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¿Cómo se almacenan las proteínas de membrana?

¿Cómo se almacenan las proteínas de membrana?


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Estamos produciendo algunas proteínas de membrana y no se pueden congelar ni descongelar incluso cuando agregamos glicerol. Las proteínas se solubilizan en detergente por encima de la cmc, por lo que deben estar en forma de micelas en solución. Actualmente, se llevan a cabo en 4C. Tengo curiosidad por saber cuál es la mejor manera de almacenarlos para un uso prolongado.


Trabajo con proteínas de membrana y, en mi experiencia, algunas proteínas se pueden congelar y descongelar sin ningún problema, otras proteínas simplemente no les gusta eso. Está relacionado con la estabilidad de la proteína. Si realmente necesita congelar la proteína, puede pensar en jugar con diferentes detergentes para ver si puede mejorar la estabilidad de la proteína.

Reglas generales: - congelar proteínas de membrana a -80 ° C sin glicerol - evitar ciclos de congelación-descongelación de proteínas, hacer alícuotas antes de congelar - mantenerlas a 4 ° C solo para uso a corto plazo - después de la concentración siempre girando la proteína (10 min a 100k por ejemplo) para precipitar material agregado. La agregación causa agregación, por lo que desea deshacerse de ella.


Si tuviera que intentar a ciegas su pregunta, nunca es una buena idea congelar y descongelar ninguna proteína, ni siquiera los lisados ​​celulares. Ese es el objetivo del uso de glicerol, que utilizamos en nuestro laboratorio al 50% (v / v) para almacenar proteínas unidas a perlas. Es también por eso que los anticuerpos y las enzimas de restricción se almacenan en glicerol, ya que la congelación y descongelación de los anticuerpos disueltos en agua a menudo conduce a su degradación, aunque solo tiende a almacenar cosas en glicerol, como las enzimas de restricción, si la concentración de la proteína es muy alta. Un truco de oro que uso es tomar alícuotas de mis muestras y congelarlas en nitrógeno líquido y almacenarlas en un congelador de -80ºC. Tengo curiosidad por saber qué sucede con la proteína, ¿se degrada después de un ciclo de congelación y descongelación? (Soy consciente de que las proteínas transmembrana son notorias cuando se trata de almacenamiento / mantenimiento debido a su incómoda región transmembrana hidrofóbica, por lo que es mejor hablar con un experto en cristalografía de rayos X, si hay alguien así deambulando por su laboratorio de investigación: ), ya que se han enfrentado a problemas como este con bastante frecuencia y tienen excelentes sugerencias). ¿Están sus proteínas etiquetadas con GST y unidas a perlas de glutatión agarosa? ¿O usa etiquetas HIS y perlas de níquel y eluye la proteína purificada a través de imidazol? Sospecho que es GST, en cuyo caso probablemente no sea una buena idea congelar rápidamente, aunque (de alguna manera) tuve perlas de glicerol congeladas a -20 y estaban bien después de su uso. Un amigo me ha hablado de la purificación de proteínas y del hecho de que el aislamiento de proteínas debe realizarse en fresco, por lo que es posible que tenga que bajar por esa raíz si su método actual no es el ideal. También una última pregunta, ¿está purificando sus proteínas de forma bacteriana o se secretan en los medios? Sospecho que si es una proteína de membrana, está usando el sistema basado en células, ya que si estuviera usando E. coli (como se sugirió anteriormente), podría haber expresado su proteína a través de IPTG y haber lavado su sedimento celular en tampón STE y centrifugado. lo bajó con fuerza y ​​almacenó el gránulo a -20, en cuyo caso le ahorraría algo de tiempo en el proceso de purificación. El uso de azida de sodio también es una buena idea, pero solo la uso para el almacenamiento primario de anticuerpos que ya está disuelto en el tampón de bloqueo, como 5% -BSA-TBST para WB y lo guardo todo a 4 oC y la azida de sodio está allí. para evitar que BSA y Ab se apaguen.

El principal problema que tienen muchas personas, incluido yo mismo, es que la mayoría de las veces, la proteína sobreexpresada es insoluble o simplemente no se expresa en ciertos sistemas, por lo que tienes mucha suerte de tener un sistema que funcione.

Esto es todo lo que sé sobre el almacenamiento de proteínas. Espero que esto ayude.


Proteínas de membrana

Las proteínas de membrana son las proteínas de unión que median la conducción de iones o moléculas dentro y fuera de la membrana celular. Integral, periférica y anclada a lípidos son las tres proteínas de membrana típicas.

La proteína de la membrana es el componente principal de la membrana celular que contribuye a la estructura de la membrana plasmática. La unión de las proteínas de membrana y el fosfolípido. membrana celular bicapa podría ser temporal o permanente.

Una capa biológica tiene más de cientos de proteínas en una orientación definida. En este post, estudiaremos la definición, ensamblaje, tipos y funciones de las proteínas de membrana.

Contenido: Proteínas de membrana

Definición de proteínas de membrana

La proteína de membrana se refiere a la proteína constitutiva o no constitutiva, que se une con la membrana de la bicapa de fosfolípidos en diferentes ubicaciones por enteramente o abarcando parcialmente el plasmolema.

Lados de la membrana”Se debe a la diferente ubicación de varias proteínas de membrana en la membrana celular biológica, lo que provoca la asimetría de la membrana celular. Algunas proteínas de la membrana se comunican con las sustancias extracelulares, mientras que otras interactúan con el material protoplásmico interno.

Ensamblaje de proteínas de membrana

Todos sabemos que las proteínas se forman a través de la traducción del ARNm por la asociación de ribosoma y transferir ARN. los ribosomas sintetizar una secuencia de señal verdadera o no escindible Segmento TM desde su N-terminal.

Luego, el segmento hidrofóbico de residuos de aminoácidos viaja a través del túnel ribosómico hacia el sitio de salida. Translocón se refiere al complejo de proteínas dentro de la membrana celular que proporciona un túnel ribosómico para liberar e insertar proteínas recién sintetizadas.

Los ribosomas procesan la liberación de Segmentos de tm en relación con la secuencia de ARNm codificada. Partículas receptoras de señales (SRP) se unen al complejo de cadena polipeptídica entrante, acomodando la secuencia señal en la conformación de hélice alfa y detiene la traducción.

los Receptores SR interactúan con los ribosomas y los SRP y provocan un cambio conformacional en los SRP, lo que permite la transferencia de la cadena de ribosomas naciente. Después de la síntesis de proteínas, el ribosoma se desprende del translocón y las proteínas de membrana liberadas asumen su 3D conformación.


¿Qué es una proteína de membrana? (con imagenes)

Las proteínas de membrana son proteínas que están incrustadas entre los fosfolípidos que forman la estructura bicapa de las membranas celulares. La proteína de membrana realiza tareas específicas que son esenciales para el buen funcionamiento de la célula. Estos incluyen el transporte de moléculas e iones dentro y fuera de la célula, iniciando rutas de señales y haciendo que la célula sea reconocible por otras células. Hay dos tipos principales de proteínas de membrana: periféricas e integrales. & # 13

Las proteínas de la membrana periférica están incrustadas en un lado de la membrana celular, ya sea en la superficie exterior o en la pared interior. Las proteínas integrales de la membrana están incrustadas dentro de la membrana celular y se proyectan a la célula o al entorno externo. Una proteína de membrana integral que se extiende por toda la membrana celular, desde la superficie externa de la célula hasta la superficie interna de la célula, se llama proteína transmembrana. & # 13

Una proteína de la membrana periférica que reside en la superficie externa de la membrana celular interactúa con moléculas que son liberadas por otras células. A través de un proceso llamado señalización celular, una célula puede comunicarse con otra mediante la liberación de mensajeros químicos. Los mensajeros son reconocidos por las proteínas de la membrana periférica exterior. & # 13

Las proteínas de la membrana periférica que se encuentran en la superficie interior de la membrana celular proporcionan una base para el andamiaje de la célula. Estos incluyen las proteínas citoesqueléticas actina y espectrina. Una enzima llamada proteína quinasa C es otra proteína de la membrana periférica interior. Inicia vías de señalización dentro de la célula. & # 13

Las proteínas de la membrana periférica no interactúan con la región no polar de la membrana celular. En cambio, están unidos a la membrana celular a través de interacciones entre la región polar de los fosfolípidos y la región polar de la proteína. Muchas proteínas de la membrana periférica también se unen a proteínas integrales de la membrana. & # 13

Las proteínas integrales de la membrana transportan moléculas desde el entorno externo al interior de la célula. Algunos pueden transportar moléculas libremente, mientras que otros requieren energía para transportar moléculas. Las proteínas integrales de membrana también sirven como receptores para moléculas específicas y como enzimas para vías metabólicas específicas. & # 13

La cadena de una proteína de membrana integral puede atravesar la membrana celular una vez, o entretejerse dentro y fuera de la membrana celular varias veces. Contienen cadenas laterales no polares, que les permiten interactuar con las cadenas de ácidos grasos de los fosfolípidos. Esta interacción mantiene la proteína de la membrana integral firmemente a la membrana celular. Las proteínas integrales de la membrana también tienen una región polar que se extiende hacia la célula o el entorno externo. & # 13 & # 13.


