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10.3: Detalles de la transcripción - Biología

10.3: Detalles de la transcripción - Biología



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Encuentre un resumen bien escrito de la transcripción en procariotas y eucariotas en un sitio web de los NIH (Transcripción en procariotas y eucariotas). Aquí (y en este enlace), encontrará proteínas que se unen al ADN. Algunas proteínas se unen al ADN para regular la transcripción, induciendo o silenciando la transcripción de un gen. Otras proteínas interactúan con el ADN simplemente para permitir la transcripción. Estos incluyen uno o más que, junto con la propia ARN polimerasa, deben unirse al promotor del gen para iniciar la transcripción. Primero veremos la transcripción bacteriana.

A. Transcripción en procariotas

En E. coli, una sola ARN polimerasa transcribe todo tipo de ARN, asociándose con una de varias proteínas del factor sigma ( ( sigma ) -factores) para iniciar la transcripción. Resulta que diferentes secuencias promotoras y los correspondientes factores ( sigma ) juegan un papel en la transcripción de diferentes genes (ilustrado a continuación).

En ausencia del factor ( sigma ), el E. coli La ARN polimerasa puede transcribir ARN, pero lo hace a un ritmo elevado y a partir de secuencias aleatorias del cromosoma. Por el contrario, cuando el factor ( sigma ) - se une a la ARN polimerasa, el complejo parece escanear el ADN, reconocer y luego unirse a la secuencia promotora de un gen. En este caso, la tasa de transcripción general es más lenta, pero solo se transcriben genes, en lugar de fragmentos aleatorios del genoma bacteriano. los Caja Pribnow, llamado así por su descubridor, fue la primera secuencia promotora caracterizada.

El alargamiento es la adición sucesiva de nucleótidos complementarios a sus plantillas de ADN, formando enlaces fosfodiéster. Las reacciones enzimáticas de alargamiento son similares al alargamiento catalizado por la ADN polimerasa durante la replicación.

Hay dos formas en que la ARN polimerasa bacteriana "sabe" cuándo ha alcanzado el final de una unidad de transcripción. En un caso, cuando la ARN polimerasa se acerca al extremo 3 'de la transcripción naciente, transcribe una región rica en C de 72 bases. En este punto, un factor de terminación llamó al rho la proteína se une a la cadena de ARN naciente. Rho es una helicasa dependiente de ATP que rompe los enlaces H entre el ARN y la hebra de ADN molde, evitando así una mayor transcripción.

Dependiente de Rho la terminación se ilustra a continuación.

En el otro mecanismo de terminación, la polimerasa transcribe ARN cuyo señal de terminación asume una secundaria lazo de horquilla estructura que provoca la disociación de la ARN polimerasa, el ADN molde y la nueva transcripción de ARN. El papel del bucle de horquilla en terminación independiente de rho se ilustra a continuación.

B. Transcripción en eucariotas

Mientras que las bacterias dependen de una única ARN polimerasa para sus necesidades de transcripción, los eucariotas utilizan tres ARN polimerasas diferentes para sintetizar los tres tipos principales de ARN, como se muestra a continuación.

Tenga en cuenta que la catálisis de la síntesis de la mayor parte del ARN en una célula eucariota (ARNr) es por la ARN polimerasa I. Con la ayuda de proteínas de iniciación, cada ARN polimerasa inicia la transcripción en una secuencia promotora. Una vez iniciadas, las ARN polimerasas catalizan la formación sucesiva de enlaces fosfodiéster para alargar la transcripción. Recuerde que los ARNm son los menos abundantes en eucariotas como en las células bacterianas.

Desafortunadamente, los detalles de la terminación de la transcripción en eucariotas no se comprenden tan bien como en las bacterias. Por lo tanto, nos centraremos en la iniciación y luego consideraremos el procesamiento de diferentes ARN eucariotas en moléculas listas para usar.

1. Transcripción de ARNm eucariota

Los múltiples pasos de la transcripción del ARNm eucariota se muestran en la página siguiente.

Transcripción de ARNm eucariotas por ARN polimerasa II comienza con el ensamblaje secuencial de un eucariota complejo de iniciación en un promotor de genes. El promotor eucariota típico de un gen que codifica una proteína contiene un ADN de caja TATA motivo de secuencia así como secuencias cortas adicionales en sentido ascendente. Unión TATA proteína (TBP) primero se une a la caja TATA junto con TFIID (factor de inicio de la transcripción IID).

Este intermedio recluta TFIIA y TFIIB. Próximo, TFGIIE, TFIIF y TFIIH, varios otros factores de iniciación y la ARN polimerasa II se unen para formar la transcripción complejo de iniciación. La fosforilación agrega varios fosfatos al aminoterminus de la ARN polimerasa, después de lo cual algunos de los TF se disocian del complejo de iniciación. El complejo de ARN polimerasa-TF restante ahora puede comenzar a producir el ARNm.

A diferencia de la ARN polimerasa procariota, la ARN polimerasa II eucariota no tiene una actividad helicasa inherente. Para ello, la transcripción de genes eucariotas se basa en la proteína TFIIH de múltiples subunidades, en la que dos subunidades tienen actividad helicasa. De acuerdo con la relación más cercana de arqueas Para los eucariotas (más bien para los procariotas), el inicio de la transcripción del ARNm de arqueas se asemeja al de los eucariotas, aunque requiere menos factores de iniciación durante la formación de un complejo de iniciación.

Una diferencia significativa entre la transcripción procariota y eucariota es que la ARN polimerasa y otras proteínas involucradas en un promotor genético no ven ADN desnudo. En cambio, deben reconocer secuencias de ADN específicas a través de proteínas de cromatina. Por otro lado, todas las proteínas que interactúan con el ADN tienen en común la necesidad de reconocer las secuencias de ADN a las que deben unirse…, dentro de la doble hélice. En otras palabras, deben ver las bases dentro de la hélice y no en la superficie de la cadena principal de fosfato uniformemente electronegativo. Para ello, deben penetrar el ADN, generalmente a través del surco mayor de la doble hélice. ¡Veremos que las proteínas reguladoras del ADN enfrentan los mismos problemas para lograr interacciones específicas basadas en formas!

2. Transcripción eucariota de tRNA y 5SRNA

Transcripción de 5S rRNA y tRNAs por ARN polimerasa III es inusual porque la secuencia promotora a la que se une (con la ayuda de factores de iniciación) no está aguas arriba de la secuencia transcrita, sino que se encuentra dentro de la secuencia transcrita. Después de unirse a este promotor interno, la polimerasa se reposiciona para transcribir el ARN del sitio de inicio de la transcripción, de modo que la transcripción final contenga así la secuencia del promotor.

