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¿Cuál es el mejor organismo modelo para implementar un estudio evolutivo para P. falciparum?

¿Cuál es el mejor organismo modelo para implementar un estudio evolutivo para P. falciparum?



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Tengo que estudiar e implementar algunas estadísticas evolutivas para P. falciparum. En su opinión y por su experiencia, ¿qué organismo debo considerar para llevar a los ortólogos para implementar este estudio? En general, si quisiera extender este estudio a P.knowlesi, P.vivax y en general a todos los parásitos evolutivos. relacionado con el plasmodio del mono asiático, ¿qué organismo me sugieres que considere como plantilla? Pensé en P.berghei pero, dado que también tengo que considerar los parásitos Vinckeia (plasmodios de ratón), ¿hay algún organismo bueno, fuera del género plasmodium, que pueda ser útil como punto de referencia para todas estas especies?

Obligado


Estructura genética de la población y aptitud de Daphnia pulicaria a través de un gradiente de pH en tres lagos de América del Norte

Comprender la respuesta evolutiva de los organismos a los gradientes ambientales es importante a la luz de los crecientes cambios antropogénicos en nuestro entorno. En este estudio, utilizamos herramientas genéticas ecológicas para determinar la adaptación local del organismo modelo, Daphnia pulicaria, a través de un gradiente de pH en tres lagos de América del Norte. Predijimos que habría diferenciación genética y adaptación local entre las tres poblaciones de D. pulicaria. Para evaluar el grado de diferenciación genética, genotipamos al individuo D. pulicaria utilizando 15 loci de microsatélites en las tres poblaciones y realizó un análisis de ESTRUCTURA corroborado con PCA basado en la distancia genética de Nei y múltiples F S t comparaciones. Para probar las firmas de adaptación local, se realizó un experimento de supervivencia a través de un gradiente de pH en condiciones de jardín común. Determinamos que cada una de las tres poblaciones estaba genéticamente diferenciada entre sí, con poblaciones de Hill y Madison Lake de D. pulicaria siendo más similares entre sí que el de la población de Frenchman Lake. Los resultados del experimento de supervivencia mostraron una señal de adaptación local, con Frenchman Lake mostrando una mayor supervivencia a un pH más bajo [

6.5] en comparación con las poblaciones de Hill y Madison, mientras que tanto Hill como Madison tuvieron una mayor supervivencia a un pH más alto [7.9 y 8.6, respectivamente] en comparación con la población francesa.

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Abstracto

Fondo

Con una transmisión de la malaria baja y marcadamente estacional, se necesitan herramientas cada vez más sensibles para estratificar mejor el riesgo de infección y focalizar las intervenciones de control. Se realizó una encuesta transversal para caracterizar los patrones actuales de transmisión de la malaria, identificar puntos críticos y detectar cambios recientes utilizando medidas parasitológicas y serológicas en tres sitios de la Amazonía peruana.

Material y métodos

Después del censo completo de la población de estudio, se entrevistó a 651 participantes, se les examinó clínicamente y se les tomó una muestra de sangre para la detección de parásitos de la malaria (microscopía y PCR) y anticuerpos contra PAG. vivax (PvMSP119, PvAMA1) y PAG. falciparum (PfGLURP, PfAMA1) por ELISA. Los factores de riesgo de infección por malaria (PCR positiva) y exposición a la malaria (seropositividad) se evaluaron mediante modelos de regresión logística de encuestas multivariadas. La seroprevalencia específica por edad se analizó utilizando un modelo de conversión catalítica reversible basado en la probabilidad máxima de generar tasas de seroconversión (SCR, λ). Se utilizó SaTScan para detectar agrupaciones espaciales de individuos positivos a la serología dentro de cada sitio.

Resultados

La prevalencia general de parásitos por PCR fue baja, es decir, 3,9% para PAG. vivax y 6,7% para PAG. falciparum, mientras que la seroprevalencia fue sustancialmente mayor, 33,6% para PAG. vivax y 22,0% para PAG. falciparum, con grandes diferencias entre los sitios de estudio. La edad y la ubicación (sitio) se asociaron significativamente con PAG. vivax exposición, mientras que la ubicación, la edad y la ocupación al aire libre se asociaron con PAG. falciparum exposición. PAG. falciparum Las curvas de seroprevalencia mostraron una transmisión estable a lo largo del tiempo, mientras que para PAG. vivax La transmisión se describió mejor con un modelo con dos SCR. El análisis espacial identificó grupos bien definidos de PAG. falciparum individuos seropositivos en dos sitios, mientras que solo detectó un grupo muy pequeño de PAG. vivax exposición.

Conclusión

El uso de una única encuesta parasitológica y serológica del paludismo ha demostrado ser un método eficaz y preciso para caracterizar la heterogeneidad específica de la especie en la transmisión del paludismo a nivel microgeográfico, así como para identificar cambios recientes en la transmisión.

Citación: Rosas-Aguirre A, Speybroeck N, Llanos-Cuentas A, Rosanas-Urgell A, Carrasco-Escobar G, Rodriguez H, et al. (2015) Puntos críticos de transmisión de la malaria en la Amazonía peruana: evaluación rápida a través de una encuesta parasitológica y serológica. PLoS ONE 10 (9): e0137458. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137458

Editor: Luzia Helena Carvalho, Centro de Pesquisa Rene Rachou / Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz-Minas), BRASIL

Recibió: 21 de abril de 2015 Aceptado: 17 de agosto de 2015 Publicado: 10 de septiembre de 2015

Derechos de autor: © 2015 Rosas-Aguirre et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del documento y sus archivos de información de respaldo.

Fondos: El estudio fue financiado por la Dirección General de Cooperación al Desarrollo (DGCD) del Gobierno de Bélgica dentro del Tercer Acuerdo Marco de Colaboración Institucional entre el Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humboldt” - Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima y el Instituto Tropical Medicina en Amberes, Bélgica (proyecto FA3-II, 2011-2013)). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.


