Información

¿Cómo puedo describir la ejecución de una solución cuatro veces a través de una unidad de cromatografía (en una instrucción)?

¿Cómo puedo describir la ejecución de una solución cuatro veces a través de una unidad de cromatografía (en una instrucción)?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estoy traduciendo un documento del ruso:

El tiempo medio de retención para las primeras cuatro inyecciones de RNasa debe ser (40,8 ± 2) min. Si el RT medio está más allá de este rango, ajuste el sistema de gradiente (cambie el contenido de acetonitrilo dentro del rango del 20% al 32%) y cromatógrafo la solución de RNasa cuatro veces.

Soy consciente de que no usamos cromatógrafo como verbo en inglés generalmente, pero lo usamos en ruso de esta manera. ¿Cuál sería la expresión inglesa genérica para esto, utilizable en una descripción de procedimiento? Se que tenemos la palabra correr pero esto podría ser demasiado coloquial para un periódico oficial.


Yo diría simplemente:

repita la cromatografía cuatro veces

o menos formal, pero bastante aceptable:

vuelva a ejecutar la columna (o lo que sea) cuatro veces

Esto pone el énfasis en el proceso.

Pero no estoy exactamente seguro de lo que está pasando. Tiene cuatro inyecciones de ARNasa. Si no son correctos, ¿repite cada uno una vez o qué? Si es el primero, entonces sería:

repita la cromatografía (o vuelva a ejecutar la columna) para cada muestra


Yo seguiria usandoinyectarpara describir la carga de muestras en el sistema de cromatografía líquida y reemplazar

cromatografiar la solución de ARNasa cuatro veces.

con

inyecte la solución de ARNasa otras cuatro veces.


Comprender la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo de retención relativo

El tiempo de retención (RT) es una medida del tiempo que tarda un soluto en pasar a través de una columna de cromatografía. Se calcula como el tiempo desde la inyección hasta la detección.

El RT de un compuesto no es fijo, ya que muchos factores pueden influir en él incluso si se utilizan el mismo GC y columna. Éstos incluyen:

  • El caudal de gas
  • Diferencias de temperatura en el horno y la columna.
  • Degradación de la columna
  • Longitud de la columna

Estos factores pueden dificultar la comparación de los tiempos de retención. Incluso si usa el mismo GC con solo unos días de diferencia, puede haber pequeñas diferencias en el tiempo de retención de un compuesto.


Resumen de cromatografía de capa fina

Coloque una pequeña porción de solvente ( (5 ) - (10 ​​: text) para esta cámara) en una cámara de TLC con tapa, junto con un trozo de papel de filtro cortado.

Disuelva las muestras líquidas o sólidas (1 gota por ( sim 1 : text) disolvente) utilizando un disolvente de bajo punto de ebullición (por ejemplo, acetona o diclorometano).

Dibuja una línea de lápiz en un plato TLC ( sim 1 : text) desde abajo con una regla y marque los carriles.

No coloque carriles demasiado cerca del borde o entre sí.

Ubique una muestra diluida en la línea de lápiz del carril correcto, haciendo manchas muy pequeñas ( (2 : texto) en diámetro).

Enjuague el quitamanchas con un solvente (por ejemplo, acetona) si lo va a usar para otra muestra.

Coloque la muestra en la cámara de TLC con unas pinzas, tápela y déjela en paz.

Retire la placa cuando la línea de disolvente sea ( sim 0.5 : text) desde la parte superior.

Marque inmediatamente la línea de disolvente con un lápiz.

Tabla 2.3: Resumen de procedimiento para TLC.


Técnicas de separación: Cromatografía

La cromatografía es una técnica biofísica importante que permite la separación, identificación y purificación de los componentes de una mezcla para análisis cualitativo y cuantitativo. Las proteínas se pueden purificar en función de características como el tamaño y la forma, la carga total, los grupos hidrófobos presentes en la superficie y la capacidad de unión con la fase estacionaria. Cuatro técnicas de separación basadas en características moleculares y tipo de interacción utilizan mecanismos de intercambio iónico, adsorción superficial, partición y exclusión por tamaño. Otras técnicas de cromatografía se basan en el lecho estacionario, incluida la cromatografía en columna, en capa fina y en papel. La cromatografía en columna es uno de los métodos más comunes de purificación de proteínas.

