analítica en gel con tinción con bromuro de etidio e iluminación UV para evaluar la reacción, es importante no sobreinterpretar los resultados del gel. Es decir, debe tenerse en cuenta que variaciones de concentración bastante grandes pueden dar lugar a bandas de apariencia similar en un gel teñido, dependiendo de la precisión de la carga, la eficacia de la tinción y los productos secundarios. Una vez que una condición permite una transcripción clara y da como resultado bandas intensas en el gel, elija esa condición, especialmente si requiere cantidades más pequeñas de reactivos costosos.

Escisión de RNasa H

En el caso de una IVT en tándem exitosa, todo el transcrito se puede escindir en ARN diana de longitud completa, dejando solo las regiones espaciadoras 5 'y 3', que contienen la secuencia de inicio y el residuo del sitio de restricción, respectivamente. Ninguna especie de mayor peso molecular debería ser visible en una PÁGINA analítica.

Sistema de HPLC

Para un resultado satisfactorio de los protocolos, es importante que el sistema de HPLC se equilibre correctamente. Si las columnas de HPLC están correctamente equilibradas, la reproducibilidad entre inyecciones suele ser alta, y las regiones de los cromatogramas en los que eluye el transcrito principal son casi idénticas entre inyecciones si se inyectan cantidades iguales.

Rutinas de trabajo libres de ARNasa

A lo largo de todos los pasos del protocolo, es importante asegurarse de que el sistema de HPLC y el equipo de laboratorio para el IVT, los pasos de intercambio de tampones y otros pasos estén libres de RNasas. La mejor manera de garantizar esto es, además de las rutinas habituales de técnicas estériles (p. Ej., Etanol, guantes), limpiar los espacios de trabajo y el equipo con etanol al 95% y productos de eliminación de ARNasa como RNaseZap.

Electroforesis analítica en gel (PAGE)

Las fracciones de HPLC en los Protocolos básicos 3 y 4 se analizan con electroforesis analítica en gel. Lo que es importante considerar durante la tinción en gel de las fracciones de HPLC son los efectos de dilución del uso de HPLC y que las transcripciones de contaminantes pueden ser poco visibles en un gel de una fracción de HPLC, pero una vez agrupadas y concentradas en una muestra final, pueden aparecer con mayor claridad. . It is important to keep this in mind when choosing fractions to pool for further processing.

Troubleshooting

Table 2 outlines some common problems that users may encounter when following the protocols, their likely causes, and potential solutions.

Problema Possible reason Solution
Poor or no transcription (standard IVT) Erroneous transcription reaction stock solutions RNA degradation RNase contamination unsuitable reaction conditions failed DNA template annealing Prepare new stock solutions of reactants change reaction conditions test enzyme of other supplier check DNA template on gel for correct size and purity run IVT reaction that has worked before as a positive control consider tandem IVT
Poor or no transcription (plasmid IVT) As above for standard IVT unsuccessful linearization Test linearization on agarose gel
Incomplete RNase H cleavage Cleavage guide or RNase H concentration too low or time too short Heat to 95°C for 2 min and cool slowly add more iPPase and RNase H for 1 hr
Small peak in chromatogram loss of material during concentration steps Leakage through concentrator membrane during concentration steps Check A260 of concentrator flow-through use concentrator filter unit for shorter time ensure acetonitrile content is below limit specified by manufacturer
Gel contains unexpected bands when loading concentrated material HPLC purifications dilute the RNA material, so when loading a fraction contaminant bands might be poorly visible on gel Consider possible dilution effects when analyzing HPLC fractions and choosing fractions to pool together as sample
Nonhomogeneous migration of bands on gel Temperature differences within gel during running high salt content Fill gel apparatus with water to even out temperature within gel clean gel wells quickly before loading
RNA does not bind to HPLC column Column is poorly equilibrated HPLC buffer system is erroneous Re-equilibrate column expose column to larger amount of eluting buffers check HPLC buffers
Retention time shift RNA elutes in wrong part of gradient Column is poorly equilibrated HPLC buffer system is erroneous Re-equilibrate column expose column to larger amount of eluting buffers check HPLC buffers clean HPLC system
  • A260, absorbance at 260 nm HPLC, high-performance liquid chromatography iPPase, inorganic pyrophosphatase IVT, in vitro transcription.