Guía para la purificación de proteínas, segunda edición

Sue-Hwa Lin, Guido Guidotti, en Métodos en enzimología, 2009

Abstracto

Las proteínas de membrana son actores fundamentales en los procesos biológicos. Para comprender cómo funciona una proteína de membrana, es importante purificar la proteína para caracterizarla por completo. Las proteínas de membrana son difíciles de purificar porque están presentes en niveles bajos y requieren que los detergentes se vuelvan solubles en una solución acuosa. La selección de detergentes adecuados para la solubilización y purificación de una proteína de membrana específica es fundamental en la purificación de proteínas de membrana. El objetivo de este capítulo es proporcionar una descripción general del aislamiento de las membranas plasmáticas, la selección de detergentes para la solubilización de proteínas de membrana y cómo la elección de detergentes puede afectar la purificación de proteínas de membrana.


Cómo las proteínas encuentran su lugar en la célula

Estructura de la máquina de inserción GET (Get1 en azul, Get2 en naranja y Get3 en azul claro). En el fondo se muestra una imagen representativa de crio-EM del complejo. Crédito: McDowell y Sinning (2020)

Más de una cuarta parte de todas las proteínas de una célula se encuentran en la membrana, donde realizan funciones vitales. Para cumplir con estas funciones, las proteínas de membrana deben transportarse de manera confiable desde su sitio de producción en la célula hasta su destino e insertarse correctamente en la membrana diana. Investigadores del Centro de Bioquímica de la Universidad de Heidelberg (BZH) han logrado determinar la estructura tridimensional de una máquina molecular responsable de la ubicación correcta de una importante familia de proteínas de membrana: las llamadas proteínas de membrana "ancladas en la cola" o proteínas TA. para abreviar.

Un ser humano adulto consta de aproximadamente 100 mil millones de células. Cada uno contiene innumerables proteínas, los arquitectos y actores de la vida que realizan una amplia gama de funciones. Una parte importante de las proteínas de una célula son proteínas de membrana, es decir, componentes de las membranas finas (del latín membrana) que envuelven a cada célula, así como a sus pequeños órganos, los orgánulos. Las proteínas de membrana pueden formar canales o poros y realizar tareas fundamentales como el transporte de sustancias y la transmisión de señales. Por tanto, la correcta inserción de una proteína de membrana es fundamental para que ésta cumpla su función biológica y, a su vez, para el correcto funcionamiento de la célula. Pero, ¿qué asegura que la proteína termine en la membrana correcta y se integre en el lugar correcto?

Las secuencias de señales específicas, pequeñas secciones de proteínas que actúan como "códigos postales", son vitales para la entrega a la ubicación correcta y la inserción adecuada en la membrana. Son detectados por máquinas clasificadoras moleculares que llevan la proteína a su destino. En algunas proteínas, la secuencia señal se encuentra al final de la molécula, lo que los científicos conocen como proteínas de membrana TA o ancladas en la cola. Esta familia de proteínas de membrana vital está involucrada en muchos procesos celulares, incluida la fusión de membranas y la apoptosis o muerte celular programada.

Los investigadores de BZH dirigidos por el Prof.Dr. Irmgard Sinning determinaron recientemente la estructura tridimensional de la máquina molecular que inserta las proteínas TA en la membrana del retículo endoplásmico (ER), una importante red de distribución dentro de la célula que está conectada a todas las demás orgánulos. Para sus análisis estructurales, los científicos de BZH utilizaron microscopía crioelectrónica (cryo-EM), un método reconocido por el Premio Nobel de Química en 2017. "Este tipo de información estructural de alta resolución es fundamental para comprender los pasos finales de la proteína proceso de inserción en la membrana ER ", explica el profesor Sinning, que dirige un grupo de investigación en la BZH.

La máquina de inserción GET es responsable de la correcta inserción de las proteínas TA en la membrana del RE. GET significa "entrada guiada de proteínas de membrana ancladas en la cola". Esta máquina de inserción, que apenas ha cambiado en el transcurso de la evolución de la levadura al hombre, consta de tres bloques de construcción de proteínas. Dos se encuentran en la membrana del RE donde forman una especie de cavidad (Get1 y Get2). El tercero (Get3) se encuentra fuera de la membrana, actuando como liberador de proteína TA. Los tres componentes de la máquina de inserción GET son esenciales para la correcta inserción de la proteína TA en la membrana diana. Get2 toma la proteína del liberador y esencialmente la "empuja" hacia la cavidad en el interior de la membrana. Los investigadores de Heidelberg descubrieron este detalle inesperado sobre la interacción entre Get2 y Get3 durante su análisis de la estructura de la proteína. También demostraron que dos copias de la máquina de inserción siempre trabajan en estrecha colaboración para hacer que el proceso de integración sea más eficiente. "La máquina de inserción GET proporciona a las proteínas TA una ruta energéticamente favorable hacia la membrana", afirma el Prof. Sinning.

"Las proteínas de membrana pequeñas como las que se encuentran en la máquina de inserción GET son un desafío para la biología estructural, por lo que nuestra investigación requirió ideas innovadoras", agrega la bióloga estructural Dra. Melanie McDowell. Solo en los últimos años las mejoras técnicas en crio-EM han permitido identificar con mayor detalle estructuras de complejos de proteínas cada vez más pequeños. Por lo tanto, la Universidad de Heidelberg estableció una red crio-EM (HDcryoNet), lo que hace posible el análisis estructural de pequeños complejos de proteínas de membrana como la máquina de inserción GET. El Prof. Sinning y el Dr. McDowell creen que sus nuevos datos proporcionan una pieza crucial del rompecabezas que falta para completar la imagen del transporte de proteínas en la célula y la inserción de proteínas en las membranas.


La fuerza impulsora eléctrica y química que mueve los iones.

La diferencia entre el potencial interno menos el externo en una membrana.

Un aislante o sustancia de muy baja conductividad eléctrica.

Un dispositivo que puede almacenar carga eléctrica.

El espacio que rodea una carga eléctrica. Para una carga estacionaria, el campo eléctrico E en la posición donde se ubica una partícula de carga q está definido por el vector E = F / q, donde F es la fuerza ejercida sobre la partícula.

Dos cargas opuestas de la misma magnitud que están separadas por una distancia finita.

La corriente eléctrica transitoria que se produce por el movimiento de las cargas de activación.

Un término más general para las corrientes de puerta.

Dispositivo electrónico que impone una diferencia de potencial definida a través de la membrana.

Gráfico de la dependencia del voltaje de la carga de activación.

La corriente que entra y sale de las placas del condensador durante su carga o descarga.

El proceso de reducción de la conductancia durante la despolarización mantenida.

Este es el canal relacionado con el éter-a-go-go humano, que es un canal de potasio que se clasifica como Kv11.1.

Una fosfatasa que desfosforila el fosfatidilinositol (3,4,5) -trisfosfato para obtener fosfatidilinositol (4,5) -bisfosfato.