Introducción

Comprender los patrones espacio-temporales de propagación de patógenos es crucial para implementar acciones efectivas para contener epidemias (Ostfeld et al. 2005 Vander Wal et al. 2014). Los patógenos de la vida silvestre, incluidos algunos que pueden ser muy dañinos para los seres humanos y el ganado, se transmiten cuando los huéspedes infectados entran en contacto directo o indirecto con personas no infectadas. En las enfermedades de transmisión directa e indirecta, se espera que el grado y la velocidad de propagación estén relacionados con la capacidad de dispersión de los hospedadores (Biek y Real 2010). Por lo tanto, se requiere información sobre el movimiento y la dispersión de los huéspedes para identificar las posibles vías de propagación. Por ejemplo, los ríos y las carreteras parecen retrasar la propagación de la emaciación crónica en el venado de cola blanca (Odocoileus virginianus), muy probablemente porque actúan como barreras para la dispersión y el flujo de genes de esta especie (Blanchong et al. 2008). De manera similar, los ríos grandes obstaculizan el flujo de genes en los mapaches (Procyon lotor) y puede reducir la propagación de la variante de la rabia del mapache (RRV Cullingham et al. 2009). Por lo tanto, es probable que las operaciones de control que tienen como objetivo contener y eventualmente erradicar una enfermedad determinada sean más eficientes si se colocan junto a estas barreras para fortalecer su efecto (Russell et al. 2006). Esta estrategia fue adoptada y evitó la propagación hacia el norte de RRV en Ontario (Canadá), en 1999 (Rosatte et al. 2001). La distribución de cebos de vacunas orales a lo largo de los principales ríos para controlar la rabia se realizó ya en la década de 1980 para los zorros rojos (Vulpes vulpes), contribuyendo eventualmente a la eliminación de la rabia en Suiza (Wandeler et al. 1988).

No todas las barreras ambientales para la dispersión de hospedadores y la diseminación de patógenos, ya sean de origen natural o antropogénico, son espacialmente discretas o fácilmente identificables, como ríos y carreteras, sino que pueden ser continuas o seguir un gradiente de condiciones bióticas o abióticas (Storfer et al. 2007). El clima (Geffen et al. 2004), la elevación (Shirk et al. 2010) y la presencia de hábitats inadecuados (Goldberg y Waits 2010) son todos ejemplos de tales condiciones limitantes. Según la ecología, el comportamiento y la capacidad de dispersión de las especies hospedadoras, estas características pueden restringir la dispersión de patógenos o promoverla a través de corredores de dispersión. La integración de las características ambientales en los modelos de propagación de enfermedades puede ayudar a predecir la propagación y la expansión geográfica de una enfermedad (Ostfeld et al. 2005).

Hay diferentes enfoques disponibles para comprender los efectos de la composición del hábitat sobre el movimiento y la dispersión de los animales. El primero se basa en la captura de animales para determinar su densidad y selección de recursos (Manly et al. 2002), lo que requiere tiempo y recursos importantes para recolectar muestras de gran tamaño. También se han realizado estudios utilizando transmisores de muy alta frecuencia (VHF) y, más recientemente, radiotelemetría del sistema de posicionamiento global (GPS) para rastrear el movimiento de los animales y analizar el uso del hábitat (Cagnacci et al. 2010). A pesar de las constantes mejoras tecnológicas, la recopilación de grandes conjuntos de datos GPS sigue siendo muy costosa y desafiante desde el punto de vista logístico para varias especies. Las simulaciones espaciales también se pueden utilizar para caracterizar los factores que afectan el movimiento y la conectividad entre los individuos de una población (Russell et al. 2006 Rees et al. 2013). Si bien estos modelos pueden aportar conocimientos sobre los vínculos entre el hábitat y la dispersión, la calidad de los resultados del modelo dependerá de una caracterización adecuada de los procesos ecológicos, que solo se puede obtener mediante una evaluación empírica. Finalmente, otro enfoque se basa en herramientas proporcionadas por la genética del paisaje, una disciplina que integra aspectos de la genética de poblaciones, la ecología del paisaje y el análisis espacial. Este campo ha progresado enormemente en los últimos 10 años (Manel y Holderegger 2013). Por lo general, los genetistas de paisajes están interesados ​​en describir cómo el flujo de genes entre poblaciones o subpoblaciones se ve influenciado en paisajes a menudo heterogéneos y fragmentados, lo que lleva a estimaciones de conectividad funcional (Manel y Holderegger 2013). Sin embargo, medir el flujo de genes entre grupos de individuos impone limitaciones a la interpretabilidad de los resultados en términos de conectividad funcional porque (i) puede haber importantes discrepancias entre el flujo de genes y la dispersión ecológica, es decir, el movimiento entre parches de hábitat puede no estar necesariamente asociado con oportunidades de apareamiento (Garant et al. 2007), y (ii) el flujo de genes medido entre poblaciones refleja la migración que ha ocurrido durante varias generaciones en el pasado y puede no reflejar con precisión los procesos ecológicos actuales (Epps et al. 2007), incluido el sexo diferencias específicas. Idealmente, la unidad operativa en genética del paisaje debería ser el individuo (Manel et al.2003), en cuyo caso las estimaciones de parentesco genético se pueden utilizar como la variable de respuesta a la conectividad del paisaje del modelo de acuerdo con las características del hábitat (Segelbacher et al.2010 Etherington 2011 Shafer et al.2012).

La rabia es enzoótica para muchas especies de murciélagos y carnívoros en todo el mundo y tiene un período de incubación promedio relativamente largo (entre 30 y 90 días) en comparación con un período de morbilidad corto (2 & # x0201310 días) que casi siempre conduce a la muerte (Leung et al. al.2007). En el este de América del Norte, la cepa de rabia terrestre predominante es la RRV, que se ha extendido en poblaciones silvestres de mapaches y zorrillos rayados (Mefitis mefitis, en adelante zorrillos, Guerra et al. 2003). Esta variante de la rabia estuvo históricamente restringida a Florida, pero los mapaches infectados se trasladaron inadvertidamente a Virginia a fines de la década de 1970 y desde entonces el virus se ha expandido hacia el norte a una velocidad de 30 & # x0201350 km / año (Rupprecht et al. 2002). En Canadá, se detectó por primera vez en el sur de Ontario en 1999 (Rosatte et al. 2001), luego en New Brunswick en 2000 y finalmente en Qu & # x000e9bec en 2006 (Rees et al. 2011). Aquí, usamos estimaciones de parentesco genético derivadas de genotipos de microsatélites multilocus para determinar qué características del paisaje promovieron o limitaron la dispersión de los dos huéspedes principales de RRV en un área intensamente estudiada del sur de Qu & # x000e9bec donde esta enfermedad viral aún está bajo vigilancia, control y actividades de investigación (Boyer et al.2011 Houle et al.2011 Rees et al.2011 C & # x000f4t & # x000e9 et al.2012 Mainguy et al.2012 Talbot et al.2012).