5S rRNA por RNA polimerasa III se muestra a continuación.

3. Transcripción de otros rRNA eucariotas

Los ARNt también son transcritos por la ARN polimerasa III de la misma manera que el ARNr 5S. Los otros ARNr son transcritos por la ARN polimerasa I, que se une a un promotor corriente arriba junto con factores de iniciación de la transcripción. Sabemos menos de los detalles de este proceso en comparación con nuestra comprensión de la transcripción del ARNm. Exploraremos lo que sabemos a continuación. Como ya se señaló, la terminación de la transcripción no se comprende tan bien en eucariotas como en procariotas. Los pasos de terminación acoplada y poliadenilación comunes a la mayoría de los ARNm procarióticos se analizan con más detalle a continuación, con un resumen útil en el sitio web del NIH-NCBI aquí.


10.3: Detalles de la transcripción - Biología

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Fondo

El mecanismo de detección de la temperatura ambiente en las plantas no está claro. Se cree que el control de los niveles de transcripción es importante en las respuestas a la temperatura [1-4], pero no se han medido los efectos de la temperatura ambiente sobre la transcripción y las tasas de desintegración del ARNm. Según el trabajo de Arrhenius [5] el coeficiente de temperatura (Q10) de reacciones bioquímicas se espera que sea de 2 a 3 a temperaturas biológicas: sin embargo, menos del 2% de Arabidopsis thaliana los genes tienen una diferencia de dos o más veces en el nivel de expresión entre 17 ° C y 27 ° C [6]. Los genes restantes tienen tasas amortiguadas contra los cambios de temperatura, o los aumentos pasivos en la tasa de transcripción deben compensarse con un aumento equilibrado en la tasa de desintegración, lo que lleva a una mayor rotación pero niveles de estado estacionario estáticos. A pesar de esta incertidumbre fundamental, las respuestas transcriptómicas en estado estacionario a la temperatura ambiente se han utilizado para inferir un papel de las modificaciones de la cromatina en la señalización de la temperatura [2, 7].

El 4-tiouracilo (4SU) es un análogo de base no tóxico que se ha demostrado que se incorpora en el ARNm de mamíferos y levaduras durante la transcripción [8-12]. La biotinilación y la separación en columna permiten separar el ARN marcado con 4SU del ARN no etiquetado, y el análisis transcriptómico utilizando las muestras separadas se puede utilizar para calcular simultáneamente la síntesis de ARNm y las tasas de desintegración [8]. Aquí utilizamos el etiquetado 4SU para medir las tasas de transcripción y determinar la Q10 genoma de síntesis de ARNm y tasas de desintegración en Arabidopsis thaliana. Mostramos que la temperatura ambiente tiene grandes efectos pasivos tanto en la síntesis de ARNm como en las tasas de desintegración, y que cuando la temperatura controla la abundancia de transcripciones, lo hace regulando la transcripción en relación con la desintegración y no viceversa. Nuestro análisis sugiere que los sitios de unión del factor de transcripción y el estado epigenético se combinan para crear una red compleja de respuestas de temperatura en las plantas.


PARP y ADP-ribosilación: avances recientes que vinculan las funciones moleculares con los resultados biológicos

El descubrimiento de poli (ADP-ribosa) & gt hace 50 años abrió un nuevo campo, liderando el camino para el descubrimiento de la familia de enzimas poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y las reacciones de ADP-ribosilación que catalizan. Aunque el campo se centró inicialmente principalmente en la bioquímica y biología molecular de PARP-1 en la detección y reparación de daños en el ADN, la comprensión mecanicista y funcional del papel de las PARP en diferentes procesos biológicos ha crecido considerablemente últimamente. Esto ha ido acompañado de un cambio de enfoque de la enzimología a la búsqueda de sustratos, así como los primeros intentos de determinar las consecuencias funcionales de la ribosilación de ADP específica del sitio en esos sustratos. Estos avances respaldan una serie de enfoques metodológicos de la biología química, la proteómica, la genómica, la biología celular y la genética que han impulsado nuevos descubrimientos en el campo. Los nuevos hallazgos sobre las diversas funciones de las PARP en la regulación de la cromatina, la transcripción, la biología del ARN y la reparación del ADN se han complementado con avances recientes que vinculan la ribosilación de ADP con las respuestas al estrés, el metabolismo, las infecciones virales y el cáncer. Estos estudios han comenzado a revelar las formas prometedoras en las que los PARP pueden dirigirse terapéuticamente para el tratamiento de enfermedades. En esta revisión, discutimos estos temas y los relacionamos con las direcciones futuras del campo.

Palabras clave: Reparación de ADN ARN biología regulación génica mono (ADP-ribosa) (MAR) poli (ADP-ribosa) (PAR) poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP).

© 2017 Gupte et al. Publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Cifras

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Una variedad de efectores median la dinámica de ribosilación de ADP intracelular. Los PARP actúan como "escritores" que ...

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Las monoenzimas de PARP y las PARP catalíticamente inactivas participan en diversos procesos biológicos. ( A…

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Nuevas tecnologías para detectar y estudiar la ADP-ribosilación celular. El esquema ilustra diferentes tecnologías ...

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Enfoques de biología química para identificar eventos de ribosilación de ADP específicos de PARP. ( A ) Estructuras moleculares ...

Comparación de técnicas utilizadas para ...

Comparación de técnicas utilizadas para mapear la ribosilación de ADP en todo el genoma. ( A ) ADPr-ChAP de…


Figura 10.3. Una ilustración generalizada de cómo se utilizan el ARNm y el ARNt en la síntesis de proteínas dentro de una célula.

Como se describe en el Capítulo 7, algunas moléculas de ARN tienen propiedades enzimáticas y sirven como ribozimas. En este capítulo, la actividad de los snRNA durante el proceso de eliminación de intrones de las secuencias de mRNA funcionan como ribozimas y se describirá. Además, en el Capítulo 11 se proporcionará una descripción detallada de las características enzimáticas de la estructura del ribosoma.

Otras moléculas pequeñas de ncRNA y lncRNA juegan un papel en la regulación de los procesos de transcripción y traducción. Por ejemplo, los niveles de expresión postranscripcional de muchos genes se pueden controlar mediante la interferencia de ARN, en la que los miARN, moléculas de ARN cortas específicas, se emparejan con regiones de ARNm y las dirigen para su degradación (Figura 10.4). Este proceso es ayudado por chaperonas proteicas llamadas argonautes. Este proceso basado en antisentido implica pasos que primero procesan el miRNA para que pueda emparejarse con una región de sus mRNA objetivo. Una vez que se produce el emparejamiento de bases, otras proteínas dirigen el ARNm para que sea destruido por las nucleasas. Fire y Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2006 por este descubrimiento.