La cromatografía se basa en el principio según el cual las moléculas en mezcla aplicadas sobre la superficie o en el sólido, y la fase estacionaria fluida (fase estable) se separan entre sí mientras se mueven con la ayuda de una fase móvil. Los factores efectivos en este proceso de separación incluyen características moleculares relacionadas con la adsorción (líquido-sólido), la partición (líquido-sólido) y la afinidad o diferencias entre sus pesos moleculares [1, 2]. Debido a estas diferencias, algunos componentes de la mezcla permanecen más tiempo en la fase estacionaria y se mueven lentamente en el sistema cromatográfico, mientras que otros pasan rápidamente a la fase móvil y abandonan el sistema más rápidamente [3].

Sobre la base de este enfoque, tres componentes forman la base de la técnica de cromatografía.

Fase estacionaria: Esta fase siempre está compuesta por una fase & # x0201csolid & # x0201d o una capa & # x0201ca de un líquido adsorbido en la superficie de un soporte sólido & # x0201d.

Fase móvil: esta fase siempre se compone de & # x0201cliquid & # x0201d o un & # x0201cgaseous componente. & # X0201d

El tipo de interacción entre la fase estacionaria, la fase móvil y las sustancias contenidas en la mezcla es el componente básico eficaz en la separación de moléculas entre sí. Los métodos de cromatografía basados ​​en la partición son muy eficaces en la separación e identificación de moléculas pequeñas como aminoácidos, carbohidratos y ácidos grasos. Sin embargo, las cromatografías de afinidad (es decir, cromatografía de intercambio iónico) son más eficaces en la separación de macromoléculas como ácidos nucleicos y proteínas. La cromatografía en papel se utiliza en la separación de proteínas, y en estudios relacionados con la síntesis de proteínas, la cromatografía gas-líquido se utiliza en la separación de grupos alcohol, éster, lípidos y amino, y en la observación de interacciones enzimáticas, mientras que se emplea la cromatografía de tamiz molecular. especialmente para la determinación de pesos moleculares de proteínas. La cromatografía en gel de agarosa se utiliza para la purificación de ARN, partículas de ADN y virus [4].

La fase estacionaria en cromatografía, es una fase sólida o una fase líquida que recubre la superficie de una fase sólida. La fase móvil que fluye sobre la fase estacionaria es una fase gaseosa o líquida. Si la fase móvil es líquida, se denomina cromatografía líquida (LC), y si es gas, se denomina cromatografía de gases (GC). La cromatografía de gases se aplica a gases y mezclas de líquidos volátiles y material sólido. La cromatografía líquida se utiliza especialmente para muestras térmicamente inestables y no volátiles [5].

El propósito de la aplicación de la cromatografía, que se utiliza como método de análisis cuantitativo, además de su separación, es lograr una separación satisfactoria en un intervalo de tiempo adecuado. Se han desarrollado varios métodos de cromatografía con ese fin. Algunos de ellos incluyen cromatografía en columna, cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía en papel, cromatografía de gases, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de permeación en gel, cromatografía líquida de alta presión y cromatografía de afinidad [6].

Tipos de cromatografía

Cromatografía de permeación en gel (tamiz molecular)

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

Cromatografía de columna

Dado que las proteínas tienen rasgos característicos diferentes como tamaño, forma, carga neta, fase estacionaria utilizada y capacidad de unión, cada uno de estos componentes característicos se puede purificar utilizando métodos cromatográficos. Entre estos métodos, se aplica con mayor frecuencia la cromatografía en columna. Esta técnica se utiliza para la purificación de biomoléculas. Sobre una columna (fase estacionaria) primero se aplica la muestra a separar, luego se aplica el tampón de lavado (fase móvil) (Figura 1). Su flujo a través del material interior de la columna colocado sobre un soporte de fibra de vidrio está asegurado. Las muestras se acumulan en la parte inferior del dispositivo de una manera dependiente del tiempo y del volumen [7].

Cromatografía de intercambio de iones

La cromatografía de intercambio iónico se basa en interacciones electrostáticas entre grupos de proteínas cargados y material de soporte sólido (matriz). La matriz tiene una carga iónica opuesta a la de la proteína a separar, y la afinidad de la proteína a la columna se logra con enlaces iónicos. Las proteínas se separan de la columna cambiando el pH, la concentración de sales iónicas o la fuerza iónica de la solución tampón [8]. Las matrices de intercambio iónico cargadas positivamente se denominan matrices de intercambio aniónico y adsorben proteínas cargadas negativamente. Mientras que las matrices unidas con grupos cargados negativamente se conocen como matrices de intercambio catiónico y adsorben proteínas cargadas positivamente (Figura 2) [9].