El trabajo anterior en el área de estudio (sureste de Qu & # x000e9bec) ha mostrado muy poca estructuración genética en mapaches y zorrillos residentes, y las carreteras y ríos generalmente generan un efecto bastante débil en los patrones de diferenciación genética (C & # x000f4t & # x000e9 et al. 2012 Talbot et al.2012). Estos resultados equívocos pueden ocultar el efecto de variables espaciales no medidas y no permiten modelar la dispersión de mesocarnívoros a escala de paisaje. Nuestro principal objetivo aquí fue basarnos en los resultados genéticos poblacionales obtenidos en el trabajo anterior, utilizando un enfoque que aplica análisis genéticos del paisaje y modelos espacialmente explícitos, para predecir las vías más probables de dispersión de zorrillos y mapaches y, por extensión, la propagación de la rabia terrestre. en esta área. Con base en el conocimiento ecológico del uso del hábitat por estos dos huéspedes, esperábamos que la dispersión en ambas especies se redujera en los campos agrícolas, pero esperábamos que el movimiento aumentara en hábitats caracterizados por una alta densidad de bordes (por ejemplo, Glueck et al. 1988 Dijak y Thompson 2000 Larivi & # x000e8re y Messier 2000). Esperábamos que las mofetas fueran más sensibles a la presencia de campos y áreas residenciales que los mapaches, ya que los mapaches suelen mostrar una mayor afinidad por la dispersión y usan campos de maíz y otras fuentes de alimentos relacionadas con los humanos (Riley et al. 1998 Prange et al. 2004). También esperábamos que las hembras fueran más sensibles a la estructura del paisaje que los machos en ambas especies, ya que la dispersión suele estar sesgada por los machos en los mamíferos en general (Greenwood 1980), incluidos los mapaches y las mofetas (Cullingham et al.2008 C & # x000f4t & # x000e9 et al. 2012 Talbot et al.2012). Hasta donde sabemos, este es el primer trabajo empírico que aborda el movimiento de estos dos importantes hospedadores de rabia en un marco de genética del paisaje espacialmente explícito y también el primer intento de cuantificar el efecto de la composición del hábitat en su dispersión. Este trabajo es importante para perfeccionar los modelos predictivos de propagación de la rabia que utilizan ríos (u otras barreras discretas como las cadenas montañosas) e índices de densidad humana para predecir la tasa de propagación de la rabia (p. Ej., Smith et al. 2002 Russell et al. 2005, 2006 ).


CRISPR-Cas9: Institut Curie se equipa con tijeras genéticas para cribado

CRISPR-Cas9 funciona como unas tijeras capaces de cortar el genoma con precisión. Esta tecnología se basa en un complejo compuesto por un pequeño ARN llamado & # 8220guide & # 8221 y la nucleasa Cas9. El complejo así formado se une a una secuencia de ADN específica, complementaria al ARN guía. Esta unión es seguida por un corte de doble hebra del ADN por Cas9. Los mecanismos de reparación del ADN se pueden utilizar posteriormente para introducir mutaciones precisas. De esta manera, los investigadores pueden manipular el ADN para suprimir la función de un gen o reemplazarlo con un gen modificado (el llamado método de & # 8220 recombinación homóloga & # 8221).

CRISPR-Cas9, ¿una nueva tecnología? El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) ha existido durante millones de años. Las bacterias lo utilizan como un mecanismo de defensa inmunológico adaptativo contra los virus. La metodología es simple y extremadamente efectiva: al ingresar a las bacterias, el genoma viral es reconocido por este sistema de memoria inmune dedicado. Las bacterias luego destruyen el genoma de su enemigo cortándolo.

El uso de nucleasas programables con fines de modificación del genoma ha estado en marcha durante aproximadamente 12 años en los laboratorios. Sin embargo, las nucleasas de primera generación fueron muy complejas de implementar. CRISPR-Cas9 es revolucionario en su facilidad de programación, velocidad de ejecución y menor costo en comparación con otras nucleasas. La alta flexibilidad del sistema CRISPR-Cas9 permite realizar experimentos de cribado genético. Esta metodología implica la mutación de todos los genes conocidos en una población de células, cada célula portando una sola mutación. Entonces es posible determinar qué genes están involucrados en un proceso biológico de interés (crecimiento celular, resistencia a tratamientos, etc.).

Se acaba de crear una nueva plataforma de cribado genético basada en CRISPR-Cas9 en el centro de investigación Institut Curie & # 8217s. La plataforma CRISPR & # 8217it ha generado mucho entusiasmo. & # 8221 Ya estamos trabajando con 15 equipos de investigación que abarcan varios temas & # 8220, dice Camille Fouassier, gerente de la plataforma.

La evolución de la tecnología
La tecnología CRISPR-Cas9 todavía tiene limitaciones importantes. Solo se puede usar en ciertos sitios de la secuencia de ADN. Y el complejo sgRNA / Cas9 puede cortar secuencias que se asemejan a la secuencia objetivo (los llamados & # 8216off objetivos & # 8221). Además, el corte de ADN puede inducir un estado de estrés celular y, por lo tanto, sesgar el análisis de los fenotipos resultantes. Finalmente, el proceso de reparación del ADN conduce a tipos de mutaciones muy variables que no siempre eliminan la función genética.

Para superar estas limitaciones, los científicos están trabajando en derivados del sistema CRISPR-Cas9. Los enfoques alternativos que se están estudiando incluyen un derivado más preciso y menos tóxico que introduce sustituciones de ADN. En particular, este método tiene la capacidad de cambiar un codón en una señal de parada prematura para la síntesis de proteínas (codón & # 8220stop & # 8221).