Figura 10.4 Papel del microARN (miARN) en la inhibición de la traducción del ARNm eucariótico. (1) Una proteína llamada Exportin-5 transporta un micro ARN primario en horquilla (pri-miARN) fuera del núcleo y dentro del citoplasma. (2) Una enzima llamada Dicer (no se muestra), recorta el pri-miRNA y elimina el bucle de horquilla. Un grupo de proteínas, conocido como Argonautes, forma un complejo miARN / proteína. (3) enlaces de hidrógeno del complejo miARN / proteína con ARNm basados ​​en la homología de secuencia complementaria y bloquea la traducción. (4) La unión del complejo miARN / proteína acelera la descomposición de la cola poliA del ARNm, lo que hace que el ARNm se degrade antes.

En estado estacionario, la gran mayoría del ARN celular humano consiste en ARNr (∼90% del ARN total para la mayoría de las células, Figura 10.5). Aunque hay menos tRNA en masa, su pequeño tamaño hace que su nivel molar sea más alto que el rRNA (Figura 10.5). Otros RNA abundantes, como mRNA, snRNA y snoRNA, están presentes en conjunto a niveles que son aproximadamente 1-2 órdenes de magnitud más bajos que el rRNA y el tRNA (figura 10.5). Ciertos ARN pequeños, como miARN y piARN, pueden estar presentes en niveles muy altos; sin embargo, esto parece depender del tipo de célula. Los lncRNA están presentes en niveles que son dos órdenes de magnitud menores que el mRNA total. Aunque el número estimado de diferentes tipos de lncRNA humanos puede tener un patrón de expresión muy restringido y, por tanto, acumularse a niveles más altos dentro de tipos celulares específicos. Por ejemplo, la secuenciación de transcriptomas de mamíferos ha revelado que se pueden producir más de 100.000 moléculas de lncRNA diferentes, en comparación con los aproximadamente 20.000 genes que codifican proteínas. La diversidad y funciones del transcriptoma dentro de los procesos biológicos son actualmente un área de investigación muy activa.

Figura 10.5: Estimación de los niveles de ARN en una célula de mamífero típica. Proporción de las diversas clases de ARN en células somáticas de mamíferos por masa total (A) y por número absoluto de moléculas (B). El número total de moléculas de ARN se estima en aproximadamente 107 por célula. Otros ncRNA en (A) incluyen snRNA, snoRNA y miRNA. Tenga en cuenta que, debido a sus tamaños relativamente grandes, el ARNr, el ARNm y el ARNrnc constituyen una mayor proporción de la masa en comparación con el número total de moléculas.

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10.2 Enzimas de ARN polimerasa

Las enzimas de ARN polimerasa (RNAP) son necesarias para llevar a cabo el proceso de transcripción y se encuentran en todas las células, desde las bacterias hasta los humanos. Todos los RNAP son conjuntos de múltiples subunidades, con bacterias que tienen cinco subunidades centrales que tienen homólogos en los RNAP de arqueas y eucariotas. Los RNAP bacterianos son la forma más simple de ARN polimerasas y proporcionan un excelente sistema para estudiar cómo controlan la transcripción.

Enzimas procarióticas de ARN polimerasa

El núcleo catalítico de RNAP dentro de las bacterias contiene cinco subunidades principales (α2ββ & # 8217ω) (figura 10.7B). Para colocar este núcleo catalítico en el promotor correcto se requiere la asociación de una sexta subunidad llamada factor sigma (σ). Dentro de las bacterias existen múltiples factores sigma diferentes que pueden asociarse con el núcleo catalítico de RNAP que ayudan a dirigir el núcleo catalítico a las ubicaciones correctas de ADN donde RNAP puede iniciar la transcripción. Por ejemplo, dentro de E. coli σ 70 es el factor sigma de mantenimiento que es responsable de la transcripción de la mayoría de los genes en las células en crecimiento. Mantiene en funcionamiento genes y vías esenciales. Otros factores sigma se activan durante ciertas situaciones ambientales, como σ 38 que se activa durante la inanición o cuando las células alcanzan la fase estacionaria. Cuando la subunidad sigma se asocia con el núcleo catalítico de RNAP, el RNAP ha formado la holoenzima. Cuando se une al ADN, la conformación holoenzimática de RNAP puede iniciar la transcripción.

La transcripción tiene lugar en varias etapas. Para empezar, la holoenzima de la ARN polimerasa localiza y se une al ADN promotor. En esta etapa, la holoenzima RNAP es la conformación cerrada (RPC) (Figura 10.6). La unión específica inicial al promotor por factores sigma de la holoenzima, pone en movimiento cambios conformacionales en los que la máquina molecular RNAP dobla y envuelve el ADN con regiones móviles de RNAP que juegan un papel clave (Figura 10.6). A continuación, RNAP separa las dos hebras de ADN y expone una parte de la hebra molde.En este punto, se dice que el ADN y la holoenzima están en un "complejo promotor abierto" (RPo), y la sección de ADN promotor que se encuentra dentro de ella se conoce como "burbuja de transcripción" (Figura 10.6).

Figura 10.6. Representación esquemática de E. coli Iniciación transcripcional. Complejos cerrados como RPC, I1, E (temprano), o yo1, L (tarde) pueden ser miembros significativos de la I que se equilibra rápidamente1 conjunto. RPo significa el final de la etapa de iniciación y la entrada en la fase de elongación de la síntesis de ARN. Los dominios α se muestran en azul claro. Los dominios σ se indican con los números 1.1, 1.2, 2, 3 y 4.

En los sistemas bacterianos, el factor sigma localiza el sitio de inicio de la transcripción utilizando elementos clave de la secuencia de ADN ubicados en -35 nucleótidos y -10 nucleótidos del sitio de inicio de la transcripción (Fig 10.7A) Para RNAP de Thermus aquaticus, el elemento −35 interactúa exclusivamente con σ A 4 . El ADN dúplex justo aguas arriba del elemento −10 (−17 a −13) interactúa con β ′, σ A 3 y σ A 2 (Figura 10.7B). Volteo de la A−11(nt) base del ADN dúplex en su bolsillo de reconocimiento en σ A 2 se cree que es el evento clave en el inicio de la fusión del promotor y la formación de la burbuja de transcripción (Figura 107.C). Una vez que se ha formado la burbuja de transcripción y se inicia la transcripción, las subunidades sigma se disocian del complejo y la subunidad catalítica RNAP continúa alargándose por sí sola.