Parte 2: Acceso alterno del transportador de glucosa

00: 00: 09.01 Hola. Soy Nieng Yan.
00: 00: 10.05 Soy profesor en la Facultad de Medicina,
00: 00: 13.28 Universidad de Tsinghua, Beijing, China.
00: 00: 15.02 Bienvenido a la serie de seminarios iBiology.
00: 00: 17.25 En la parte 2,
00: 00: 19.13 Me gustaría compartir contigo
00: 00: 20.29 uno de los principales intereses de investigación en mi laboratorio.
00: 00: 24.03 Es decir, el esclarecimiento de la estructura
00: 00: 25.29 de un proceso fisiológico muy fundamental
00: 00: 29.16, la captación celular de glucosa.
00: 00: 33.25 Todos sabemos que la glucosa es la principal fuente de energía
00: 00: 37.10 para la mayoría de las vidas en la Tierra.
00: 00: 39.28 Del libro de texto de bioquímica
00: 00: 42.23 o biología celular,
00: 00: 44.10 todos aprendieron cómo se quema la glucosa
00: 00: 48.08 para liberar energía para mantener la vida.
00: 00: 50.14 Sabemos a través de la glucólisis,
00: 00: 52.08 una molécula de glucosa se divide en
00: 00: 55.29 dos moléculas de piruvato,
00: 00: 57.06 y durante este proceso
00: 00: 59.01 se generan dos moléculas de ATP.
00: 01: 01.23 Y en las condiciones aeróbicas,
00: 01: 05.13 las moléculas de piruvato
00: 01: 08.06 se queman más a través del ciclo TCA,
00: 01: 10.24 o el ciclo del ácido cítrico,
00: 01: 13.02 y la cadena de transporte de electrones,
00: 01: 15.17 para generar dióxido de carbono.
00: 01: 20.03 Y durante este proceso.
00: 01: 21.20 Quiero decir, si es un metabolismo completo,
00: 01: 24.05 entonces se puede usar una glucosa para
00: 01: 26.26 producen más de 30 moléculas de ATP.
00: 01: 30.00 Esa es la moneda energética para toda la vida.
00: 01: 34.13 Sin embargo, antes del metabolismo de la glucosa,
00: 01: 38.12 también hay un paso crítico
00: 01: 40.17 - es decir, llevar la glucosa a la célula.
00: 01: 44.15 De la parte 1,
00: 01: 46.07 Ya te dije que la glucosa
00: 01: 47.28 es altamente hidrofílico,
00: 01: 51.08 eso significa que son solubles en agua.
00: 01: 52.08 Sin embargo, la celda está rodeada por
00: 01: 56.22 la bicapa lipídica hidrofóbica.
00: 01: 57.26 Entonces, la glucosa no puede ingresar a la celda
00: 02: 00.02 mediante difusión libre.
00: 02: 01.13 Debe haber diferentes proteínas
00: 02: 04.24 para mediar en este proceso.
00: 02: 06.18 Estas proteínas se llaman transportadores de glucosa.
00: 02: 10.14 Entonces, como vemos aquí,
00: 02: 14.19 el transportador de glucosa es importante,
00: 02: 16.16 es esencial para la captación celular de glucosa.
00: 02: 20.07 Y, a lo largo de los años,
00: 02: 23.14 hemos identificado diferentes tipos de transportadores de glucosa,
00: 02: 27.01 y se están identificando más transportadores de glucosa,
00: 02: 31.06 pero entre todos esos,
00: 02: 33.03 los más rigurosamente caracterizados
00: 02: 37.13 se denominan GLUT, como se muestra aquí,
00: 02: 38.25 G-L-U-T,
00: 02: 40.26 transportadores de glucosa.
00: 02: 43.18 Entonces, en los cuerpos humanos,
00: 02: 47.22 hay una gran familia llamada
00: 02: 49.15 superfamilia facilitadora principal,
00: 02: 51.07 y los GLUT pertenecen a esta familia.
00: 02: 52.16 Incluso dentro de la familia GLUT,
00: 02: 54.23 hay 14 isoformas diferentes
00: 02: 57.01 que exhiben especificidad tisular
00: 02: 59.28 y especificidad del sustrato.
00: 03: 02.05 Como se resume aquí, por ejemplo,
00: 03: 05.04 GLUT1 funciona en el cerebro y los glóbulos rojos,
00: 03: 08.28 y GLUT2 es para hígado.
00: 03: 11.28 GLUT3 también se llama transportador de glucosa neuronal,
00: 03: 14.27 indicando que funciona en neuronas.
00: 03: 17.10 Y GLUT4 es muy famoso
00: 03: 19.14 - lleva la glucosa a los adipocitos y las células musculares.
00: 03: 24.27 Entonces, estos son los cuatro GLUT más famosos
00: 03: 28.19 - GLUT 1, 2, 3, 4.
00: 03: 30.13 Y para las otras 10 isoformas diferentes,
00: 03: 32.28 desafortunadamente, para algunos de ellos,
00: 03: 35.07 sus sustratos permanecen sin caracterizar.
00: 03: 38.24 Oh, además, para estos transportadores de glucosa,
00: 03: 41.07 a pesar de la similitud de secuencia entre sí,
00: 03: 44.00 en realidad pueden tener
00: 03: 47.11 diferentes afinidades de unión para la glucosa
00: 03: 51.06 y para otros azúcares similares,
00: 03: 54.19 y tienen diferentes tasas de rotación.
00: 03: 56.24 Por ejemplo, GLUT1 puede tomar
00: 04: 00.25 hasta 1200 glucosa por segundo,
00: 04: 04.09 pero eso es. sí, eso es muy rápido.
00: 04: 06.13 sin embargo, GLUT3.
00: 04: 08.19 para GLUT3, el número es 6000.
00: 04: 10.09 es cinco veces más rápido que GLUT1,
00: 04: 13.15 y esto es asombroso.
00: 04: 15.05 Debido a su fundamental
00: 04: 18.02 importancia en fisiología,
00: 04: 19.28 te puedes imaginar,
00: 04: 21.10 mal funcionamiento o mala regulación de estas proteínas
00: 04: 24.29 están asociados con diversas enfermedades.
00: 04: 28.17 Por ejemplo, síndrome de deficiencia de GLUT1
00: 04: 31.20 es en realidad una enfermedad genética rara
00: 04: 34.13 manifestado por una convulsión de inicio temprano
00: 04: 37.24 o retraso en el desarrollo.
00: 04: 40.10 Y GLUT2, porque está asociado con el hígado.
00: 04: 43.15 entonces, mutaciones de GLUT2
00: 04: 46.11 están asociados con
00: 04: 50.12 un tipo de enfermedad llamada síndrome de Fanconi-Bickel.
00: 04: 52.24 Y cada vez más evidencia muestra que
00: 04: 57.02 GLUT1 y GLUT3 se sobreexpresan en las células cancerosas,
00: 05: 01.19 especialmente células tumorales sólidas,
00: 05: 04.11 debido al llamado efecto Warburg.
00: 05: 06.01 Te lo acabo de decir,
00: 05: 08.26 sin oxígeno, una glucosa puede ser
00: 05: 11.23 convertido en piruvato.
00: 05: 13.01 Durante este proceso, se generan dos moléculas de ATP.
00: 05: 15.17 Sin embargo, en presencia de oxígeno,
00: 05: 18.23 es decir, aromático.
00: 05: 20.18 o, lo siento, condiciones aeróbicas,
00: 05: 22.28 sobre. Quiero decir, más de 30 moléculas de ATP.
00: 05: 25.02 se puede generar.
00: 05: 26.10 Para tumores sólidos,
00: 05: 27.26 por lo general es en condiciones hipóxicas.
00: 05: 30.23 Eso es. ya sabes, eso significa que solo puede.
00: 05: 34.22 una glucosa solo puede generar dos ATP.
00: 05: 37.10 En consecuencia, más transportadores de glucosa
00: 05: 39.25 tienen que ser expresados
00: 05: 43.14 para llevar más azúcar a
00: 05: 46.08 compensar estas cantidades.
00: 05: 47.23 Y para GLUT4,
00: 05: 49.12 es muy famoso por
00: 05: 51.10 su asociación con la diabetes mellitus tipo 2
00: 05: 54.17 y obesidad.
00: 05: 56.29 Entonces, como acabo de mencionar,
00: 05: 59.03 los transportadores de glucosa pertenecen a
00: 06: 01.12 la llamada superfamilia facilitadora principal.
00: 06: 04.25 De hecho,
00: 06: 06.27 son los prototipos de este
00: 06: 09.10 la mayor familia de transportadores activos secundarios.
00: 06: 12.22 Y para los miembros de esta familia,
00: 06: 16.00 en realidad, están muy extendidos en todas las especies,
00: 06: 19.04 de bacterias a seres humanos.
00: 06: 20.17 Y los miembros de esta familia
00: 06: 22.07 tienen un espectro muy amplio de sustratos,
00: 06: 25.22 de iones, azúcares,
00: 06: 28.07 aminoácidos, o incluso péptidos.
00: 06: 31.05 Y en términos de mecanismos de transporte,
00: 06: 35.26 si ya viste la parte 1,
00: 06: 39.08 en realidad, los miembros de esta familia pueden ser
00: 06: 42.02 uniportadores, simportadores o antiportadores.
00: 06: 44.15 Eso es en términos de las orientaciones del transporte.
00: 06: 47.00 Y, como también te dije,
00: 06: 49.20 un acceso alterno general
00: 06: 53.18 modelo o mecanismo
00: 06: 55.08 se ha propuesto dar cuenta
00: 06: 56.29 para todos los transportadores secundarios.
00: 06: 58.23 Especialmente para miembros de MFS,
00: 07: 01.05 esto funciona muy bien.
00: 07: 02.27 Y pensamos que porque
00: 07: 04.24 Los GLUT son los prototipos en la comprensión de esta familia,
00: 07: 07.17 por lo que la caracterización estructural y bioquímica de GLUT
00: 07: 12.17 también puede arrojar luz sobre el entendimiento
00: 07: 15.04 de otros miembros de esta gran familia.
00: 07: 18.07 Bien, ¿por qué es un prototipo?
00: 07: 20.16 ¿especialmente GLUT1?
00: 07: 22.08 Porque era uno de los
00: 07: 24.29 primeros transportadores en ser clonados
00: 07: 26.26 y caracterizado.
00: 07: 29.06 Entonces, déjame llevarte a la historia.
00: 07: 31.05 En realidad, la caracterización de la absorción de glucosa
00: 07: 35.15 en nuestras células sanguíneas
00: 07: 38.01 se remonta a hace aproximadamente un siglo.
00: 07: 40.15 Y en ese momento ya se descubrió que
00: 07: 45.22 la tasa de absorción o la "difusión".
00: 07: 47.15 en ese momento la gente no sabía que era transporte activo,