Otros derivados aprovechan la oportunidad que ofrece el sistema CRISPR-Cas9 para apuntar a una secuencia de ADN de interés. En lugar de utilizar la actividad nucleasa CAS9 para editar la secuencia de ADN, se puede utilizar el reclutamiento CAS9 local para modular los procesos biológicos suprayacentes. Por ejemplo, es posible aumentar o disminuir la expresión génica o modificar localmente la composición química del ADN o de las proteínas histonas asociadas a él. Estos cambios químicos a su vez influyen en diferentes procesos biológicos como la reparación del ADN o la expresión génica.

Aplicaciones de CRISPR-Cas9 en el Institut Curie
Las aplicaciones en la investigación son inmensas, ya que los biólogos ahora tienen la capacidad de introducir todo tipo de modificaciones genéticas en células u organismos modelo. En solo unos años, CRISPR-Cas9 se ha convertido en una herramienta central en muchos programas de investigación.

En particular, el cribado genético por CRISPR-Cas9 representa un activo clave para la investigación del cáncer. Por ejemplo, es posible abordar el problema de la resistencia a los tratamientos antitumorales. El cribado genético se puede utilizar para identificar genes cuya mutación hace que las células sean resistentes a una molécula terapéutica. La tecnología también se utiliza para identificar el talón de Aquiles de cada tipo de cáncer mediante un enfoque de letalidad sintética. Esta última estrategia se basa en el supuesto de que las mutaciones que causan cáncer crean nuevas vulnerabilidades que pueden usarse para destruir células cancerosas. Aunque el cribado CRISPR-Cas9 se implementa con mayor frecuencia en in vitro sistemas de cultivo celular, la ambición de la nueva plataforma es trabajar lo más cerca posible del entorno tumoral natural. En particular, los sistemas de cultivo 3D (conocidos como organoides), que recrean in vitro parte de las propiedades arquitectónicas de los tumores, representan sistemas de modelos atractivos. Un enfoque que también se está investigando es el uso de pantallas genéticas en xenoinjertos derivados de pacientes, que actualmente representan los mejores modelos de cáncer para estudios preclínicos.

Otra aplicación de la tecnología es el estudio de mutaciones recurrentes que se encuentran en el cáncer. Estas mutaciones pueden provocar un aumento de la actividad de las proteínas oncogénicas o, por el contrario, una pérdida de la función de las proteínas que inhiben el desarrollo tumoral. Sin embargo, todavía comprendemos poco la función de la mayoría de los genes mutados en el cáncer. & # 8221 Al reintroducir estas anomalías genéticas en las líneas celulares gracias a CRISPR-Cas9, los investigadores pueden evaluar su impacto en el desarrollo del tumor & # 8221, dijo Michel Wassef, científico codirector de la plataforma.

También se están desarrollando aplicaciones para la inmunoterapia. Los linfocitos T extraídos de pacientes se modifican genéticamente para expresar un receptor quimérico programado para reconocer un marcador tumoral (células CAR T) y así destruir las células enfermas.


Resultados

Análisis del espacio químico

Inicialmente, un umbral de actividad de 1 μM basado en la mitad de la concentración efectiva máxima (CE50) contra PAG. falciparum se definió para la discriminación entre compuestos activos e inactivos previamente probados contra estadios sanguíneos asexuales de PAG. falciparum. Además, un umbral de 10 μM basado en la concentración citotóxica media máxima (CC50) para las células NIH / 3T3 se definió para la discriminación entre compuestos tóxicos y no tóxicos [42]. El análisis del espacio químico se realizó utilizando los conjuntos de datos seleccionados (ver Materiales y métodos) para las etapas eritrocíticas de PAG. falciparum Conjunto de datos de cepas 3D7 (sensibles a la cloroquina) que contiene 1162 compuestos (PAG. falciparum conjunto de datos) y el conjunto de datos de citotoxicidad probado contra fibroblastos embrionarios de ratón (línea celular NIH / 3T3) que contiene 1270 compuestos (conjunto de datos de citotoxicidad). Este análisis se ha realizado agrupando ambos conjuntos de datos por separado, lo que reveló que ambos son muy diferentes estructuralmente y contienen grupos más pequeños de compuestos similares (Figura 2).

Análisis de conglomerados de A) 1.162 compuestos de PAG. falciparum conjunto de datos y B) 1270 compuestos del conjunto de datos de citotoxicidad. El dendrograma y el mapa de calor de la matriz de distancias están coloreados de acuerdo con la similitud estructural (naranja / rojo = similar azul / violeta = diferente). Las etiquetas de los ejes X e Y del mapa de calor representan compuestos.

El gráfico se obtuvo utilizando coordenadas baricéntricas de descriptores RDKit 2D que muestran compuestos activos (puntos azules) e inactivos (diamantes negros) de PAG. falciparum conjunto de datos y tóxico (estrellas rojas) y no tóxico (triángulos verdes) del conjunto de datos de citotoxicidad.

Aunque los conjuntos de datos son estructuralmente diversos, comparten las mismas regiones del espacio químico. Al analizar el espacio químico de ambos conjuntos de datos juntos, mediante la proyección de las coordenadas barcéntricas bidimensionales [43] (Fig. 3, consulte Materiales y métodos para obtener más detalles), se puede ver que la mayoría de los compuestos activos e inactivos de PAG. falciparum el conjunto de datos se superpone dentro de las mismas regiones del espacio químico de compuestos tóxicos y no tóxicos del conjunto de datos de citotoxicidad. Este análisis revela que múltiples compuestos activos contra PAG. falciparum en la etapa eritrocítica son potencialmente tóxicos en fibroblastos embrionarios de ratón. Por esta razón, desarrollamos modelos computacionales predictivos para ambas propiedades biológicas con el fin de seleccionar solo compuestos predichos como activos para PAG. falciparum y no tóxico para células de mamíferos.