Figura 10.7 Estructura de la holoenzima RNAP en Thermus aquaticus.(A) Oligonucleótidos utilizados para la cristalización de la holoenzima RNAP en la conformación abierta. Los números anteriores indican la posición del ADN con respecto al sitio de inicio de la transcripción (+1). Los elementos −35 y −10 (cuadro de Pribnow) están sombreados en amarillo, los elementos extendidos −10 y discriminador en violeta. El ADN sin hebra de plantilla (hebra superior) es de color gris oscuro de ADN de hebra de plantilla (hebra inferior), transcripción de ARN de color gris claro, rojo. (B) Estructura general de la holoenzima RNAP en la conformación abierta unida con los nucleótidos del ADN. Los ácidos nucleicos se muestran como esferas de CPK y codificados por colores como en el diagrama A. Dentro de RNAP, αI, αII, ω, se muestran en gris β en cian claro β ′ en rosa claro Δ1.1σ A en naranja claro. los Taq EΔ1.1σ A se muestra como una superficie molecular y la parte delantera de la holoenzima RNAP es transparente para revelar el sitio activo Mg 2+ (esfera amarilla) del RNAP y los ácidos nucleicos contenidos dentro del canal del sitio activo RNAP. (C) Densidad de electrones y modelo para ácidos nucleicos de holoeznzimas RNAP en la conformación abierta. La codificación de colores coincide con el diagrama A.

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Enzimas eucariotas de ARN polimerasa

En las células eucariotas, tres RNAP comparten la tarea de transcripción, el primer paso en la expresión génica. La ARN polimerasa I (Pol I) es responsable de la síntesis de la mayoría de las transcripciones de ARNr, mientras que la ARN polimerasa III (Pol III) produce ARN estructurados cortos, como ARNt y ARNr 5S. La ARN polimerasa II (Pol II) produce todos los ARNm y la mayoría de los ARN reguladores y no traducidos.

Las tres ARN polimerasas eucariotas contienen homólogos de las cinco subunidades centrales que se encuentran en las RNAP procariotas. Además, las eucariotas Pol I, Pol II y Pol III tienen cinco subunidades adicionales que forman un núcleo catalítico que contiene 10 subunidades (figura 10.8). El núcleo tiene una característica forma de garra de cangrejo que encierra una hendidura central que alberga el ADN y tiene dos canales, uno para los NTP del sustrato y el otro para el producto de ARN. Dos "pinzas", llamadas "pinza" y "mandíbula" estabilizan el ADN en el extremo corriente abajo y permiten la apertura y el cierre de la hendidura. Para que se produzca la transcripción, la enzima debe mantener una burbuja de transcripción con cadenas de ADN separadas, facilitar la adición de nucleótidos, translocar a lo largo de la plantilla, estabilizar el híbrido ADN: ARN y finalmente permitir que las cadenas de ADN se vuelvan a recocer. Esto se logra mediante una serie de elementos conservados en el sitio activo, que incluyen los bucles de horquilla, el timón, la pared, el bucle de disparo y la hélice del puente.

Figura 10.8 Diagrama estructural de la ARN polimerasa de Thermus thermophilus (PDB205j). El ADN (negro) se está derritiendo en una burbuja de transcripción que permite el emparejamiento de la cadena de plantilla con el ARN (rojo) en un híbrido de ARN-ADN de 9-10 pares de bases. La hélice del puente (cian) y el bucle de activación / hélices (amarillo / naranja) se encuentran en el lado aguas abajo del sitio activo. La presunta ruta de entrada de NTP está indicada por la flecha recta. La interconversión del bucle de disparo y las hélices de disparo se indica mediante la flecha curva. Las subunidades de ARN polimerasa se muestran como superficies semitransparentes con las identidades de subunidades ortólogas en bacterias (α, β y β & # 8217, gris, azul y rosa, respectivamente), arqueas (D, L, B y A) y RNA polimerasa II eucariota (RPB3, 11, RPB2, RPB1) indicada. Los iones de Mg 2+ del sitio activo se muestran como esferas amarillas y α, β-metilen-ATP en verde y rojo.

Aparte de los elementos centrales, todos los RNAP eucariotas comparten dos subunidades adicionales, más distantes que forman el tallo. En Pol I y Pol III, el núcleo está además decorado con subunidades periféricas agrupadas como subcomplejos heterodiméricos (Pol I y Pol III) y heterotriméricos (Pol III). Por consiguiente, las holoenzimas Pol I y Pol III contienen 14 y 17 subunidades, respectivamente, en comparación con la enzima Pol II de 12 subunidades (figura 10.9). Se ha sugerido que las subunidades periféricas de Pol I y Pol III son homólogas a los factores de transcripción generales de Pol II basándose en la similitud de secuencia y la ubicación de estas subunidades en el núcleo de RNAP. Los heterodímeros Pol I y Pol III son homólogos a TFIIF y, del mismo modo, el heterotrímero Pol III a TFIIE conduce a la idea de que durante la evolución, Pol I y Pol III integraron de manera estable estas subunidades similares al factor de transcripción en la enzima central. Pol II, por otro lado, se asocia de manera más transitoria con factores de transcripción generales que forman una complejo de preiniciación (FOTO) y se muestra en la Figura 10.9.

Figura 10.9 Comparación de las estructuras de Pol I, Pol II y Pol III que demuestran posiciones similares de subunidades específicas de Pol I y Pol III en comparación con TFIIF y TFIIE en Pol II-PIC. Todas las estructuras se superpusieron en la subunidad más grande y se representaron en la misma orientación. Las subunidades correspondientes se muestran en el mismo color. Los componentes Pol II-PIC sin contrapartes en las estructuras Pol I y Pol III están representados en gris. ID de PDB 4c3j, 5c4x, 5fj8 y 5fyw.

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10.3 Factores de transcripción y el complejo de preiniciación (PIC)

A diferencia de los sistemas procariotas que pueden iniciar el reclutamiento de holoenzimas RNAP directamente en las regiones promotoras de ADN y mediar la conversión de RNAP a la conformación abierta, las ARN polimerasas eucariotas requieren una gran cantidad de factores de transcripción general (GTF) adicionales para permitir este proceso. Aquí nos centraremos en la activación de la ARN polimerasa II como un ejemplo de la complejidad del inicio de la transcripción eucariota.