00: 07: 50.03 así que todavía lo llamaron difusión.
00: 07: 52.25 pero un estudiante de doctorado descubrió que
00: 07: 56.03 el coeficiente de difusión depende de la concentración,
00: 07: 59.09 sugiriendo que no fue difusión libre.
00: 08: 02.00 En 1948, LeFevre, en un documento,
00: 08: 05.24 especuló sobre el componente de transporte activo,
00: 08: 10.03 aunque no especificó
00: 08: 11.22 ya sea proteína o algo más,
00: 08: 13.15 pero solo especuló que habría
00: 08: 16.15 un mecanismo de transporte activo.
00: 08: 19.04 Y en la década de 1950, Widdas,
00: 08: 21.00 en su famoso periódico,
00: 08: 23.12 propuso un llamado mecanismo portador de soluto móvil.
00: 08: 26.21 De hecho,
00: 08: 29.02 este mecanismo era tan famoso
00: 08: 30.19 que todos los transportadores secundarios en humanos
00: 08: 35.15 llevan el nombre de SLC.
00: 08: 38.24 Entonces, por ejemplo, GLUT1 es en realidad.
00: 08: 41.08 el nombre del gen para GLUT1 es SLC2A1,
00: 08: 45.06 pero no lo llames flojo,
00: 08: 47.02 porque a los científicos no les gusta ese nombre,
00: 08: 49.11 así que es SLC.
00: 08: 51.17 Y luego.
00: 08: 53.04 y hasta ahora se trata de estos componentes.
00: 08: 55.04 Y en 1977, estos científicos
00: 08: 58.18 en realidad fueron capaces de purificar
00: 09: 01.14 el componente proteico de los glóbulos rojos
00: 09: 04.01 y reconstituirlos en un liposoma,
00: 09: 07.01 y reconstituyeron la captación de glucosa.
00: 09: 10.13 Entonces, llamaron a este componente proteico
00: 09: 12.22 GLUT1.
00: 09: 14.17 Y luego, en 1985,
00: 09: 16.12 El laboratorio de Harvey Lodish clonó GLUT1,
00: 09: 19.20 y cuando la secuencia estaba disponible
00: 09: 22.20 estaba claro que esta proteína contiene
00: 09: 25.16 12 hélices transmembrana.
00: 09: 27.24 Y en la década de 1990,
00: 09: 30.26 los esfuerzos del estudio se cambiaron
00: 09: 33.16 a las investigaciones fisiopatológicas,
00: 09: 35.25 así como caracterizaciones estructurales,
00: 09: 38.10 porque nos gustaría entender su estructura,
00: 09: 41.07 para ver su estructura,
00: 09: 42.17 para entender
00: 09: 44.18 su mecanismo funcional y mecanismo de enfermedad.
00: 09: 47.13 Sin embargo, 30 años.
00: 09: 49.24 Pasaron casi 30 años.
00: 09: 52.11 entonces lo que aprendimos del libro de texto
00: 09: 54.01 sobre la estructura de GLUT1 seguía siendo esto,
00: 09: 56.26 el publicado por Harvey Lodish en 1985.
00: 10: 00.19 Esta es la estructura topológica.
00: 10: 03.06 Muy bien, umm.
00: 10: 05.12 entonces, comencé mi laboratorio en 2007
00: 10: 07.17 y estábamos muy interesados ​​en la estructura de GLUT
00: 10: 10.14 porque pensamos que podría ayudar
00: 10: 13.00 abordan muchas preguntas interesantes,
00: 10: 14.25 como se enumeran aquí.
00: 10: 16.05 Por supuesto, lo primero es
00: 10: 19.01 intentas ver la arquitectura de GLUT,
00: 10: 21.18 ese es el propósito más directo, pero superficial.
00: 10: 25.04 Y con la estructura
00: 10: 27.14 podríamos ser capaces de revelar
00: 10: 29.11 la base molecular subyacente a la selectividad del sustrato,
00: 10: 32.14 por qué selecciona glucosa,
00: 10: 35.22 pero no, por ejemplo, maltosa.
00: 10: 38.19 Y nosotros.
00: 10: 40.14 porque entendemos que estos transportadores
00: 10: 43.09 siguen este ciclo de acceso alterno,
00: 10: 46.07 así que nos gustaría revelar los cambios conformacionales
00: 10: 48.26 durante el ciclo de transporte,
00: 10: 50.12 para comprender su mecanismo funcional.
00: 10: 54.00 Y también esperamos
00: 10: 57.12 proporcionan una interpretación molecular
00: 10: 59.10 para todas estas mutaciones relacionadas con la enfermedad.
00: 11: 03.26 Y, para mi propia investigación,
00: 11: 06.27 También estoy muy interesado en la diferencia,
00: 11: 08.21 la diferencia mecanicista,
00: 11: 10.05 entre simportadores,
00: 11: 11.20 particularmente simportadores de protones,
00: 11: 13.16 y facilitadores,
00: 11: 15.01 pero es posible que no tenga tiempo para entrar en los detalles de esta parte.
00: 11: 17.27 Y finalmente, porque las proteínas de membrana
00: 11: 21.18 están incrustados en la bicapa lipídica,
00: 11: 24.05 realmente nos gustaría entender
00: 11: 27.00 cómo los modulan los lípidos,
00: 11: 28.28 y hay más y más preguntas.
00: 11: 30.15 simplemente surgen durante su investigación.
00: 11: 32.26 Entonces, para abordar estas preguntas,
00: 11: 34.27 empezamos no con un transportador de glucosa,
00: 11: 37.26 pero con sus familiares,
00: 11: 40.21 sus parientes de E. coli,
00: 11: 42.21 que son técnicamente más fáciles que la proteína humana.
00: 11: 46.24 Así que determinamos las dos estructuras de
00: 11: 50.09 Simportadores de protones-azúcar de E. coli,
00: 11: 53.02 FucP y XylE.
00: 11: 55.21 Entonces, como indica el nombre,
00: 11: 58.02 son simportadores de protones,
00: 11: 59.12 lo que significa que explotan este gradiente de protones transmembrana
00: 12: 02.18 para impulsar la absorción de los sustratos,
00: 12: 05.08 ya sea L-fucosa o D-xilosa,
00: 12: 07.21 desde un entorno de baja concentración
00: 12: 10.20 al interior de alta concentración de la célula.
00:12: 13.13 En los últimos tres años, tuvimos mucha suerte.
00: 12: 16.27 Finalmente pudimos determinar
00: 12: 18.21 las estructuras cristalinas de GLUT1,
00: 12: 21.08 y su GLUT3 estrechamente relacionado,
00: 12: 24.25 en tres conformaciones diferentes.
00: 12: 27.02 Eso significa que adoptan diferentes estados
00: 12: 30.04 durante un ciclo de transporte,
00: 12: 31.21 como se muestra aquí.
00: 12: 32.25 Entonces, todo el camino desde
00: 12: 35.22 abierto hacia afuera, ocluido y abierto hacia adentro.
00: 12: 37.18 Cuando digo hacia afuera o hacia adentro,
00: 12: 40.08 que se refiere al sitio de unión del sustrato,
00: 12: 42.21 eso es. recuerde, para el acceso alterno,
00: 12: 47.01 eso es. el sitio de unión del sustrato
00: 12: 48.28 nunca se puede exponer
00: 12: 50.29 a ambos lados de la membrana,
00: 12: 54.09 por lo que siempre está abierto hacia un lado,
00: 12: 55.27 viene el sustrato,
00: 12: 57.07 y esta proteína sufre un cambio conformacional
00: 13: 00.04 para exponer el sustrato
00: 13: 02.07 al otro lado.
00: 13: 03.20 Esto se llama acceso alterno.
00: 13: 05.13 Entonces, con estas tres estructuras,
00: 13: 07.00 tenemos una comprensión relativamente mejor
00: 13: 08.23 de este ciclo de transporte de GLUT.
00: 13: 11.16 Muy bien, lo primero.
00: 13: 13.06 Para abordar la cuestión de la arquitectura.
00: 13: 15.19 pero, antes de eso, sé
00: 13: 19.18 mucha gente está interesada en la cristalización de proteínas de membrana
00: 13: 21.28 y GLUT1 ha sido un objetivo durante varias décadas.
00: 13: 25.12 ¿Por qué pudimos cristalizar
00: 13: 28.19 y determinar la estructura
00: 13: 30.17 de esta proteína tan intrigante?
00: 13: 31.15 En retrospectiva, hay tres elementos clave
00: 13: 35.23 que contribuyó a la cristalización de GLUT1
00:13: 38.26 y nos dio los cristales difractantes.
00:13: 41.21 Primero, introdujimos mutaciones puntuales.
00: 13: 45.01 primero es eliminar la glicosilación,
00: 13: 47.10 que realmente representa grandes problemas
00: 13: 50.29 para la cristalización.
00: 13: 52.12 Y la otra mutación puntual,
00: 13: 54.17 glutamato-329 a glutamina,
00: 13: 57.10 esta es una mutación relacionada con la enfermedad
00: 14: 00.18 originalmente identificado en GLUT4,
00: 14: 03.02 y se sugirió a l
00: 14: 05.21 Ock la proteína en la conformación abierta hacia adentro,
00: 14: 08.24 que fue exactamente el caso, como se ve en nuestra estructura.
00: 14: 12.09 Y segundo, en el detergente que usamos para la cristalización
00: 14: 16.01 es nonil-glucósido.
00: 14: 17.03 Volveré más tarde con
00:14: 19.01 por qué esto era importante.
00: 14: 20.04 Y tercero, ya sabes, para los transportadores de glucosa,
00: 14: 22.05 son muy móviles,
00: 14: 23.14 para intentar frenarlos,
00: 14: 25.08 para bloquearlos en ciertas conformaciones,
00: 14: 27.08 así que hicimos todos los experimentos a baja temperatura,
00: 14: 29.21 a 4 grados Celsius
00: 14: 31.08 - eso ayudó mucho.
00: 14: 33.06 Y para abreviar una larga historia,
00:14: 35.25 Un día en particular, mi estudiante me mostró estos cristales,
00:14: 39.06 estos diminutos cristales.
00:14: 40.21 Pensé, probablemente,
00: 14: 43.02 eran contaminaciones de células de insectos,
00: 14: 45.08 sin embargo, ya sabes,
00: 14: 47.07 no está de más enviarlos al sincrotrón
00: 14: 49.29 para la recopilación de datos
00:14: 51.08 y enviamos este cristal único
00: 14: 53.08 al sincrotrón de Shanghai,
00: 14: 54.24 y varias horas después
00: 14: 56.12 resolvimos la estructura