Cromatografía de intercambio de iones.

Cromatografía de permeación en gel (tamiz molecular)

El principio básico de este método es utilizar materiales que contienen dextrano para separar macromoléculas en función de sus diferencias de tamaño molecular. Este procedimiento se utiliza básicamente para determinar los pesos moleculares de las proteínas y para disminuir las concentraciones de sal de las soluciones de proteínas [10]. En una columna de permeación de gel, la fase estacionaria consta de moléculas inertes con poros pequeños. La solución que contiene moléculas de diferentes dimensiones se pasa continuamente con un caudal constante a través de la columna. Las moléculas más grandes que los poros no pueden penetrar en las partículas de gel y quedan retenidas entre las partículas dentro de un área restringida. Las moléculas más grandes atraviesan espacios entre partículas porosas y se mueven rápidamente a través del interior de la columna. Las moléculas más pequeñas que los poros se difunden en los poros y, a medida que las moléculas se hacen más pequeñas, abandonan la columna con tiempos de retención proporcionalmente más largos (Figura 3) [11]. El tipo Sephadeks G es el material de columna más utilizado. Además, también se utilizan dextrano, agorosa, poliacrilamida como materiales de columna [12].

Cromatografía de permeación en gel (tamiz molecular).

Cromatografía de afinidad

Esta técnica de cromatografía se utiliza para la purificación de enzimas, hormonas, anticuerpos, ácidos nucleicos y proteínas específicas [13]. Un ligando que puede formar un complejo con una proteína específica (dextrano, poliacrilamida, celulosa, etc.) se une al material de relleno de la columna. La proteína específica que forma un complejo con el ligando se une al soporte sólido (matriz) y se retiene en la columna, mientras que las proteínas libres abandonan la columna. Luego, la proteína unida abandona la columna mediante el cambio de su fuerza iónica mediante la alteración del pH o la adición de una solución salina (Figura 4) [14].

Cromatografía en papel

En el papel, el material de soporte de la cromatografía consiste en una capa de celulosa altamente saturada con agua. En este método, un papel de filtro grueso comprendía el soporte, y las gotas de agua asentadas en sus poros constituían la fase líquida estacionaria. La fase móvil consiste en un fluido apropiado colocado en un tanque de revelado. La cromatografía en papel es una cromatografía de & # x0201clíquido-líquido & # x0201d [15].

Cromatografía de capa fina

La cromatografía de capa fina es una cromatografía de & # x0201c adsorción sólido-líquido & # x0201d. En este método, la fase estacionaria es una sustancia adsorbente sólida que se recubre sobre placas de vidrio. Como material adsorbente se utilizan todas las sustancias sólidas. en cromatografía en columna (alúmina, gel de sílice, celulosa). En este método, la fase móvil se desplaza hacia arriba a través de la fase estacionaria. El disolvente sube por la placa delgada empapada con el disolvente por medio de la acción capilar. Durante este procedimiento, también impulsa la mezcla previamente caída en las partes inferiores de la placa con una pipeta hacia arriba con diferentes caudales. Así se consigue la separación de analitos. Esta tasa de desplazamiento ascendente depende de la polaridad del material, la fase sólida y el disolvente [16].

En los casos en que las moléculas de la muestra sean incoloras, se puede utilizar la fluorescencia, la radiactividad o una sustancia química específica para producir un producto reactivo de color visible para identificar sus posiciones en el cromatograma. La formación de un color visible se puede observar bajo luz ambiental o luz ultravioleta. La posición de cada molécula en la mezcla se puede medir calculando la relación entre las distancias recorridas por la molécula y el disolvente. Este valor de medición se llama movilidad relativa y se expresa con un símbolo RF. RF. El valor se utiliza para la descripción cualitativa de las moléculas [17].