La transcripción de genes de clase II en eucariotas es un proceso esencial estrictamente regulado controlado por una maquinaria multicomponente altamente compleja. Una plétora de proteínas, más de un centenar en humanos, se organizan en conjuntos multiproteicos a menudo muy grandes que incluyen un núcleo de factores de transcripción general (GTF). Los GTF incluyen los factores TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH, ARN polimerasa (ARN pol II), así como un gran número de complejos diversos que actúan como coactivadores, correpresores, modificadores de cromatina y remodeladores ( Figura 10.10). La transcripción de genes de clase II está regulada a varios niveles: mientras se ensambla en cromatina, antes y durante el inicio de la transcripción, a lo largo de la elongación y el procesamiento del ARNm y la terminación. Se ha informado que una gran cantidad de activadores y represores regulan la transcripción, incluido un complejo central de múltiples subunidades llamado Mediador que ayuda en el reclutamiento de GTF y la activación de RNA Pol II. Aquí nos centraremos en la formación de los GTF que componen el núcleo complejo de preiniciación (PIC) durante la activación transcripcional.

Figura 10.10 Complejo de preiniciación de la transcripción (PIC). La transcripción de genes de clase II en humanos es provocada por más de cien polipéptidos que se ensamblan en el promotor central de genes que codifican proteínas, que luego dan lugar a un ARNm. Un PIC en un promotor central se muestra en una representación esquemática. El PIC contiene, además del ADN promotor, los GTF (TFIIA, B, D, E, F y H) y el ARN Pol II. Se cree que el ensamblaje del PIC se produce de forma escalonada y altamente regulada, como se indica. TFIID se encuentra entre los primeros GTF que se unen al promotor central a través de su subunidad de proteína de unión a caja TATA (TBP). Los nucleosomas en los sitios de inicio de la transcripción contribuyen al ensamblaje de PIC, mediado por la señalización a través de marcas epigenéticas en las colas de histonas. El Mediador (no mostrado) es otro complejo multiproteico central identificado como un regulador transcripcional global. TATA = ADN de caja TATA BRE u = B elemento de reconocimiento aguas arriba BRE d = B elemento de reconocimiento aguas abajo Inr = iniciador DPE = elemento promotor aguas abajo.

La transcripción de genes dependientes de ARN pol II se desencadena por el ensamblaje regulado de la Complejo de preiniciación (PIC). La formación de PIC comienza con la unión de TFIID al promotor central. El TFIID es un gran complejo multiproteico del tamaño de megadalton con alrededor de 20 subunidades formadas por 14 polipéptidos diferentes: la proteína de unión a la caja TATA (TBP) y los factores asociados a TBP (TAF) (numerados del 1 al 13) (fig. 10.11). Algunas de las subunidades TAF están presentes en dos copias. Una característica clave de los TAF es la dominio de pliegue de histona (HFD), que está presente en 9 de 13 TAF en TFIID. El HFD es un motivo fuerte de interacción proteína-proteína que media la dimerización específica (fig. 10.11). Los TAF que contienen HFD están organizados en heterodímeros discretos, con la excepción de TAF10, que es capaz de formar dímeros con dos componentes TFIID diferentes, TAF3 y TAF8. Los HFD y varias otras características estructurales de TBP y TAF están bien conservados entre especies.

Figura 10.11 TFIID humano. TFIID es un gran complejo multiproteico del tamaño de megadalton que comprende aproximadamente 20 subunidades compuestas por 14 polipéptidos diferentes. Las proteínas constituyentes de TFIID, TBP y TAF se muestran en una representación esquemática representada como barras (recuadro, izquierda). Los dominios estructurados están marcados y anotados. Se da la presunta estequiometría de TAF y TBP en el holocomplejo de TFIID (extremo izquierdo, debajo de gris). TAF10 (en cursiva) crea pares de pliegues de histonas por separado con TAF3 y TAF8. Los TAF presentes en un complejo central fisiológico de TFIID extraído de núcleos eucariotas están marcados en negrita. La arquitectura del complejo central TFIID (EMD-2230) determinada por cryo-EM se muestra (abajo a la izquierda) en dos vistas relacionadas por una rotación de 90 ° (flechas) [35]. El complejo holo-TFIID se caracteriza por una notable plasticidad estructural. Dos conformaciones, basadas en datos crio-EM (EMD-2284 y EMD-2287), se muestran a la derecha, una forma canónica (arriba) y una forma reordenada observada más recientemente (abajo). En la conformación reordenada, el lóbulo A (coloreado en rojo) migra desde un extremo del complejo TFIID (unido al lóbulo C) hasta la otra extremidad (unido al lóbulo B)

Se demostró que el TFIID adopta una forma asimétrica de herradura con tres lóbulos de tamaño casi igual (A, B y C), exhibiendo un grado considerable de flexibilidad conformacional con al menos dos conformaciones distintas (abierta y cerrada) (figura 10.11). ). El componente TBP de TFIID se une a un ADN secuenciado específico llamado caja TATA. Esta secuencia de ADN se encuentra aproximadamente 30 pares de bases corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción en muchos promotores de genes eucariotas. Cuando TBP se une a una caja TATA dentro del ADN, distorsiona el ADN insertando cadenas laterales de aminoácidos entre pares de bases, desenrollando parcialmente la hélice y doblándola doblemente. La distorsión se logra mediante una gran cantidad de contacto superficial entre la proteína y el ADN. TBP se une a los fosfatos cargados negativamente en la cadena principal del ADN a través de residuos de aminoácidos de lisina y arginina cargados positivamente. La curva pronunciada en el ADN se produce mediante la proyección de cuatro residuos de fenilalanina voluminosos en el surco menor. A medida que el ADN se dobla, aumenta su contacto con TBP, lo que mejora la interacción ADN-proteína. La tensión impuesta sobre el ADN a través de esta interacción inicia la fusión o separación de las hebras. Debido a que esta región de ADN es rica en residuos de adenina y timina, cuyas bases se emparejan a través de solo dos enlaces de hidrógeno, las cadenas de ADN se separan más fácilmente.

La unión de TFIID a la caja TATA del promotor central implica la liberación de TBP del lóbulo A, probablemente en etapas que superan cada una de las interacciones inhibidoras que bloquean diferentes superficies funcionales de TBP (figura 10.12). Es probable que las interacciones de las regiones TAND1 y TAND2 de TAF1 con TBP (Figura 10.12a, d) se liberen (i) cuando el Lóbulo C se acopla al ADN aguas abajo y posiciona la región promotora aguas arriba de manera que pueda ser 'escaneada' por TBP ( Figura 10.12b, e) y (ii) cuando TFIIA se une al complejo mediante la interacción con el lóbulo B y estabiliza aún más la ubicación de TBP para la interacción del ADN (figura 10.12c, f). El compromiso final de TBP con el promotor, con la flexión concomitante del ADN, es estéricamente incompatible con la interacción TBP-TAF11 y, por lo tanto, conduce al desprendimiento de TBP del lóbulo A y la apertura del sitio de unión para TFIIB (figura 10.12f). , que a su vez involucrará a Pol II, probablemente vinculado a TFIIF, promoviendo así el ensamblaje de PIC (Figura 10.12g).