00:14: 58.13 ese era exactamente nuestro objetivo, GLUT1.
00: 15: 00.16 Como se muestra aquí, esta estructura
00: 15: 04.00 exhibe un pliegue MFS muy típico,
00: 15: 08.02 recuerda, superfamilia facilitadora principal.
00: 15: 10.11 Contiene 12 hélices transmembrana,
00: 15: 13.10 con los primeros 6 nombrados el
00: 15: 17.14 Dominio N o dominios N-terminales,
00: 15: 19.03 mostrado en plata,
00: 15: 20.26 y el terminal C en azul.
00: 15: 23.07 Y muy inesperadamente,
00: 15: 25.01 también vemos un dominio helicoidal intracelular,
00: 15: 28.25 lo llamamos ICH.
00: 15: 30.07 En realidad, este dominio.
00: 15: 32.03 este pequeño dominio alberga
00: 15: 34.03 mucha serina o treonina o lisina,
00: 15: 36.27 por lo que estos residuos son probablemente
00: 15: 38.28 importante para su modificación posterior a la traducción.
00: 15: 42.01 Ahora, con esta estructura,
00: 15: 43.27 realmente podemos dar la respuesta a muchas preguntas.
00: 15: 49.05 Entonces, como pregunté al principio
00: 15: 52.03 - entonces, ¿cuál es el mecanismo de selectividad del sustrato?
00: 15: 55.07 Para este propósito, en realidad examinamos,
00: 15: 57.18 a través de un enfoque bioquímico,
00: 16: 01.13 la selectividad del azúcar por GLUT1 y GLUT3,
00: 16: 04.09 que se muestran aquí son los resultados para GLUT3.
00: 16: 06.14 Como puede ver, de hecho,
00: 16: 08.13 esta proteína tiene una especie de selectividad estricta,
00: 16: 14.13 y uno.
00: 16: 15.16 dondequiera que veas estos más bajos,
00: 16: 17.09 estas barras más cortas,
00: 16: 19.02 eso significa estos azúcares
00: 16: 21.09 puede inhibir la absorción de glucosa,
00: 16: 23.27 lo que significa que pueden ser reconocidos por GLUT3,
00: 16: 25.23 para competir por la unión de glucosa.
00:16: 28.19 Y cuando examinamos estos productos químicos,
00: 16: 31.06 muy interesante
00: 16: 33.09 encontramos una característica común,
00: 16: 34.23 es decir, su grupo hidroxilo C3
00: 16: 37.22 todos apuntan a una orientación,
00: 16: 39.23 lo que significa que el grupo hidroxilo C3 es importante.
00:16: 43.02 Esa es la conclusión de la bioquímica,
00: 16: 46.29 de nuestras caracterizaciones bioquímicas.
00: 16: 49.20 Entonces, ¿cómo es una molécula de azúcar?
00: 16: 52.29 reconocidos por la proteína?
00: 16: 55.00 Entonces, la respuesta es del
00: 16: 56.24 estructura de muy alta resolución de GLUT3.
00: 16: 59.06 Entonces, determinamos GLUT3
00: 17: 02.10 en complejo con su sustrato, D-glucosa,
00: 17: 04.10 a una resolución de 1.5 Angstrom,
00: 17: 08.13 y aquí se muestra el mapa de densidad electrónica omitida.
00:17: 10.19 Como puede ver, es hermoso.
00:17: 12.21 Para nuestra sorpresa, nos identificamos.
00: 17: 15.11 aunque solo, ya sabes,
00: 17: 17.20 agregue glucosa a la proteína
00: 17: 19.11 e identificamos dos diferentes
00: 17: 22.05 formas anoméricas de glucosa,
00: 17: 26.01 simplemente por el mapa de densidad de electrones.
00: 17: 27.23 Como puede ver, tanto la glucosa alfa como la beta
00: 17: 31.20 están presentes en la estructura.
00:17: 33.26 Quiero decir, tengo que aclarar.
00: 17: 35.15 entonces, una proteína solo puede unirse a una glucosa,
00:17: 39.03 pero para la cristalografía, ya sabes,
00: 17: 41.15 este es el promedio de muchos miles de millones de moléculas,
00:17: 44.18 para que sepa que algunas proteínas se unen a la forma alfa,
00:17: 47.16 algunos se unen a la forma beta.
00:17: 49.16 Y esta observación,
00: 17: 51.07 esta observación estructural
00:17: 53.02 en realidad resolvió una controversia a largo plazo,
00: 17: 55.13 es decir, si los transportadores de glucosa
00: 17: 58.19 puede reconocer la forma alfa de glucosa,
00: 18: 01.26 porque sabemos que la forma beta es la predominante,
00: 18: 04.18 la forma dominante en solución.
00: 18: 05.22 Y esta observación muestra, sí,
00: 18: 07.28 GLUT1 o GLUT3,
00: 18: 09.20 pueden atar y transportar
00: 18: 12.15 ambas formas anoméricas de D-glucosa.
00: 18: 16.05 Muy bien.
00:18: 17.28 Otro descubrimiento interesante es que,
00: 18: 19.20 como te dije,
00: 18: 21.04 los transportadores de glucosa tienen dos dominios distintos,
00: 18: 24.08 Dominio N y dominio C.
00: 18: 26.08 Sin embargo, en la estructura de GLUT3
00: 18: 28.19 en complejo con glucosa,
00: 18: 31.17 así como en la estructura de GLUT1
00:18: 34.03 en presencia de esta molécula de detergente NG.
00: 18: 37.27 ¿qué es NG?
00: 18: 39.04 En realidad, es un derivado de la glucosa,
00: 18: 41.21 por eso NG es importante para nosotros
00: 18: 44.09 para capturar la estructura de GLUT1
00: 18: 46.09 - imita la unión del sustrato.
00: 18: 48.13 Y si comparas estas dos estructuras,
00: 18: 50.11 una característica común es
00: 18: 52.08 el dominio C proporciona
00: 18: 54.08 el sitio de alojamiento principal para la glucosa,
00: 18: 58.22 entonces el dominio C
00: 19: 01.09 es el principal sitio de unión al sustrato.
00: 19: 04.04 Entonces, ¿qué hace el dominio N?
00: 19: 07.08 Está bien.
00: 19: 08.14 Entonces, antes de eso, ya sabes,
00: 19: 10.10 intentamos completar el ciclo de acceso alterno
00: 19: 13.09 por, ya sabes.
00: 19: 16.11 en el intento de capturar otra conformación,
00: 19: 19.09 es decir, el exterior abierto,
00: 19: 20.28 porque ahora tenemos GLUT3
00: 19: 23.01 en complejo con glucosa
00: 19: 25.01 en la conformación ocluida,
00: 19: 26.10 es decir, el sustrato está atrapado
00: 19: 28.10 en el centro del transportador
00: 19: 31.20 y aislado de ambos lados de la membrana.
00: 19: 34.22 Y GLUT1 está abierto hacia el interior de la celda,
00:19: 38.02 así que se llama abierto hacia adentro.
00:19: 39.11 Ahora, todavía necesitamos esta conformación abierta hacia afuera.
00: 19: 44.00 Para capturar la estructura abierta hacia afuera,
00:19: 46.18 Realmente teníamos algo de pensamiento racional.
00: 19: 49.04 Entonces, la gente siempre dice eso
00: 19: 51.01 la cristalización es un arte,
00: 19: 52.12 parece que tienes que hacer muchas pruebas,
00:19: 54.12 pero en este caso realmente lo hicimos
00:19: 57.10 algo de pensamiento racional.
00: 19: 58.09 Es decir, cuando obtuvimos la estructura de GLUT1,
00: 20: 00.22 Te dije que NG es importante, ¿verdad?
00: 20: 04.02 Así que introdujimos varios factores,
00: 20: 05.22 como la mutación E329Q,
00: 20: 08.28 es decir, para bloquear la conformación abierta hacia adentro,
00: 20: 10.19 y luego, cuando vemos la unión de NG a la proteína,
00: 20: 13.28 como puede ver en la cola,
00: 20: 16.01 la cola alifática de este detergente,
00: 20: 17.29 en realidad lo es
00: 20: 20.20 alineando el vestíbulo intracelular,
00: 20: 24.18 cuando la cantidad de azúcar es
00: 20: 27.19 coordinado específicamente por el dominio C-terminal.
00: 20: 30.06 Entonces, adelante.
00: 20: 31.18 entonces, básicamente, la presencia de esta cola alifática
00: 20: 35.00 excluye el cierre de estos dos dominios
00: 20: 39.00 en el lado intracelular,
00: 20: 40.22 es decir, para estabilizar esta conformación abierta hacia adentro
00: 20: 44.08 - con esta cola alifática,
00: 20: 46.19 no se puede cerrar, ¿verdad?
00: 20: 48.10 Entonces, en esta línea de pensamiento,
00: 20: 50.27 pensamos, si podemos encontrar una sustancia química,
00: 20: 53.07 un derivado de glucosa,
00: 20: 55.07 que tiene algunos grupos químicos
00: 20: 57.14 en el otro lado,
00: 20: 59.08 en la parte superior del anillo de azúcar,
00: 21: 01.06 probablemente eso pueda impedir
00: 21: 04.12 el cierre de la proteína en el lado extracelular,
00: 21: 07.01 es decir, capturar
00: 21: 09.24 una conformación abierta hacia afuera.
00:21: 11.02 ¿Tenemos este tipo de productos químicos?
00: 21: 12.29 Sí, tenemos muchos disacáridos
00: 21: 15.22 que son derivados de la glucosa.
00: 21: 17.28 Como se muestra aquí, seleccionamos algunos
00:21: 20.15 y examinamos su capacidad para inhibir la absorción de glucosa.
00: 21: 24.22 Como se muestra aquí, resulta que
00: 21: 26.27 la maltosa era un potente inhibidor,
00: 21: 28.26 y cuando revisamos la literatura
00: 21: 30.22 esto fue muy consistente,
00:21:32.00 porque se consideraba maltosa.
00: 21: 34.06 se sugirió como inhibidor exofacial,
00: 21: 37.26 eso significa que puede inhibir la absorción de glucosa
00: 21: 40.16 desde el lado extracelular.
00: 21: 44.10 Para abreviar una larga historia,
00: 21: 45.25 en presencia de maltosa
00:21: 47.29 de hecho cristalizamos la proteína
00: 21: 50.17 usando fase cúbica lipídica.
00:21: 52.14 Nos dio dos estructuras diferentes.
00:21: 56.01 Uno es casi idéntico a.
00: 22: 00.17 mostrado a la izquierda, es casi idéntico
00: 22: 01.28 al GLUT3 unido a glucosa,
00: 22: 04.17 y se ocluye de.