Cromatografía de gases

En este método, la fase estacionaria es una columna que se coloca en el dispositivo y contiene una fase estacionaria líquida que se adsorbe sobre la superficie de un sólido inerte. La cromatografía de gases es una cromatografía de & # x0201c gas-líquido & # x0201d. Su fase portadora consta de gases como He o N2. La fase móvil que es un gas inerte se pasa a través de una columna a alta presión. La muestra a analizar se vaporiza y entra en una fase de fase móvil gaseosa. Los componentes contenidos en la muestra se encuentran dispersos entre la fase móvil y la fase estacionaria sobre el soporte sólido. La cromatografía de gases es una técnica simple, multifacética, altamente sensible y de rápida aplicación para la excelente separación de moléculas muy diminutas. Se utiliza en la separación de cantidades muy pequeñas de analitos [18].

Cromatografía de ligando colorante

El desarrollo de esta técnica se basó en la demostración de la capacidad de muchas enzimas para unir nucleótidos de purina para el colorante Cibacron Blue F3GA [19]. La estructura de anillo plano con grupos cargados negativamente es análoga a la estructura de NAD. Esta analogía ha sido evidenciada por la demostración de la unión del colorante Cibacron Blue F3GA a adenina, sitios de unión a ribosa de NAD. El tinte se comporta como un análogo de ADP-ribosa. La capacidad de unión de este tipo de adsorbentes es 10 & # x0201320 veces más fuerte que la de la afinidad de otros adsorbentes. En condiciones de pH adecuadas, elución con soluciones de alta fuerza iónica y utilizando la propiedad de intercambio iónico del adsorbente, las proteínas adsorbidas se separan de la columna [20, 21].

Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

En este método se utilizan los adsorbentes preparados como material de columna para la unión del ligando en cromatografía de afinidad. La técnica de HIC se basa en interacciones hidrofóbicas entre cadenas laterales unidas a la matriz cromatográfica [22, 23].

Cromatografía de pseudoafinidad

Algunos compuestos como colorantes de antraquinona y colorantes azoicos pueden usarse como ligandos debido a su afinidad, especialmente por deshidrogenasas, quinasas, transferasas y reductasas. El tipo más conocido de este tipo de cromatografía es la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) [24].

Cromatografía líquida de alta precisión (HPLC)

Con esta técnica de cromatografía es posible realizar análisis estructural, funcional y purificación de muchas moléculas en poco tiempo.Esta técnica produce resultados perfectos en la separación e identificación de aminoácidos, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, proteínas, esteroides. , y otras moléculas biológicamente activas. En HPLC, la fase móvil pasa a través de columnas a una presión atmosférica de 10 a 02013400 y con un caudal alto (0,1 a 020135 cm // s). En esta técnica, el uso de partículas pequeñas y la aplicación de alta presión sobre la tasa de flujo de disolvente aumenta el poder de separación de HPLC y el análisis se completa en poco tiempo.

Los componentes esenciales de un dispositivo de HPLC son depósito de disolvente, bomba de alta presión, columna preparada comercialmente, detector y registrador. La duración de la separación se controla con la ayuda de un sistema informático y el material se acumula [25].

Campos de aplicación de la cromatografía en medicina

La técnica de la cromatografía es una herramienta valiosa para los bioquímicos, además de que se puede aplicar fácilmente durante los estudios realizados en laboratorios clínicos. Por ejemplo, la cromatografía en papel se utiliza para determinar algunos tipos de azúcares y aminoácidos en fluidos corporales que están asociados con trastornos metabólicos hereditarios. La cromatografía de gases se utiliza en laboratorios para medir esteroides, barbitúricos y lípidos. La técnica cromatográfica también se utiliza en la separación de vitaminas y proteínas.

Conclusión

Inicialmente, se utilizaron técnicas cromatográficas para separar sustancias en función de su color, como era el caso de los pigmentos a base de hierbas. Con el tiempo, su área de aplicación se amplió considerablemente. Hoy en día, la cromatografía se acepta como un método de separación extremadamente sensible y eficaz. La cromatografía en columna es uno de los métodos útiles de separación y determinación. La cromatografía en columna es un método de purificación de proteínas realizado especialmente en base a uno de los rasgos característicos de las proteínas. Además, estos métodos se utilizan para controlar la pureza de una proteína. La técnica de HPLC, que tiene muchas características superiores, incluida especialmente su mayor sensibilidad, rápida tasa de rotación, su uso como método cuantitativo, puede purificar aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, antibióticos y esteroides.


Intercambiadores de iones fuertes o débiles

Tabla 3 muestra los grupos funcionales utilizados en los medios IEX. Los términos fuerte y débil se refieren al grado en que el estado de ionización de los grupos funcionales varía con el pH. Los términos fuerte y débil no se refieren a la fuerza con la que los grupos funcionales se unen a las proteínas.