Figura 10.12 Cambios en los socios de unión de TBP a través del proceso de unión del promotor. En la parte superior están las estructuras atómicas del TFIID humano en el proceso de participación del promotor. Con (a) en el estado canónico, (B) en el estado de escaneo y (C) en el estado comprometido. En el fondo, (D) muestra TBP unido por TAF inhibidores, (mi) cómo estos TAF actúan para inhibir la unión del ADN y (F) cómo TBP se une a los factores de transcripción generales TFIIA y TFIIB cuando forman un complejo con el PIC. El complejo TFIID comprometido recluta a Pol II (gramo) con la ayuda de TFIIB y TFIIF.

Por tanto, la unión de TFIID al promotor central es seguida por el reclutamiento de GTF y ARN pol II adicionales. Varias líneas de evidencia sugieren que este proceso ocurre en un orden definido, escalonado y sufre una reestructuración significativa. Primero, PIC adopta un estado inactivo, el complejo "cerrado", que es incapaz de iniciar la transcripción. Además de TFIID, TFIIH también es fundamental para el cambio de RNA Pol II de la conformación cerrada a la abierta. TFIIH tiene una actividad de translocasas dependiente de ATP dentro de una de sus subunidades, que abre alrededor de 11 a 15 pares de bases alrededor del sitio de inicio de la transcripción moviéndose a lo largo de una hebra de ADN induciendo una tensión de torsión, lo que lleva a reordenamientos conformacionales y al posicionamiento del ADN monocatenario. al sitio activo de RNA pol II. En este complejo "abierto", el ARN pol II puede entrar en elongación para transcribir a través de un gen de una manera altamente procesiva sin disociarse de la plantilla de ADN o perder el ARN naciente.

En la mayoría de los eucariotas, después de sintetizar alrededor de 20 a 100 bases, el ARN pol II puede pausar (Pausa proximal del promotor) y luego se desconectan de los elementos promotores y otros componentes de la maquinaria de transcripción, dando lugar a un complejo de elongación completamente funcional en un proceso llamado promotor escape. Los componentes del PIC unidos al promotor, por el contrario, permanecen en su lugar y, por lo tanto, solo es necesario reclutar TFIIB, TFIIF y RNA pol II para la reiniciación, lo que aumenta significativamente la tasa de transcripción en rondas posteriores de transcripción. Escape del promotor está precedido por un transcripción abortada en muchos sistemas, donde se sintetizan múltiples productos de ARN cortos de 3 a 10 bases de longitud.

Además de los elementos promotores dentro del ADN, elementos potenciadores también son importantes para el inicio de la transcripción. Promotoresse definen como elementos de ADN que reclutan complejos de transcripción para la síntesis de ARN codificante y no codificante. Potenciadoresse definen como elementos de ADN que regulan positivamente la transcripción en los promotores a largas distancias de una manera independiente de la posición y la orientación. Sin embargo, los estudios han revelado que muchos potenciadores pueden reclutar Pol II e iniciar la transcripción del ARN potenciador (eRNA), difuminando así la distinción funcional entre potenciadores y promotores (Figura 10.13).

La transcripción potenciadora produce ncRNA relativamente corto. Además, la transcripción en los potenciadores es inestable y a menudo conduce al aborto del alargamiento. Por el contrario, el inicio de la transcripción en la mayoría de los promotores Pol II es estable y produce ARNm largos. Los estudios topológicos revelaron que los potenciadores se acercan a los promotores de genes diana durante la activación de la transcripción. Según los modelos actuales de activación de genes, la Complejo mediadorforma un puente físico entre regiones reguladoras distantes y promotores, promoviendo así el bucle. La transcripción de al menos un subconjunto de genes regulados por potenciadores se produce en ráfagas que indican un proceso discontinuo de reclutamiento, ensamblaje y / o conversión de complejos de transcripción a formas competentes de elongación. El fenómeno de estallido sugiere que los contactos potenciador / promotor pueden ser transitorios y poco frecuentes (fig. 10.13).

Figura 10.13 Modelo de transferencia del potenciador de ARN polimerasa II. Se describen los pasos involucrados en el reclutamiento de Pol II a SE, ensamblaje en complejos de transcripción competentes de elongación, iniciación y elongación de la transcripción, aborto y terminación, y transferencia a genes diana. Los factores de transcripción reclutan al Mediador y otros correguladores a los EE. El mediador recluta Pol II y ensambla una fracción en complejos de transcripción competentes en elongación. La transcripción se inicia mediante la fosforilación del CTD. El aborto temprano y la terminación de la transcripción conferidos por el integrador liberan Pol II, que se desfosforila y se transfiere a los promotores de genes diana. Elemento súper potenciador (SE)

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10.4 Alargamiento y terminación de la transcripción

Elongación transcripcional procariota

La tasa de elongación de la transcripción por E. coli RNAP no es uniforme. La síntesis de ARN se caracteriza por pausas, algunas de las cuales pueden ser breves y resolverse espontáneamente, mientras que otras pueden conducir a la complejo de elongación de la transcripción (TEC)retroceso.

La velocidad de elongación y la pausa están determinadas por la secuencia de la plantilla y la estructura del ARN (p. Ej., Bucles de tallo) e involucran al menos dos componentes del centro catalítico de RNAP, el hélice de puente (BH) y desencadenarbucle (TL). Se propone que el alargamiento se produzca en tres pasos (figura 10.14). Primero, el TL se pliega en respuesta a la unión de NTP. Los análisis mutacionales indican que este cambio conformacional en el TL puede limitar la velocidad y refleja la capacidad del NTP entrante para unirse a TEC. El segundo paso es la incorporación del NTP y la liberación de pirofosfato.El tercer paso implica la translocación del RNAP hacia abajo en la plantilla de ADN de modo que el siguiente nucleótido de ARN se pueda agregar a la transcripción naciente.