00: 22: 06.19 entonces, la maltosa está unida en el centro,
00: 22: 08.16 ocluido de cualquier lado de la membrana.
00:22: 11.01 Pero la otra forma de cristal
00:22: 15.03 nos da esta conformación abierta hacia afuera,
00:22: 18.22 así que esto fue realmente una casualidad,
00:22: 21.02 Quiero decir, los mezclamos juntos
00:22: 22.15 y nos dio dos estructuras cristalinas diferentes.
00:22: 25.12 Entonces, me enfocaré en la ilustración.
00: 22: 27.25 de esta conformación abierta hacia afuera,
00: 22: 29.02 con comparación del GLUT1 abierto hacia adentro
00: 22: 32.11 y el GLUT3 ocluido.
00:22: 34.10 Entonces, ahora tenemos estas tres conformaciones
00:22: 36.28 Lo mostré antes.
00:22: 38.06 Podríamos generar una transformación
00: 22: 40.03 que ilustra todo el proceso de transporte.
00:22: 44.17 Como ves aquí,
00: 22: 46.25 exterior abierto, llegada de glucosa,
00: 22: 48.24 y sufre este acceso alterno
00: 22: 52.00 por la rotación relativa de estos dos dominios,
00: 22: 55.23 y se libera el sustrato
00:22: 57.15 en el interior de la celda.
00: 23: 01.06 Y, muy interesante,
00: 23: 02.13 recuerda este pequeño dominio,
00: 23: 05.12 se muestra en amarillo,
00: 23: 06.27 es el ICH, dominio helicoidal intracelular,
00: 23: 09.17 y durante el cambio de conformación,
00: 23: 11.13 también podemos verlo
00: 23: 14.04 sufre un reordenamiento entre dominios.
00: 23: 15.26 En cierto modo, restringe
00: 23: 18.07 los dominios N y C
00: 23: 20.01 por abrir demasiado,
00: 23: 21.17 por lo que este dominio ICH,
00:23: 23.20 lo llamamos el pestillo,
00: 23: 25.17 para asegurar esta puerta intracelular.
00: 23: 31.07 Está bien.
00:23: 33.03 De la película, podrías pensar, hmm.
00: 23: 34.21 estos dos dominios se someten a una rotación de cuerpo rígido,
00: 23: 36.21 pero un examen detenido de las estructuras
00: 23: 39.27 del GLUT3 abierto y ocluido hacia afuera
00:23: 44.21 Sugiero, no, no es un cuerpo rígido.
00:23: 46.20 En realidad, podemos ver muy sofisticados
00: 23: 50.06 reordenamiento local de los elementos del dominio C.
00: 23: 53.27 Como se muestra aquí, el que se muestra en cian
00: 23: 57.06 es el dominio C
00: 24: 01.08 y el que está en verde es el dominio N.
00: 24: 02.03 Preste atención a este motivo TM7.
00: 24: 06.02 Puedes ver que se dobla, se dobla.
00: 24: 10.09 ¿Verdad? Este es TM7.
00: 24: 13.02 No solo una flexión.
00: 24: 15.07 así que, cuando se muestran las cadenas laterales,
00: 24: 17.06 verá que en realidad también se somete a una rotación,
00: 24: 21.28 por lo que este TM7 sufre
00: 24: 24.11 reordenamiento local muy complicado
00: 24: 27.20 doblando.
00: 24: 29.25 la combinación de flexión y rotación.
00: 24: 32.03 Entonces, si esto es inducido por la unión del sustrato
00: 24: 34.28 o este es el llamado equilibrio dinámico,
00: 24: 38.15 queda por caracterizar,
00: 24: 40.22 y nuestras simulaciones MD preliminares
00:24: 43.06 sugieren que este es un equilibrio dinámico.
00: 24: 47.00 incluso en ausencia de sustrato,
00:24:49.09 you can see this kind of conformational change of TM7.
00:24:53.00 Now, here's the question.
00:24:55.18 why the C-domain, shown in cyan,
00:24:58.04 is so flexible,
00:24:59.28 whereas the N-domain is just so rigid, as a stone?
00:25:03.25 And when we examine the interior of these two domains,
00:25:08.08 the answer is really clear.
00:25:09.22 So, as shown here,
00:25:12.10 the red dashes represent hydrogen bonds.
00:25:16.07 As you can see,
00:25:18.14 the interior of the N-domain is really hydrophilic,
00:25:22.28 so the high-resolution structure of GLUT3
00:25:25.18 allowed us to identify
00:25:29.02 seven water molecules within the N-domain of GLUT3,
00:25:32.12 and these water molecules, together,
00:25:34.02 interact with a set of groups of many polar residues
00:25:38.10 as a strip of hydrogen bonds,
00:25:40.01 and this stabilizes the N-domain,
00:25:45.12 so it makes it very rigid during conformation change.
00:25:48.04 In contrast, the interior of the C-domain
00:25:51.14 is highly hydrophobic,
00:25:54.12 as shown here,
00:25:55.29 so these hydrophobic residues,
00:25:57.12 they just contact each other
00:26:00.12 through Van der Waals interactions,
00:26:02.07 so they make the interior relatively greasy,
00:26:05.11 and that's easier for bending and rotation.
00:26:08.04 So, the structural analysis
00:26:10.08 really provides a good answer
00:26:12.05 to account for the distinct features
00:26:14.12 of the N-domain and the C-domain
00:26:16.04 during the alternating access cycle.
00:26:19.19 Alright.
00:26:21.06 Now, I'll.
00:26:23.01 shown here is the very simple diagram
00:26:25.03 of alternating access.
00:26:26.14 With our structures, the three structures,
00:26:27.28 we are able to
00:26:30.15 update this model with more sophisticated features.
00:26:34.24 As you can see, TM7
00:26:36.27 and also TM10,
00:26:38.18 they undergo local conformational change,
00:26:40.21 and the overall relative rotation
00:26:42.20 of the N- and the C-domains
00:26:44.11 results in the alternating exposure
00:26:48.15 of the substrate to either side of the membrane.
00:26:50.08 And, besides, please pay attention
00:26:52.19 to these yellow bars,
00:26:54.07 they are the intracellular ICH domain,
00:26:56.08 we call them the latch,
00:26:57.16 the intracellular latch.
00:26:59.05 Okay, now with the structure.
00:27:01.23 We were able to map the disease-related mutations.
00:27:06.12 Shown her is an example of the mutations
00:27:08.29 identified in patients
00:27:11.05 with the so-called GLUT-1 deficiency syndrome.
00:27:14.04 So, in total, more than 40 mutations were identified.
00:27:17.10 So, when we mapped them
00:27:19.06 onto the structure of GLUT1,
00:27:20.24 very interestingly we realized that
00:27:24.03 they clustered to three areas,
00:27:26.25 as shown here.
00:27:27.29 So, area 1 is really
00:27:31.11 involved in substrate binding
00:27:34.03 and it's easy to understand how mutations of this cluster
00:27:37.19 would affect substrate recognition or substrate binding,
00:27:40.13 hence compromising the transport activity.
00:27:44.11 And cluster 2, as shown here,
00:27:46.29 highlighted by this cyan circle.
00:27:50.22 the cyan circle.
00:27:53.09 so, basically they mapped to the interface
00:27:58.09 between ICH, N-domain, and C-domain,
00:28:01.14 and they together constitute the intracellular gate.
00:28:03.10 And, not surprisingly,
00:28:05.11 cluster 3 maps to the extracellular gate.
00:28:08.13 So, the structure really provides
00:28:11.01 a beautiful answer to
00:28:13.26 understand most of these disease-associated mutations,
00:28:16.24 so they either affect substrate binding
00:28:19.19 or the two gates,
00:28:21.03 hence affecting the alternating access cycle
00:28:24.06 of the protein.
00:28:25.18 Alright. Now, with these results,
00:28:27.12 we can address the questions
00:28:29.05 asked at the very beginning, right?
00:28:31.22 So, we know the architecture
00:28:33.16 and we provide a basis
00:28:35.20 to see the substrate selection
00:28:38.06 and we revealed three conformations of GLUT1 and GLUT3
00:28:43.08 during the transport cycle, the alternating access cycle,
00:28:48.07 and we provided some answers
00:28:49.29 to the disease-related mutations.
00:28:52.10 And, with regard to the mechanistic difference
00:28:56.10 between symporters and facilitators,
00:28:58.12 we are now doing some MD simulations
00:29:00.03 and biochemical characterizations,
00:29:02.02 and we have some tentative clues,
00:29:04.16 but this really requires further characterizations.
00:29:07.29 And now our focus has shifted to
00:29:11.02 the modulation of the transport activity
00:29:14.07 by lipids, as well as, you know,
00:29:16.09 the kinetic study of transport cycles.
00:29:18.25 And finally, we are very interested in
00:29:21.13 structure-based ligand design,
00:29:23.05 because these proteins are important drug targets.
00:29:27.06 So, with this, I would like to conclude my talk
00:29:29.15 by acknowledging the people
00:29:32.22 who made this work possible.
00:29:34.04 So, Dong, he was my postdoc
00:29:37.17 who has been the primary driver of this project,
00:29:40.17 he was leading this team of Tsinghua undergraduate students
00:29:44.00 and graduate students
00:29:45.13 to elucidate the structures
00:29:47.17 of both GLUT1 and GLUT3,
00:29:49.01 and he's now a professor in Tsinghua University.
00:29:51.23 And this work was in collaboration with many colleagues,
00:29:55.23 in Tsinghua or in the US,
00:29:57.10 as shown here.
00:29:59.21 And I'd like to thank you for watching this online seminar.