Comience con un intercambiador fuerte para permitir que el trabajo de desarrollo se realice en un amplio rango de pH. Utilice un intercambiador de aniones fuerte (Q) para unir las proteínas de interés si su punto isoeléctrico está por debajo de pH 7,0 o es desconocido.

Utilice un intercambiador fuerte en aquellos casos en los que la resolución máxima se produce a un pH extremo y las proteínas de interés son estables a ese pH.

Considere usar un intercambiador débil si la selectividad del intercambiador de iones fuertes no es satisfactoria, pero recuerde que la capacidad de intercambio de iones de un intercambiador de iones débil varía con el pH. Como resultado:

  • La capacidad de carga (unión) de la muestra puede variar con el aumento del pH debido a la pérdida de carga del intercambiador.
  • la resolución se ve más fácilmente afectada por cambios en la velocidad de flujo o la carga de la muestra debido a las formas intermedias de interacción de carga que pueden ocurrir.
  • Los resultados predichos (basados ​​en información conocida sobre los componentes de la muestra, como sus puntos isoeléctricos y cómo su carga superficial neta cambia con el pH) pueden no correlacionarse con los resultados reales, ya que el número de grupos cargados en los intercambiadores de iones débiles puede variar con el pH.
  • Pueden ser necesarios tiempos de equilibrio más prolongados para valorar los grupos funcionales de intercambio iónico débiles.

Cuando utilice un intercambiador débil, trabaje dentro de los valores de pH que se indican a continuación para minimizar las variaciones en el rendimiento:


Detector

La tarea de la unidad detectora es registrar el tiempo y la cantidad de una sustancia que se eluye de la columna. El detector percibe el cambio en la composición del eluyente y convierte esta información en una señal eléctrica que se evalúa con la ayuda de una computadora. [1] Se encuentra disponible una variedad de detectores dependiendo de las características estructurales del analito. Las unidades detectoras comunes son detectores refractométricos, UV / VIS, electroquímicos y de fluorescencia. La figura 4 muestra dos configuraciones de sistema isocrático con diferentes detectores.


Usos de la cromatografía de gases

GC se utiliza como una prueba para ayudar a identificar los componentes de una mezcla líquida y determinar su concentración relativa. También se puede utilizar para separar y purificar componentes de una mezcla. Además, la cromatografía de gases se puede utilizar para determinar la presión de vapor, el calor de la solución y los coeficientes de actividad. Las industrias a menudo lo usan para monitorear procesos para probar la contaminación o garantizar que un proceso se desarrolle según lo planeado. La cromatografía puede analizar el alcohol en sangre, la pureza de los fármacos, la pureza de los alimentos y la calidad del aceite esencial. El GC se puede utilizar en analitos orgánicos o inorgánicos, pero la muestra debe ser volátil. Idealmente, los componentes de una muestra deberían tener diferentes puntos de ebullición.


Usos de la cromatografía de gases

  • Ayuda a identificar la composición de una mezcla líquida y averiguar la concentración relativa.
  • Ayuda a separar y purificar los componentes de una mezcla determinada.
  • Se utiliza para averiguar la presión de vapor, los coeficientes de actividad y el corazón de la solución.
  • Se utiliza para detectar procesos para verificar la contaminación y asegurarse de que el proceso se desarrolle de acuerdo con el plan.
  • También se puede usar para verificar el alcohol en sangre, la pureza de los alimentos, la pureza de los medicamentos y la calidad del aceite esencial. (4, 5 y 6)

Imagen 4: La imagen de arriba describe los diferentes componentes de la cromatografía de gases (diagrama).
Fuente de imagen:
bitesizebio.com


Cálculos

Caroteno (color amarillo anaranjado)
Rf = Distancia recorrida por el pigmento = 9,0 cm = 0,9375 Distancia recorrida por el disolvente 9,6 cm
Xantofilas (amarillo claro):
Rf = Distancia recorrida por el pigmento = 5,7 cm = 0,59375 Distancia recorrida por el disolvente 9,6 cm
Clorofila A (azul verde):
Rf = Distancia recorrida por el pigmento = 3,7 cm = 0,385416 Distancia recorrida por el disolvente 9,6 cm
Clorofila B (amarillo verde):
Rf = Distancia recorrida por el pigmento = 2,5 cm = 0,260416 Distancia recorrida por el disolvente 9,6 cm
Antocianina (rojo):
Rf = Distancia recorrida por el pigmento = 0,6 cm = 0,0625 Distancia recorrida por el disolvente 9,6 cm

¿Cómo funciona la cromatografía líquida de alto rendimiento?