Figura 10.14 Un modelo de alargamiento transcripcional. Las bisagras de bucle de disparo, las bisagras de hélice de puente y los modelos de flexión de hélice de puente se basan en todas las simulaciones de dinámica molecular de átomos. En la parte superior de la figura, se muestran los diagramas del TEC cerrado, el TEC del producto cerrado (después de la química) y el TEC de translocación. El ADN es gris El ARN es rojo el sustrato NTP (o NMP y pirofosfato incorporados) es azul el bucle de activación (TL) es púrpura la hélice del puente (BH) es amarilla. Las interpretaciones de las simulaciones se muestran esquemáticamente a continuación. Las simulaciones indican bisagras de bucle de gatillo H1 y H2, bisagras de hélice de puente H3 y H4 y modos de curvatura de hélice de puente B1 (más recta) y B2 (más doblada).

El retroceso de TEC puede tener lugar después de una breve pausa en la transcripción, causado por las propiedades termodinámicas de las secuencias de ácidos nucleicos que rodean el complejo de elongación. Además, los eventos de incorporación errónea hacen que los complejos de elongación sean propensos a retroceder en al menos un pb. En este caso, el rescate del retroceso a través de la escisión del extremo 3 & # 8242 de la transcripción errónea también puede verse como una reacción de corrección de pruebas. Cualquier evento de retroceso provoca una pausa o detención de la elongación de la transcripción, lo que puede limitar su tasa general (la velocidad promedio de RNAP a lo largo de la plantilla) o procesividad (la fracción de moléculas de RNAP que llegan al final del gen).

Si bien la estructura general del complejo de elongación (la burbuja de transcripción, el híbrido ARN-ADN) permanece sin cambios durante el retroceso, la extensión del ARN se vuelve imposible en esta conformación. Sin embargo, tales complejos se pueden resolver mediante la actividad hidrolítica de RNAP, que escinde el enlace fosfodiéster en el centro activo del complejo retrocedido, produciendo un nuevo extremo de ARN 3 & # 8242 en el centro activo. Para las copias de seguridad de una sola base, la reacción hidrolítica es catalizada por un dominio flexible de RNAP ubicado en el canal secundario llamado Trigger Loop (TL Figura 10.15B) y los dos iones metálicos del centro activo.

Las secuencias más largas de TEC retrocedido pueden reiniciarse cuando actúan los factores GreA / B, que restauran el extremo 3 & # 8242 de la transcripción naciente al centro activo. GreA y GreB son factores de escisión de la transcripción que actúan sobre complejos de alargamiento retrocedidos. Cuando los factores Gre están ligados en el canal secundario, los factores Gre desplazan el TL del centro activo (Figura 10.15). El desplazamiento apaga la hidrólisis intrínseca del transcrito relativamente lenta dependiente de TL e impone la hidrólisis asistida por Gre altamente eficiente. Se cree que esta eficacia se debe a la estabilización del segundo ion catalítico Mg 2+ y una molécula de agua atacante por los factores Gre.

Figura 10.15 El papel de los factores Gre en el alivio del retroceso del complejo de elongación de la transcripción. (A) Diagrama de cinta de las proteínas GreA y GreB. (B) El modo de funcionamiento de los factores Gre. El factor Gre está unido al complejo de alargamiento activo pero no le impone actividad hidrolítica. Al retroceder o incorporarse erróneamente, el factor Gre sobresale su dominio de bobina enrollada a través del canal secundario de RNAP (que se muestra en el diagrama de la izquierda), donde sustituye al dominio catalítico Trigger Loop (TL). Esta sustitución desactiva la hidrólisis lenta del enlace fosfodiéster dependiente de TL y, en cambio, facilita la hidrólisis dependiente de Gre altamente eficiente. Después de la resolución del complejo retrocedido a través de la escisión del ARN, el complejo de elongación vuelve a la conformación activa y el factor Gre da paso al TL, que ahora puede continuar la catálisis de la síntesis de ARN (que se muestra en el diagrama de la derecha). El cambio controlado entre Gre y TL elimina la posible interferencia de Gre con la síntesis de ARN.

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Terminación transcripcional procariota

La terminación de la transcripción determina los extremos de las unidades transcripcionales al desensamblar el complejo de elongación de la transcripción (TEC), liberando así ARN polimerasas y transcripciones nacientes de las plantillas de ADN. La falla en la terminación provoca la lectura completa de la transcripción, lo que genera transcripciones intergénicas innecesarias y posiblemente dañinas. También puede perturbar la expresión de genes posteriores cuando la TEC no terminada barre los complejos de iniciación de la transcripción de sus promotores o choca con las ARN polimerasas que transcriben hebras opuestas.

La terminación transcripcional en procariotas puede estar codificada por plantilla y ser independiente del factor (terminación intrínseca)o requieren factores accesorios, como Rho, Mfd y DksA. Terminación intrínseca ocurre en secuencias de plantilla específicas & # 8211 una repetición invertida seguida de una serie de residuos A. La terminación es impulsada por la formación de una estructura corta de tallo-bucle en la cadena de ARN naciente (Figura 10.16). La síntesis de ARN se detiene y TEC se disocia en la 7ª y 8ª U de la carrera. La formación del tallo-bucle disocia el híbrido rU: dA débil. La formación del bucle de tallo se ve obstaculizada por secuencias de ARN complementarias aguas arriba que compiten con la porción aguas abajo del tallo, así como por interacciones ARN: proteína en el canal de salida del ARN. La terminación intrínseca depende fundamentalmente del tiempo. El plegado de horquilla y la transcripción del punto de terminación deben estar coordinados, de modo que la horquilla completa esté formada en el momento en que RNAP transcribe el punto de terminación. El tamaño del tallo, la secuencia del tallo y la longitud del bucle afectan la eficiencia de terminación.

El puente α-hélice en la subunidad β & # 8217 bordea el sitio activo y puede tener funciones tanto en la catálisis como en la translocación. Las mutaciones en el motivo YFI (β & # 8217 772-YFI-774) afectan la terminación intrínseca así como la pausa, fidelidad y translocación de RNAP. Una mutación, F773V, anula la actividad del terminador intrínseco λ tR2, aunque las mutaciones vecinas tienen poco efecto sobre la terminación. El modelado sugiere que este fenotipo único refleja la capacidad de F773 para interactuar con el dominio de la bifurcación en la subunidad β.


Figura 10.16 Modelo de terminación intrínseca. (A) Muestra la conformación abierta del RNAP durante el alargamiento transcripcional. El RNAP se muestra en amarillo, la plantilla de ADN en azul y el ARN naciente en rojo. Los elementos clave del canal de salida de ARN de RNAP se muestran en gris y se etiquetan como se indica. (B) Muestra la extensión del ARN naciente a través del canal de salida de RNAP y el potencial para formar la estructura de horquilla del ARN cuando se ha alcanzado la longitud suficiente. (C) Muestra la apertura de la pinza y la desintegración del TEC cuando la estructura de horquilla de ARN se encuentra en la burbuja transcripcional.