Comprensión de los resultados

The ultimate goal of the protocols described here is to obtain an RNA sample of high enough purity for the user's needs. One starts with creating a suitable sample that contains the region of interest (Basic Protocol 1) as shown in Figure 1. An example of how to evaluate the selection of the correct construct is shown in Figure 2. This is a flexible protocol, with options to use different protocols for RNA transcription (Basic Protocol 2 and Alternate Protocol). Use of Basic Protocol 4 or a combination of Basic Protocols 3 and 4 offers additional flexibility and the possibility to produce even poorly transcribing RNA with high yield and purity. The examples provided in Figures 3, 5, and 6 show gels and chromatograms from the optimization and purification of a 29mer RNA, which ultimately had a yield of 5.6%, corresponding to 1.8 mg of RNA material. Figure 3 demonstrates the impact of reactant concentration on transcription performance (e.g., increasing DMSO suppresses transcription, resulting in reduced band intensity). This figure therefore indicates the need for optimization of reaction conditions in Basic Protocol 2 and shows how to elucidate and interpret the results thereof. The Alternate Protocol, on the other hand, does not require such an optimization as the template size allows for a sequence-independent IVT.

Figure 5 illustrates the purity distribution of HPLC fractions from the RP-IP purification procedure described in Basic Protocol 3. The red line in Figure 5B indicates fractions under the target peak in the chromatogram in Figure 5A. The main band, representing the target, is enriched compared with the complete IVT mixture however, shorter and longer products are still present. As these fractions will have reduced concentrations of side products and IVT reactants, a more efficient preparation can be achieved in Basic Protocol 4. Finally, Figure 6B shows pure HPLC fractions the user can obtain by following Basic Protocols 3 and 4 together. Figure 6C shows both the final pure and less pure RNA fractions that have been combined and analyzed at high concentration by denaturing PAGE to visualize how abundant side products in the final material are. The 29mer sample—exemplified in Figures 3, 5, and 6—was transcribed with RNA with a 5′-GG, which increased the overall yield. It is also possible to purify longer RNAs with this method (Karlsson et al., 2020 ).

Time Considerations

We estimate that sequence design and IVT optimization (Basic Protocols 1 and 2) can be done in 5 working days, not considering delivery time of DNA templates (oligos or plasmids). Workup and RP-IP purification (Basic Protocol 3) of a large-scale (∼10-ml) transcription reaction could be done in 2 to 3 working days, and a similar amount of time could be estimated for Basic Protocol 4. An estimate of the total time from large-scale transcription reaction to final sample is thus around 1 week. Bacterial amplification of plasmids requires ∼3 days. Once enough plasmid has been purified, the Alternate Protocol and Basic Protocol 4 together can be done in 4 days from the linearization reaction to obtaining pure and clean RNA product.

Expresiones de gratitud

The authors thank the Swedish Foundation for Strategic Research (project no. ICA14-0023 and FFL15-0178), the Swedish Research Council (2014-04303 and 2018-00250), the Ragnar Söderberg Foundation (M91/14), the Karolinska Institutet (KI FoAss and KID 2-3707/2013), and the Department of Medical Biochemistry and Biophysics (for support for the purchase of a 600-MHz Bruker NMR spectrometer). The authors thank the protein science facility (PSF) at the Karolinska Institutet for expression and purification of T7 RNA polymerase and E. coli RNase H and Martin Hällberg for the generous gift of the inorganic phosphatase. The authors also thank Andrea Coulthard Sørensen for contributing during the IVT optimization of the 29mer RNA exemplified in Figure 3.

Contribuciones de autor

Hampus Karlsson: conceptualization, data curation, investigation, methodology, writing–original draft, writing–review and editing. Hannes Feyrer: conceptualization, data curation, investigation, methodology, writing–original draft, writing–review and editing. Lorenzo Baronti: conceptualization, data curation, investigation. Katja Petzold: conceptualization, investigation, methodology, project administration, resources, supervision, writing–review and editing.

Conflict of Interest

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.


Ver el vídeo: La Fecundación in vitro explicada con sencillez (Agosto 2022).