Los componentes de un sistema básico de cromatografía líquida de alta resolución [HPLC] se muestran en el diagrama simple de la Figura E.

Un depósito contiene el solvente [llamado fase móvil, porque se mueve]. Se utiliza una bomba de alta presión [sistema de suministro de disolvente o gestor de disolvente] para generar y medir un caudal específico de fase móvil, típicamente mililitros por minuto. Un inyector [administrador de muestras o automuestreador] puede introducir [inyectar] la muestra en la corriente de fase móvil que fluye continuamente y que lleva la muestra a la columna de HPLC. La columna contiene el material de relleno cromatográfico necesario para efectuar la separación. Este material de empaque se denomina fase estacionaria porque se mantiene en su lugar mediante el hardware de la columna. Se necesita un detector para ver las bandas de compuestos separados a medida que eluyen de la columna de HPLC [la mayoría de los compuestos no tienen color, por lo que no podemos verlos con nuestros ojos]. La fase móvil sale del detector y puede enviarse a la basura o recogerse, según se desee. Cuando la fase móvil contiene una banda de compuesto separada, la HPLC proporciona la capacidad de recolectar esta fracción del eluato que contiene ese compuesto purificado para un estudio adicional. A esto se le llama cromatografía preparativa [discutida en la sección sobre Escala de HPLC].

Tenga en cuenta que los tubos y accesorios de alta presión se utilizan para interconectar los componentes de la bomba, el inyector, la columna y el detector para formar el conducto para la fase móvil, la muestra y las bandas compuestas separadas.

Figura E: Sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC]

El detector está conectado a la estación de datos de la computadora, el componente del sistema HPLC que registra la señal eléctrica necesaria para generar el cromatograma en su pantalla y para identificar y cuantificar la concentración de los componentes de la muestra (consulte la Figura F). Dado que las características de los compuestos de muestra pueden ser muy diferentes, se han desarrollado varios tipos de detectores. Por ejemplo, si un compuesto puede absorber luz ultravioleta, se usa un detector de absorbancia UV. Si el compuesto emite fluorescencia, se utiliza un detector de fluorescencia. Si el compuesto no tiene ninguna de estas características, se utiliza un tipo de detector más universal, como un detector de dispersión de luz por evaporación [ELSD]. El enfoque más poderoso es el uso de múltiples detectores en serie. Por ejemplo, se puede usar un detector de UV y / o ELSD en combinación con un espectrómetro de masas [MS] para analizar los resultados de la separación cromatográfica. Esto proporciona, a partir de una sola inyección, información más completa sobre un analito. La práctica de acoplar un espectrómetro de masas a un sistema de HPLC se denomina LC / MS.

Figura F: Un sistema típico de HPLC [Waters Alliance]

Operación HPLC
Una forma sencilla de entender cómo logramos la separación de los compuestos contenidos en una muestra es ver el diagrama de la Figura G.

La fase móvil entra en la columna por la izquierda, atraviesa el lecho de partículas y sale por la derecha. La dirección del flujo está representada por flechas verdes. Primero, considere la imagen superior que representa la columna en el momento cero [el momento de la inyección], cuando la muestra ingresa a la columna y comienza a formar una banda. La muestra que se muestra aquí, una mezcla de tintes amarillo, rojo y azul, aparece en la entrada de la columna como una única banda negra. [En realidad, esta muestra podría ser cualquier cosa que se pueda disolver en un disolvente, normalmente los compuestos serían incoloros y la pared de la columna opaca, por lo que necesitaríamos un detector para ver los compuestos separados a medida que eluyen].

Después de unos minutos [imagen inferior], durante los cuales la fase móvil fluye de manera continua y constante más allá de las partículas del material de empaque, podemos ver que los tintes individuales se han movido en bandas separadas a diferentes velocidades. Esto se debe a que existe una competencia entre la fase móvil y la fase estacionaria para atraer cada uno de los colorantes o analitos. Observe que la banda de tinte amarilla se mueve más rápido y está a punto de salir de la columna. Al tinte amarillo le gusta [se siente atraído por] la fase móvil más que a los otros tintes. Por lo tanto, se mueve a más rápido velocidad, más cercana a la de la fase móvil. A la banda de tinte azul le gusta más el material de empaque que la fase móvil. Su mayor atracción por las partículas hace que se mueva significativamente. Más lento. En otras palabras, es el compuesto más retenido en esta mezcla de muestra. La banda de tinte rojo tiene una atracción intermedia para la fase móvil y por lo tanto se mueve en un intermedio velocidad a través de la columna. Dado que cada banda de tinte se mueve a diferente velocidad, podemos separarla cromatográficamente.