Rendimiento de modelos QSAR binarios

Los modelos binarios QSAR fueron construidos para distinguir activos vs. compuestos inactivos para PAG. falciparum y tóxico vs. compuestos no tóxicos para células NIH / 3T3. De acuerdo con los resultados estadísticos de un procedimiento de validación cruzada externa de 5 veces (ver Materiales y métodos), la combinación de huellas dactilares de Morgan y FeatMorgan (radio 2: FeatMorgan_2, Morgan_2 radio 4: FeatMorgan_4, Morgan_4) con aprendizaje profundo (ver Materiales y Métodos para obtener detalles) condujeron a modelos QSAR binarios predictivos. Las características estadísticas de los modelos QSAR desarrollados estimados mediante validación cruzada externa de 5 veces se informan en la Tabla 1. Brevemente, los valores de la tasa de clasificación correcta (CCR) oscilaron entre 0,82 a 0,87 sensibilidad (SE) - 0,82 a 0,87 especificidad (SP) - 0,82 –0,87 y una cobertura– 0,77–0,87. La Tabla 1 muestra el desempeño detallado de los modelos binarios QSAR. El modelo construido con Morgan_2 demostró el mejor rendimiento entre todos los demás modelos desarrollados para PAG. falciparum (CCR = 0,84 SE = 0,82 SP = 0,86 y PPV = 0,86). Por otro lado, el mejor modelo desarrollado para la predicción de citotoxicidad para fibroblastos de mamíferos se construyó utilizando FeatMorgan_4 (CCR = 0,87 SE = 0,87 y SP = 0,87).

Rendimiento de modelos QSAR continuos

Hemos desarrollado modelos QSAR continuos con el objetivo de predecir unidades logarítmicas negativas de EC50 valores (pEC50) contra PAG. falciparum y CC50 valores (pCC50) contra la línea celular NIH / 3T3. De acuerdo con los resultados estadísticos de un procedimiento de validación cruzada externa de 5 veces, la combinación de huellas dactilares de Morgan y FeatMorgan (radio 2: FeatMorgan_2, Morgan_2) con aprendizaje profundo condujo a modelos estadísticamente predictivos (Tabla 2), con coeficiente de correlación al cuadrado predictivo para los valores del conjunto de pruebas () oscilan entre 0,70–0,88, el error cuadrático medio de la validación cruzada (RMSECV) de 0,44–0,55, el error absoluto medio (MAE) de 0,31–0,43 y la cobertura de 0,79–0,81. El modelo construido con Morgan_2 demostró el mejor rendimiento entre todos los demás modelos desarrollados para PAG. falciparum (= 0,88, RMSECV = 0,49 y MAE = 0,43). Por otro lado, el mejor modelo desarrollado para la predicción de la citotoxicidad para fibroblastos de mamíferos se construyó utilizando FeatMorgan_2 (= 0,74, RMSECV = 0,44 y MAE = 0,31).

Interpretación del modelo

Para proporcionar una interpretación mecanicista y arrojar algo de luz a partir de los datos estructurales y biológicos utilizados para construir los modelos QSAR continuos, trazamos la importancia de la característica predicha (huella dactilar) para visualizar cómo los fragmentos contribuyeron a la actividad antiplasmodial y la citotoxicidad (Fig.4 y S1 Higo). Según nuestros resultados, los átomos o fragmentos que promueven la contribución positiva para la actividad antiplasmodial se resaltan en rojo, mientras que los restos estructurales que disminuyen la actividad se resaltan en verde.

Compuestos probados experimentalmente en el ensayo de P. falciparum, extraídos de la literatura y utilizados para construir / validar nuestros modelos. Los fragmentos que aumentan la actividad se colorean en rojo; los restos estructurales que disminuyen la actividad se resaltan en verde; los fragmentos indiferentes no se resaltan. pEC50 exp = pEC50 pEC experimental50 pred = pEC50 predicho.

Analizando los mapas de contribución generados para el PAG. falciparum conjunto de datos, identificamos seis fragmentos principales con una contribución favorable para la actividad antiplasmodial. Ejemplos de fragmentos favorables son los siguientes: 1,2,4,5-tetraoxaspiro [5.5] undecano 7-cloroquinolina 2,5-dimetilhexa-1,5-dieno piridin-2-amina 1,4-dihidroquinolin-4-ona y 1,3,5-triazina-2,4,6-triamina. También identificamos seis fragmentos con una contribución desfavorable para la actividad antiplasmodial, tales como: 1,2-dimetil-1,4-dihidropiridin-4-ona 2-metilfurano 5-guanidina N-etilpropanamida 2,6-dimetilhepta-1,5-dieno y 4H-pirido [1,2-a] pirimidin-4-ona. Además, también calculamos la influencia prevista de los fragmentos estructurales sobre la citotoxicidad. Una lista resumida de átomos o fragmentos con contribución favorable y desfavorable para la citotoxicidad en fibroblastos de mamíferos está disponible en la Fig. S1. La información estructural y biológica proporcionada por los modelos QSAR desarrollados usando aprendizaje profundo podría ser útil para diseñar u optimizar compuestos antiplasmodiales potentes y selectivos por reemplazando fragmentos desfavorables por fragmentos favorables, asumiendo una verdadera independencia de los efectos fisicoquímicos.

Proyección virtual

El cribado virtual (VS) se llevó a cabo siguiendo el flujo de trabajo presentado en la Fig. 5. Inicialmente, se descargaron y estandarizaron 486,115 compuestos disponibles en la colección EXPRESS-Pick de ChemBridge para VS. Luego, se aplicaron filtros similares a fármacos (reglas de Veber [44] y Lipinski [45]) para priorizar moléculas con buena biodisponibilidad oral, para asegurar que el compuesto tenga propiedades básicas de fármacos activos. En paralelo, se utilizó la herramienta de agregación coloidal para filtrar las moléculas que se sabe que se agregan en los ensayos experimentales [46,47]. Después de estos pasos, se excluyeron 72,260 compuestos. Posteriormente, los compuestos restantes se sometieron a modelos QSAR binarios y continuos conservadores para la predicción de la actividad frente a estadios sanguíneos de PAG. falciparum y citotoxicidad contra células de mamíferos. La selección final de compuestos candidatos se puede resumir de la siguiente manera: (i) los compuestos predichos como activos y no citotóxicos por los modelos binarios QSAR (ii) compuestos con pEC50 ≥6.00 (I.mi., CE50 ≤1 μM para PAG. falciparum) y pCC50 & lt5.00 (I.mi., CC50 & gt10 μM para células de mamíferos) predicho por los modelos QSAR continuos (iii) y compuestos dentro del dominio de aplicabilidad (AD) de los modelos QSAR. Se implementó la combinación de modelos QSAR binarios y continuos para aumentar las tasas de éxito en la campaña de detección virtual. Además, la DA se determinó con el fin de establecer predicciones "fiables" y "no fiables" [48,49]. Las predicciones se consideraron fiables cuando estaban dentro del espacio químico utilizado para entrenar los modelos. Finalmente, realizamos un análisis de similitud química para seleccionar un subconjunto de compuestos estructuralmente diversos. Al final de este proceso, se seleccionaron cinco compuestos candidatos para evaluación biológica (Fig. 6).