  • Part 1: Introduction to Membrane Transport Proteins

Cell biology: New molecular details about protein sorting in the cell

The targeted incorporation of proteins into the membrane is a vital process for cell maintenance these membrane proteins ensure the proper functioning of the cell's metabolism, communication with its environment, and energy supply. Protein-sorting mechanisms ensure that membrane proteins are specifically recognized among thousands of different proteins -- and are sent to the membrane, where they're needed. A team headed by Kärt Denks, a doctoral candidate in Professor Hans-Georg Koch's working group at the Institute of Biochemistry and Molecular Biology at the University of Freiburg, describes this molecular mechanism in detail in the journal Microbiología de la naturaleza, using the gut bacterium Escherichia coli. The researchers showed that the signal recognition particle (SRP), present in all living organisms, identifies correct proteins already during their synthesis.

Proteins are synthesized on ribosomes, functional units within the cell, which release proteins via a tunnel to the inner part of the cell. They are then sorted according to a pattern: Proteins to be transported contain an amino acid sequence which serves as a recognition signal for cellular sorting complexes. SRP is one of these complexes. It occurs in bacteria and in organisms with nucleated cells, and is responsible for the recognition of membrane proteins. From earlier investigations, the researchers knew that SRP recognizes membrane proteins even before they are fully synthesized. But there was debate over exactly when. At first it was assumed that the signal sequence had to have emerged completely from the ribosome protein tunnel for the membrane protein to be recognized. But subsequent work indicated that identification took place long before the signal sequence left the ribosome. The new Freiburg research confirms this.

The researchers used a technique which enabled them to examine the contacts between the ribosome and SRP right down to the level of individual amino acids -- the very building-blocks of proteins. The team showed that SRP scans the ribosome protein tunnel to find potential substrate proteins. When it recognizes a protein of the right kind, it retracts to the end of the tunnel and positions its binding pocket in order to form a stable complex with the membrane protein. Once it has done that, the SRP begins the process of moving the synthesizing ribosome to its target site at the membrane: where it binds to protein transport channels in order to anchor the protein into the membrane. If this early-recognition fails -- if for instance the contact points between the SRP and the ribosomal tunnel have been genetically modified -- membrane proteins pile up because they cannot be correctly positioned in the membrane. This leads to cell-division defects.

The research reveals a new complexity in the interaction between ribosomes and protein-sorting complexes: the ribosomal tunnel, long regarded as a passive tube, plays a key role in the coordination of processes which begin during the synthesis of proteins.

Hans-Georg Koch is the principle investigator of the German Research Foundation-sponsored research training group 2202, "Transport across and into membranes" and of the Faculty of Medicine's doctoral training group "MOTI-VATE." He is also vice-director of the Spemann Graduate School of Biology and Medicine (SGBM).


Contenido

Asimetría Editar

La bicapa lipídica consta de dos capas: una valva externa y una interna. [1] Los componentes de las bicapas se distribuyen de forma desigual entre las dos superficies para crear asimetría entre las superficies exterior e interior. [2] Esta organización asimétrica es importante para funciones celulares como la señalización celular. [3] La asimetría de la membrana biológica refleja las diferentes funciones de las dos valvas de la membrana. [4] Como se ve en el modelo de membrana fluida de la bicapa de fosfolípidos, la valva externa y la valva interna de la membrana son asimétricas en su composición. Ciertas proteínas y lípidos descansan solo en una superficie de la membrana y no en la otra.

• Tanto la membrana plasmática como las membranas internas tienen caras citosólicas y exoplasmáticas. • Esta orientación se mantiene durante el tráfico de la membrana: las proteínas, lípidos, glicoconjugados que miran hacia la luz del RE y Golgi se expresan en el lado extracelular de la membrana plasmática. En las células eucarióticas, los nuevos fosfolípidos son fabricados por enzimas unidas a la parte de la membrana del retículo endoplásmico que se enfrenta al citosol. [5] Estas enzimas, que utilizan ácidos grasos libres como sustratos, depositan todos los fosfolípidos recién formados en la mitad citosólica de la bicapa. Para permitir que la membrana en su conjunto crezca de manera uniforme, la mitad de las nuevas moléculas de fosfolípidos deben transferirse a la monocapa opuesta. Esta transferencia es catalizada por enzimas llamadas flippases. En la membrana plasmática, las flippases transfieren fosfolípidos específicos de forma selectiva, de modo que los diferentes tipos se concentran en cada monocapa. [5]

Sin embargo, el uso de flippases selectivos no es la única forma de producir asimetría en las bicapas lipídicas. En particular, opera un mecanismo diferente para los glicolípidos, los lípidos que muestran la distribución asimétrica más llamativa y consistente en las células animales. [5]

Lípidos Editar

La membrana biológica está formada por lípidos con colas hidrófobas y cabezas hidrófilas. [6] Las colas hidrófobas son colas de hidrocarburos cuya longitud y saturación son importantes para caracterizar la célula. [7] Las balsas de lípidos se producen cuando las especies de lípidos y las proteínas se agregan en dominios de la membrana. Estos ayudan a organizar los componentes de la membrana en áreas localizadas que están involucradas en procesos específicos, como la transducción de señales.

Los glóbulos rojos o eritrocitos tienen una composición lipídica única. La bicapa de glóbulos rojos está compuesta por colesterol y fosfolípidos en proporciones iguales en peso. [7] La ​​membrana de los eritrocitos juega un papel crucial en la coagulación de la sangre. En la bicapa de los glóbulos rojos se encuentra la fosfatidilserina. [8] Suele estar en el lado citoplásmico de la membrana. Sin embargo, se voltea a la membrana externa para usarse durante la coagulación de la sangre. [8]

Proteínas Editar

Las bicapas de fosfolípidos contienen diferentes proteínas. Estas proteínas de membrana tienen varias funciones y características y catalizan diferentes reacciones químicas. Las proteínas integrales atraviesan las membranas con diferentes dominios en cada lado. [6] Las proteínas integrales mantienen una fuerte asociación con la bicapa lipídica y no pueden desprenderse fácilmente. [9] Se disociarán solo con un tratamiento químico que rompa la membrana. Las proteínas periféricas se diferencian de las proteínas integrales en que mantienen interacciones débiles con la superficie de la bicapa y pueden disociarse fácilmente de la membrana. [6] Las proteínas periféricas están ubicadas en una sola cara de una membrana y crean asimetría en la membrana.