Figura G: Comprensión del funcionamiento de una columna cromatográfica: bandas

¿Qué es un detector?
Cuando las bandas de colorante separadas abandonan la columna, pasan inmediatamente al detector. El detector contiene una celda de flujo que ve [detecta] cada banda compuesta separada contra un fondo de fase móvil [ver Figura H]. [En realidad, las soluciones de muchos compuestos a concentraciones analíticas típicas de HPLC son incoloras.] Un detector apropiado tiene la capacidad de detectar la presencia de un compuesto y enviar su señal eléctrica correspondiente a una estación de datos de computadora. Se hace una elección entre muchos tipos diferentes de detectores, dependiendo de las características y concentraciones de los compuestos que necesitan ser separados y analizados, como se discutió anteriormente.

¿Qué es un cromatograma?
Un cromatograma es una representación de la separación que se ha producido químicamente [cromatográficamente] en el sistema de HPLC. Se dibuja una serie de picos que se elevan desde una línea de base en un eje de tiempo. Cada pico representa la respuesta del detector para un compuesto diferente. El cromatograma es trazado por la estación de datos de la computadora [ver Figura H].

Figura H: Cómo se crean los picos

En la Figura H, la banda amarilla ha pasado completamente a través de la celda de flujo del detector, la señal eléctrica generada se ha enviado a la estación de datos de la computadora. El cromatograma resultante ha comenzado a aparecer en la pantalla. Tenga en cuenta que el cromatograma comienza cuando se inyecta la muestra por primera vez y comienza como una línea recta cerca de la parte inferior de la pantalla. Esto se denomina línea de base y representa la fase móvil pura que atraviesa la celda de flujo a lo largo del tiempo. A medida que la banda de analito amarilla pasa a través de la celda de flujo, se envía una señal más fuerte a la computadora. La línea se curva, primero hacia arriba y luego hacia abajo, en proporción a la concentración del tinte amarillo en la banda de la muestra. Esto crea un pico en el cromatograma. Una vez que la banda amarilla sale completamente de la celda del detector, el nivel de señal vuelve a la línea de base, la celda de flujo ahora tiene, una vez más, solo una fase móvil pura. Dado que la banda amarilla se mueve más rápido, eluyendo primero de la columna, es el primer pico dibujado.

Poco tiempo después, la banda roja llega a la celda de flujo. La señal se eleva desde la línea de base cuando la banda roja ingresa por primera vez a la celda y comienza a dibujarse el pico que representa la banda roja. En este diagrama, la banda roja no ha atravesado completamente la celda de flujo. El diagrama muestra cómo se verían la banda roja y el pico rojo si detuviéramos el proceso en este momento. Dado que la mayor parte de la banda roja ha pasado a través de la celda, se ha dibujado la mayor parte del pico, como lo muestra la línea continua. Si pudiéramos reiniciar, la banda roja pasaría completamente a través de la celda de flujo y se completaría el pico rojo [línea de puntos]. La banda azul, la más fuertemente retenida, viaja a la velocidad más lenta y eluye después de la banda roja. La línea de puntos le muestra cómo se vería el cromatograma completo si hubiéramos dejado que la ejecución continuara hasta su conclusión. Es interesante notar que el ancho del pico azul será el más ancho porque el ancho de la banda de analito azul, aunque más estrecho en la columna, se vuelve más ancho a medida que eluye de la columna. Esto se debe a que se mueve más lentamente a través del lecho de material de relleno cromatográfico y requiere más tiempo [y volumen de fase móvil] para ser eluido por completo. Dado que la fase móvil fluye continuamente a una velocidad fija, esto significa que la banda azul se ensancha y está más diluida. Dado que el detector responde en proporción a la concentración de la banda, el pico azul es más bajo en altura, pero más ancho.


Ver el vídeo: Clasificación de los métodos de separación en cromatografía (Agosto 2022).