Se utilizaron las reglas de Veber y Lipinski para priorizar compuestos candidatos con buena biodisponibilidad oral, para garantizar que el compuesto tenga propiedades básicas de fármacos activos. Se utilizó la herramienta de agregación coloidal para filtrar moléculas que se sabe que se agregan en ensayos experimentales. Se realizaron análisis de similitud química e inspección visual. realizado para seleccionar un subconjunto de compuestos candidatos estructuralmente diversos.

Los átomos o fragmentos que promueven una contribución positiva a la actividad antiplasmodial están resaltados en rojo.

Validación experimental

Se evaluaron los cinco compuestos candidatos in vitro contra las etapas de sangre asexual de PAG. falciparum cepas sensibles (3D7) y multirresistentes (W2). La CE50 para cada compuesto (Tabla 3) indican que dos compuestos, 2- (4,6-difenil-1,2-dihidro-1,3,5-triazin-2-il) fenol (LabMol-149), 4-ácido benzoico (LabMol-151) y N2- (3-fluorofenil) -N4 - [(oxolan-2-il) metil] quinazolina-2,4-diamina (LabMol-152), fueron potentes para inhibir el crecimiento del parásito, mostrando actividades en rango submicromolar y nanomolar bajo contra cepas 3D7 y W2. Además, el compuesto LabMol-152 (EC50 = 0.049 μM y 0.078 μM para 3D7 y W2, respectivamente) mostraron eficacia en el mismo rango de actividad de los medicamentos de referencia, cloroquina (EC50 = 0.011 μM) y pirimetamina (EC50 = 0,037 µM). Los compuestos candidatos también se evaluaron por su citotoxicidad frente a líneas celulares de tipo fibroblasto derivadas de riñón de mono (células COS-7). Con respecto a la selectividad, LabMol-149 y LabMol-152 mostraron los resultados más prometedores (índice de selectividad, SI, que oscila entre 71,4–340,8, Tabla 3).


Todos los modelos Aren & apost creados iguales

Por Ronald Hammond, PhD
Gerente de producto, fisiología y seguridad de laboratorio


Los modelos se encuentran entre los elementos más tradicionales y útiles en una caja de herramientas para educadores de ciencias. Ya sea que el tema de estudio sea la morfología de las hojas, la zoología de invertebrados, la biología general o la anatomía humana, los modelos son el complemento perfecto para textos y diagramas. Permiten a los estudiantes examinar, en perspectiva tridimensional, los detalles estructurales más finos de un organismo o sus componentes.

En muchos casos, los modelos se pueden desmontar de manera similar a realizar una disección. Como complemento de la disección, los modelos son una excelente herramienta de referencia para identificar estructuras pequeñas e indistintas. Con la cuidadosa planificación y ejecución de la escultura maestra (a partir de la cual se fabrica el molde), los modelos de alta calidad muestran el máximo número de estructuras anatómicas.

Modelos de anatomía humana

Ninguna disciplina de la ciencia se basa más en el uso de modelos que la anatomía y fisiología humanas. Los tejidos humanos preservados no están fácilmente disponibles con fines educativos y, cuando lo están, el estado de las muestras no suele ser satisfactorio para mostrar una morfología detallada. Muchas estructuras, como los componentes del oído medio e interno, son demasiado pequeñas para un estudio conveniente a partir de muestras naturales.

A thorough knowledge of the structure of cells and tissues is an absolute prerequisite for an understanding of the physiology, or function, of the various organ systems. An enlarged model is an indispensable teaching aid in such instances.

A complete human figure or torso model with head is actually a collection of models of individual organs, many of which can be separated and even opened for internal inspection. A human torso model of high quality is a valuable acquisition for any anatomy classroom. Generally, those with the largest number of removable components have the greatest teaching value.

Care of models

  1. Photocopy the identification key that accompanies each model and store the original key in a safe place.
  2. To avoid fading and deterioration of models, keep them in a reasonably cool area away from direct sunlight. Drape them with untreated cloth to prevent the accumulation of dirt and dust.
  3. Gently clean your models with a soft cloth and warm, soapy water to restore the surface without damaging the finish. Never use abrasives and solvents.
  • Molded from durable materials that guarantee long life and resistance to breakage
  • Painted with nontoxic, acrylic formulations bonded securely to the substrate to last the life of the model
  • Crafted carefully by a skilled artisan to assure that every minute detail is represented correctly
  • Mounted on attractive, reinforced display bases
  • Complete with identification keys
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Explanatory pluralism and integration

Above I have argued that, from a pragmatic point of view, psychopathological research should embrace research at multiple levels. In other words, if the aim is to make progress in treating and understanding mental disorder, explanatory pluralism is preferable to explanatory reductionism. Explanatory pluralism in psychopathology has been defended by many authors (e.g. Kendler, Reference Kendler 2005 Miller, Reference Miller 2010 Borsboom et al., Reference Borsboom, Cramer and Kalis 2019), and it is also inherent in the biopsychosocial model that has been influential in psychiatry at least since the 1970s and is still widely taught to students (Pilgrim, Reference Pilgrim 2002 Frisch, Reference Frisch 2016).