ALGUNOS EJEMPLOS DE PROTEÍNAS DE MEMBRANA DE PLASMA Y SUS FUNCIONES
CLASE FUNCIONAL EJEMPLO DE PROTEÍNA FUNCIÓN ESPECÍFICA
Transportadores Bomba de Na + bombea activamente Na + fuera de las células y K + en
Anclas integrinas enlazar los filamentos de actina intracelular con las proteínas de la matriz extracelular
Receptores receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas Se une al PDGF extracelular y, como consecuencia, genera señales intracelulares que hacen que la célula crezca y se divida.
Enzimas adenilil ciclasa cataliza la producción de la molécula de señalización intracelular AMP cíclico en respuesta a señales extracelulares

Oligosacáridos Editar

Los oligosacáridos son polímeros que contienen azúcar. En la membrana, pueden unirse covalentemente a lípidos para formar glicolípidos o unirse covalentemente a proteínas para formar glicoproteínas. Las membranas contienen moléculas de lípidos que contienen azúcar conocidas como glicolípidos. En la bicapa, los grupos de azúcar de los glicolípidos están expuestos en la superficie celular, donde pueden formar enlaces de hidrógeno. [9] Los glucolípidos proporcionan el ejemplo más extremo de asimetría en la bicapa lipídica. [10] Los glucolípidos realizan una gran cantidad de funciones en la membrana biológica que son principalmente comunicativas, incluido el reconocimiento celular y la adhesión célula-célula. Las glicoproteínas son proteínas integrales. [2] Desempeñan un papel importante en la respuesta inmunitaria y la protección. [11]

La bicapa de fosfolípidos se forma debido a la agregación de lípidos de membrana en soluciones acuosas. [4] La agregación es causada por el efecto hidrofóbico, donde los extremos hidrofóbicos entran en contacto entre sí y son secuestrados lejos del agua. [6] Esta disposición maximiza los enlaces de hidrógeno entre las cabezas hidrofílicas y el agua mientras minimiza el contacto desfavorable entre las colas hidrofóbicas y el agua. [10] El aumento de los enlaces de hidrógeno disponibles aumenta la entropía del sistema, creando un proceso espontáneo.

Las moléculas biológicas son anfifílicas o anfipáticas, es decir, son simultáneamente hidrofóbicas e hidrofílicas. [6] La bicapa de fosfolípidos contiene grupos de cabeza hidrófilos cargados, que interactúan con el agua polar. Las capas también contienen colas hidrófobas, que se encuentran con las colas hidrófobas de la capa complementaria. Las colas hidrófobas suelen ser ácidos grasos que difieren en longitudes. [10] Las interacciones de los lípidos, especialmente las colas hidrófobas, determinan las propiedades físicas de la bicapa lipídica, como la fluidez.

Las membranas en las células definen típicamente espacios o compartimentos cerrados en los que las células pueden mantener un entorno químico o bioquímico que difiere del exterior. Por ejemplo, la membrana alrededor de los peroxisomas protege al resto de la célula de los peróxidos, sustancias químicas que pueden ser tóxicas para la célula, y la membrana celular separa una célula de su medio circundante. Los peroxisomas son una forma de vacuola que se encuentra en la célula y que contiene subproductos de reacciones químicas dentro de la célula. La mayoría de los orgánulos están definidos por tales membranas y se denominan orgánulos "unidos a membrana".

Permeabilidad selectiva Editar

Probablemente, la característica más importante de una biomembrana es que es una estructura selectivamente permeable. Esto significa que el tamaño, la carga y otras propiedades químicas de los átomos y moléculas que intenten cruzarlo determinarán si lo logran. La permeabilidad selectiva es esencial para la separación efectiva de una célula u orgánulo de su entorno. Las membranas biológicas también tienen ciertas propiedades mecánicas o elásticas que les permiten cambiar de forma y moverse según sea necesario.

Generalmente, las moléculas hidrófobas pequeñas pueden atravesar fácilmente las bicapas de fosfolípidos mediante difusión simple. [12]

Las partículas que son necesarias para la función celular pero que no pueden difundirse libremente a través de una membrana entran a través de una proteína de transporte de membrana o se absorben mediante endocitosis, donde la membrana permite que una vacuola se una a ella y empuje su contenido hacia la célula. Muchos tipos de membranas plasmáticas especializadas pueden separar las células del ambiente externo: apicales, basolaterales, presinápticas y postsinápticas, membranas de flagelos, cilios, microvellosidades, filopodios y lamelipodios, el sarcolema de las células musculares, así como mielina especializada y membranas de la columna dendrítica de neuronas. Las membranas plasmáticas también pueden formar diferentes tipos de estructuras "supramembrana" tales como caveolas, densidad postsináptica, podosoma, invadopodio, desmosoma, hemidesmosoma, adhesión focal y uniones celulares. Estos tipos de membranas difieren en la composición de lípidos y proteínas.

Distintos tipos de membranas también crean orgánulos intracelulares: endosoma retículo endoplásmico liso y rugoso retículo sarcoplásmico Aparato de Golgi lisosoma mitocondria (membranas internas y externas) núcleo (membranas internas y externas) peroxisoma vacuola gránulos citoplásmicos vesículas celulares (fagosoma, autofagosoma, vesículas recubiertas de clatrina Vesículas recubiertas de COPI y recubiertas de COPII) y vesículas secretoras (incluidos sinaptosomas, acrosomas, melanosomas y gránulos de cromafina). Los diferentes tipos de membranas biológicas tienen diversas composiciones de lípidos y proteínas. El contenido de las membranas define sus propiedades físicas y biológicas. Algunos componentes de las membranas juegan un papel clave en la medicina, como las bombas de eflujo que bombean los medicamentos fuera de la célula.

Fluidez Editar

El núcleo hidrófobo de la bicapa de fosfolípidos está en constante movimiento debido a las rotaciones alrededor de los enlaces de las colas lipídicas. [13] Las colas hidrofóbicas de una bicapa se doblan y se bloquean. Sin embargo, debido al enlace de hidrógeno con el agua, los grupos de cabeza hidrófilos exhiben menos movimiento ya que su rotación y movilidad están restringidas. [13] Esto da como resultado un aumento de la viscosidad de la bicapa lipídica más cerca de las cabezas hidrofílicas. [6]

Por debajo de una temperatura de transición, una bicapa lipídica pierde fluidez cuando los lípidos altamente móviles exhiben menos movimiento y se convierten en un sólido similar a un gel. [14] La temperatura de transición depende de componentes de la bicapa lipídica como la longitud de la cadena de hidrocarburos y la saturación de sus ácidos grasos. La fluidez de la dependencia de la temperatura constituye un atributo fisiológico importante para las bacterias y los organismos de sangre fría. Estos organismos mantienen una fluidez constante modificando la composición de ácidos grasos de lípidos de la membrana de acuerdo con diferentes temperaturas. [6]

En las células animales, la fluidez de la membrana está modulada por la inclusión del esterol colesterol. Esta molécula está presente en cantidades especialmente grandes en la membrana plasmática, donde constituye aproximadamente el 20% de los lípidos en la membrana en peso. Debido a que las moléculas de colesterol son cortas y rígidas, llenan los espacios entre las moléculas de fosfolípidos vecinas que dejan los pliegues en sus colas de hidrocarburos insaturados. De esta forma, el colesterol tiende a endurecer la bicapa, haciéndola más rígida y menos permeable. [5]

Para todas las células, la fluidez de la membrana es importante por muchas razones. Permite que las proteínas de membrana se difundan rápidamente en el plano de la bicapa e interactúen entre sí, como es crucial, por ejemplo, en la señalización celular. Permite que los lípidos y proteínas de la membrana se difundan desde los sitios donde se insertan en la bicapa después de su síntesis a otras regiones de la célula. Permite que las membranas se fusionen entre sí y mezclen sus moléculas, y asegura que las moléculas de la membrana se distribuyan uniformemente entre las células hijas cuando una célula se divide. Si las membranas biológicas no fueran fluidas, es difícil imaginar cómo las células podrían vivir, crecer y reproducirse. [5]


Conclusion and perspectives

The use of nanodiscs is rapidly spreading, as facilitated by ready access to the genes encoding membrane scaffold proteins from AddGene and purified proteins from Sigma or BioNanoCon. In addition to the established applications of nanodisc technology, some recent developments have suggested new ideas, such as the generation of therapeutic antibodies against antigens incorporated into nanodiscs 68 and various en vivo uses of nanodiscs, including drug delivery 69 , imaging 70 and vaccine development. An exciting application is the ability to generate soluble MP libraries that faithfully represent a starting MP composition, with individual nanodiscs carrying a specific target 5 . By allowing high-throughput screening of MPs, nanodiscs can potentially facilitate the discovery of new approaches to therapeutic intervention.



Comentarios:

  1. Vudolar

    Dime dónde puedo leer sobre esto.

  2. Yocage

    Lo siento, eso ha interferido... Entiendo esta pregunta. Vamos a discutir. Escribe aquí o en PM.

  3. Tojajind

    Creo que estabas equivocado. Estoy seguro. Intentemos discutir esto.

  4. Abida

    Gracias por su ayuda en este asunto, cuanto más simple, mejor ...

  5. Ajani

    También me preocupa sobre este problema. ¿No me digas dónde puedo encontrar más información sobre este tema?



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