However, the basic idea that explanations need to be looked for at multiple levels is compatible with many different scenarios of how such multilevel research will actually play out (Marchionni, Reference Marchionni 2008 Sullivan, Reference Sullivan, Kincaid and Sullivan 2014, Reference Sullivan 2017 Gijsbers, Reference Gijsbers 2016 Love, Reference Love, Massimi, Romeijn and Schurz 2017). Most importantly, pluralism can lead to (1) a patchwork of explanations at different levels, or (2) integration of explanations at different levels. In the first scenario, the different perspectives or different levels that are needed for fully explaining psychopathology cannot be combined to one grand multilevel explanation, but are somehow incompatible or incongruent. In the second scenario, the different perspectives and different levels are compatible and complement each other in such a way that they can be combined to one grand harmonious multilevel explanation. These two scenarios should be seen as the extreme ends of a continuum, as the success of integration is not a yes-or-no thing but a matter of degree.

Most philosophers, researchers, and clinicians would probably agree that something like the integrative scenario is the more preferable and attractive alternative. Many authors have also explicitly advocated integrative pluralism for psychopathology (e.g. Kendler, Reference Kendler 2005 Mitchell, Reference Mitchell, Kendler and Parnas 2008 Miller, Reference Miller 2010). However, what has received less attention is how integration would work in practice, and what are the challenges and hurdles that hold back integration. In this section, I will focus on these questions, drawing from recent philosophy of biology where these issues have been more extensively discussed.

First of all, an important feature of integration that is often forgotten in theoretical discussions, also in psychopathology, is that it is case-specific. Philosophers and researchers often search for a general answer to the question of reduction and integration, arguing for example that mental disorders can be explained based on brain circuits, or that psychological explanations are always indispensable. In contrast, the degree to which multiple disciplines and levels are needed, and the degree to which the different perspectives can be integrated, can both vary from disorder to disorder (or even from symptom to symptom). The phenomenon that is studied or the problem that needs to be solved (the ‘problem agenda’, Love, Reference Love 2008) determines what fields and what levels are needed (Love, Reference Love 2008 Brigandt, Reference Brigandt 2010). For example, it is plausible that there will be satisfactory low-level biological explanations for disorders such as dementia, but that such explanations will be insufficient for depression or posttraumatic stress disorder (PTSD). Similarly, the integration of explanations or models of different levels might work out well and lead to new insights in one context, but face profound obstacles in another context (see below). In other words, accounts of pluralism and integration in psychopathology should not be overgeneralized, but should be case-specific and sensitive to the scientific details of each case.

Another crucial point is that integration should be seen as an active and dynamic process, and not just as the final goal or end result of pursuing research at different levels. As O'Malley and Soyer ( Reference O'Malley and Soyer 2012) show in the context of systems biology, integration has often led to new insights, or even to the emergence of new and flourishing research fields. They also emphasize that integration does not occur just by combining explanations or theories of different levels, but often involves importing and translating data and models of one discipline to another. For example, in the recently emerged field of evolutionary systems biology, insights and data from evolutionary biology are imported into the cellular and molecular models of systems biology (O'Malley and Soyer, Reference O'Malley and Soyer 2012). One recent example of this in psychopathology is the Ising model. This model represents a network of binary variables that interact with their neighbors, and was originally introduced in the 1920s to model the behavior of magnetic particles. However, it turns out that the same model can also be used to describe neural networks (Yuste, Reference Yuste 2015), and more recently, the Ising model has been shown to be mathematically equivalent to Item Response Theory models and binary symptom network models in psychology (Van Borkulo et al., Reference Van Borkulo, Borsboom, Epskamp, Blanken, Boschloo, Schoevers and Waldorp 2014 Kruis and Maris, Reference Kruis and Maris 2016 Marsman et al., Reference Marsman, Borsboom, Kruis, Epskamp, van Bork, Waldorp, Maas and Maris 2018). The fact that integrative multilevel research has been so fruitful in other fields should provide a strong incentive for pursuing such research in psychopathology as well.

However, although it is clear that there is much to be gained from integrating methods, data, and perspectives of different levels, there are several obstacles to such integration in psychopathology. First of all, in the biological sciences integration often occurs through the elaboration of multilevel mechanisms through constraints (Bechtel and Richardson, Reference Bechtel and Richardson 1993 Craver and Darden, Reference Craver and Darden 2013). The idea is that different fields impose different constraints on what the explanatory mechanism for a phenomenon could be, and in this way the space of possible mechanisms is narrowed down. Often researchers start with a sketch of a mechanism, and as more evidence is gathered, this sketch can be refined and black boxes are filled in. This can involve many different disciplines and perspectives. For example, the discovery and refinement of the model of protein synthesis in the 1950 and 1960s involved integrating knowledge from biochemistry (e.g. chemical reactions involving amino acids) and molecular biology, resulting in constraints on how the mechanism of protein synthesis could look like. Eventually these constraints and inputs from multiple fields resulted in the DNA–RNA theory of protein synthesis.

One obstacle to this kind of integration is the incommensurability of levels discussed in section 2. The part-whole hierarchies in psychology are different from the (mechanistic) part-whole hierarchies in biology, and it is not clear how the two can be integrated. Thus, the mechanistic picture needs to be complemented with an account of how psychological states can be integrated into mechanistic explanations. So far, this has been only done in the context of computational or functional states in psychology (e.g. Piccinini and Craver, Reference Piccinini and Craver 2011 Thomas and Sharp, Reference Thomas and Sharp 2019), but it is not clear how this kind of integration would work for phenomena such as affect states, beliefs, and symptoms. Such integration is also challenged by the fact that psychological processes often unfold and interact at different time scales than biological processes (section 2). Integrating models and explanations that pertain to different time scales are not impossible, but currently there is little understanding on how it should be done.

A more general problem for integration in psychopathology is descriptive complexity: different conceptual frameworks often do not carve phenomena in the same way, but result in mismatching and conflicting categorizations (Wimsatt, Reference Wimsatt, Schaffner and Cohen 1972 Sullivan, Reference Sullivan, Kincaid and Sullivan 2014, Reference Sullivan 2017 Tabb and Schaffner, Reference Tabb, Schaffner, Kendler and Parnas 2017). This can be vividly seen in schizophrenia research. As Sullivan ( Reference Sullivan, Kincaid and Sullivan 2014) points out, the cognitive deficits that are important to schizophrenia are studied both in cognitive neuroscience and in cognitive neurobiology, but from different perspectives. In cognitive neuroscience, the aim is to probe specific cognitive functions and to localize them in the brain with neuroimaging techniques. In cognitive neurobiology, the cognitive deficits underlying schizophrenia are studied through animal models (e.g. rats). In such experiments, the aim is to discover differences in the behavior of rats, which are taken to indicate a cognitive deficit, but no mapping to specific human cognitive functions is made. Thus, even though the same phenomenon is nominally being targeted, it is conceptualized in different ways. More generally, Tabb and Schaffner ( Reference Tabb, Schaffner, Kendler and Parnas 2017) point out that different state-of-the-art models of schizophrenia that focus on different levels do not even agree on what are the defining features or key symptoms of schizophrenia.

Issues like this abound in psychopathology. For example, fear extinction is studied in neurobiology with rodents based on freezing behavior after a foot shock. In humans, fear extinction is measured with more complex stimuli, and typically with skin conductance responses as the dependent variable (Lonsdorf et al., Reference Lonsdorf, Menz, Andreatta, Fullana, Golkar, Haaker and Drexler 2017). Recently doubts have been raised regarding this translation, as it is far from clear that the setups are measuring the same phenomena (Lonsdorf et al., Reference Lonsdorf, Merz and Fullana 2019 see also Glas, Reference Glas 2004 Khalidi, Reference Khalidi 2005). In psychopathology, descriptive complexity seems to be the rule rather than the exception.

However, this does not mean that there is no hope for integration. In biology, there are many success stories of integrating fields that seem to conceptualize phenomena in different ways (e.g. in the context of systems biology mentioned above O'Malley and Soyer, Reference O'Malley and Soyer 2012). Also in psychopathology, concentrated interdisciplinary efforts, involving both scientists from different fields and philosophers of science, can help to aligning concepts and models of different fields in the context of a specific problem or phenomenon (see also Love, Reference Love 2008 Sullivan, Reference Sullivan 2017 Laplane et al., Reference Laplane, Mantovani, Adolphs, Chang, Mantovani, McFall-Ngai and Pradeu 2019).


Fondos

The authors would like to thank Brazilian funding agencies, CNPq, FAPEG, FAPESP, and CAPES for financial support and fellowships. FC, GC, and CA were supported by FAPESP (Grants #2012/16525-2, #2015/20774-6, and #2017/02353-9, respectively). DB was supported by FAPESP (Grant #2013/13119-6) and CNPq (Grant #405996/2016-0). JC was supported by FAPESP fellowship (#2016/16649-4). EM appreciates support from NIH (Grant 1U01CA207160 and GM5105946) and CNPq (Grant #400760/2014-2). CA, PC, and FC are CNPq research fellows. PC was partially supported by the Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior Particular – Funadesp, via UniEvangélica – Centro Universitário de Anápolis.


Métodos

We recently sequenced five additional SAR11 genomes from three phylogenetically distinct clades, corresponding to the subgroups Ia, III and a new, distantly related subgroup (Group V) 46 (Figs. 6 & 7), which were annotated consistently with others used in this study by IMG 47 (http://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/m/main.cgi). We made exclusive use of publicly available bacterial genome sequences from the IMG database to control for gene-calling methodological differences across databases. The 127 taxa used in the whole alphaproteobacterial dataset (Table S1) were a subset of the total available sequences chosen to represent all sequenced genera. Given that some species are highly overrepresented in the database, we omitted several taxa from these overrepresented groups. Datasets with mitochondrial sequences included most available genome sequences from the respective Alphaproteobacteria orders (Table S2). Mitochondrial sequences (Table S3) were obtained from NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The sequences were analyzed using Hal, an automated pipeline for phylogenetic analysis of genomic protein sequence data.

The Hal pipeline 23,48 (http://aftol.org/pages/Halweb3.htm http://sourceforge.net/projects/bio-hal/) consists of a set of Perl scripts that automates a series of phylogenomic analyses using existing software and sequence analysis programs and was executed on a 64-bit Linux cluster operating Red Hat Linux 3.2.3, Linux version 2.4.21. For this study, the Hal pipeline directed the following analyses: Protein sequences were imported in fasta format from sequenced genomes listed in Table S1–3 and subjected to an all-vs-all BLASTP with the output E-values provided to the program MCL 49 . Using a Markov Clustering algorithm, MCL grouped proteins into orthologous clusters (OCs) as function of the all-vs-all BLASTP E-values. Clustering was executed across a range of stringencies (inflation parameters 1.1 – 5.0) and OCs were filtered for any redundant clusters (clusters found at more than one inflation parameter), clusters containing more than one protein per genome (multi-copy OC) and clusters containing proteins whose best reciprocal BLAST hit was outside of the cluster (clusters more likely to contain paralogs). Clusters were also filtered across a range of missing values settings (10–60%) whereby a cluster may contain only one protein per genome but a defined percentage of the genomes may be missing from the cluster. This function allows for the incorporation for more single-copy clusters when such proteins are either missing from a given genome or missing from a genome annotation.

Protein sequences for accepted OCs were extracted from their respective genome fasta sequence files and aligned using MUSCLE 50 with default settings. To accommodate for problematic regions of the alignments, three separate alignments were created for each protein alignment: one removing all gap-containing columns (remgaps) and two removing problematic regions of the alignments based on the default conservative (Glocks-con) and liberal (Gblocks-lib) options of the program GBlocks 51 . Best models of amino acid substitution for each protein alignment were estimated using ProtTest 52 . Individual protein alignments were concatenated into one super-alignment and analyzed using RAxML 53 with the PROTCAT setting for the rate model and with each protein partition of the super-alignment assigned its best model of amino acid substitution. Nodal support was estimated based on 100 bootstrap replications using the rapid bootstrapping option as implemented in RAxML. For each analysis, three phylogenetic trees were generated, representing the three super-alignments (remgaps, GBlocks-con and GBlocks-lib) produced as part of the automated alignment routine.


Ver el vídeo: Molecular Biology of Inside Erythrocytes (Agosto 2022).