La terminación de la transcripción también puede depender de factores accesorios, como la proteína Rho. El factor de terminación de la transcripción Rho es una proteína esencial en E. coli identificado por primera vez por su papel en la terminación de la transcripción en terminadores dependientes de Rho, y se estima que termina

20% de E. coli transcripciones. los rho El gen está muy conservado y es casi omnipresente en las bacterias. Rho es una ATPasa dependiente de ARN con actividad ARN: ADN helicasa y consta de un hexámero de seis monómeros idénticos dispuestos en un círculo abierto (Figura 10.17A).

Rho se une al ARN monocatenario en una vía compleja de múltiples pasos que involucra dos sitios distintos en el hexámero. El sitio de unión primario (PBS), distribuido en los dominios N-terminales alrededor del hexámero (Figura 10.17B, cian), asegura el anclaje inicial de Rho a la transcripción en un sitio de Rut (utilización de Rho), a∼70 nucleótidos (nt) secuencia de ARN larga, rica en citidina y pobremente estructurada. Cada monómero Rho contiene un subsitio capaz de unirse específicamente a los residuos básicos de un dímero 5'-YC (Y es una pirimidina). Los datos bioquímicos y estructurales sugieren que Rho se une inicialmente al ARN en una conformación abierta de "arandela de seguridad" que se cierra en un anillo plano a medida que el ARN se transfiere a la cavidad central. Allí, el ssRNA entra en contacto con un sitio de unión secundario asimétrico (SBS) (fig. 10.17B, verde) y este paso, que presumiblemente limita la velocidad de la reacción general, conduce a la activación motora. Tras la hidrólisis de ATP, el ssRNA es atraído por cambios conformacionales de los bucles Q y R conservados del SBS, lo que lleva a la translocación Rho y, en última instancia, promueve la disociación de la RNA polimerasa (RNAP). El mecanismo molecular de la translocación Rho basado en métodos de fluorescencia de una sola molécula parece ser un seguimiento anclado. El modelo de seguimiento anclado postula que Rho mantiene sus contactos entre el PBS y el sitio de carga (Rut) tras la translocación (figura 10.17B). Este mecanismo permitiría a Rho mantener su interacción de alta afinidad con Rut e implica el crecimiento de un bucle de ARN entre el PBS y el SBS tras la translocación (figura 10.17B).

Figura 10.17 Esquema de la estructura y los mecanismos del factor Rho. (A) Estructura molecular de la proteína Rho (PDB 1pv4) (B) Rho se ensambla como un anillo homo-hexámero (esferas rojas o tetragones), con ARN (curva negra / amarilla) que se une a los sitios de unión primarios (PBS, cian) y los sitios de unión secundarios dentro del anillo (SBS, verde), donde ATP -Tiene lugar la translocación acoplada. El sitio de unión específico de Rut está representado en amarillo. El modelo de seguimiento anclado propuso que Rho transloca el ARN mientras mantiene las interacciones entre PBS y Rut. Este modelo requiere la formación de un bucle que acortaría la extensión del ARN tras la translocación.

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Terminación transcripcional eucariota

En eucariotas, la terminación de la transcripción del gen que codifica la proteína por la ARN polimerasa II (Pol II) generalmente requiere una señal de poliadenilación funcional (pA), típicamente una variación del hexámero AAUAAA. El pre-ARNm naciente se escinde y el fragmento 5 'se poliadenila en el sitio pA poco más abajo del hexámero mediante escisión y factores pA (CPF). Se han sugerido dos mecanismos para la terminación de la transcripción dependiente de pA. En el modelo alostérico, la señal pA y / u otras señales de terminación se unen a la región aguas abajo de la señal pA (PDR) e inducen la reorganización del complejo Pol II. Esto incluye la asociación o disociación de componentes de endonucleasas como las CPF. Esto provoca cambios conformacionales en Pol II y se produce el desmontaje de TEC. En el modelo cinético, también conocido como los"torpedo"modelo, la escisión en el sitio pA separa el pre-ARNm del TEC, que continúa sintetizando una transcripción naciente aguas abajo. Esta nueva transcripción es un sustrato de XRN2 / Rat1p, una exoribonucleasa procesiva 5'-a-3 'que alcanza y desmonta el TEC por un mecanismo desconocido.

Los dos modelos dependientes de pA no son mutuamente excluyentes y se han propuesto modelos unificados. Las secuencias señal de pA poco conservadas corriente abajo de los genes que codifican proteínas se unen a componentes del complejo del factor de poliadenilación (CF1) que conduce al ensamblaje de la maquinaria de escisión y poliadenilación. La terminación está acoplada a la escisión de una manera que aún no se ha resuelto por completo; sin embargo, uno de los principales factores implicados en la terminación de pA de levadura es la endonucleasa Ysh1. Por ejemplo, el agotamiento de Ysh1 bloquea la disociación de TEC, pero no causa una lectura sustancial en el sitio de terminación (Fig. 10.18 A & ampB). Estos resultados sugieren que Ysh1 no causa directamente la pausa que ocurre en la vía de terminación alostérica, sino que juega un papel en la disociación del complejo Pol II de la plantilla de ADN (Figura 10.18A & amp B). Cabe señalar que no toda la terminación dependiente de pA depende de Ysh1 y que aún quedan por dilucidar otros mecanismos de terminación mediada por pA.

Figura 10.18 Representación esquemática de la terminación Pol II después de eliminar los factores de terminación no pA y pA. El alargamiento de Pol II (verde) termina las transcripciones de pA (A) después de un cambio alostérico (rojo) que reduce la procesividad. (B) El agotamiento de Ysh1 conduce a transcripciones de lectura mínimamente extendidas, pero no bloquea el cambio alostérico en Pol II. (C) La unión de Nrd1 y Nab3 recluta a Sen1 para la terminación de las transcripciones que no son pA. (D) El complejo de elongación Pol II que carece de Nrd1 no reconoce las secuencias de terminación en la transcripción naciente y, por lo tanto, no facilita la transición alostérica en Pol II. Esto conduce a una lectura completa procesiva. (E) Nrd1 y Nab3 reconocen secuencias terminadoras que permiten el cambio alostérico en Pol II pero el agotamiento de Sen1 bloquea la eliminación de Pol II de la plantilla.

Los mecanismos de terminación de la transcripción mediada por Pol II difieren para las transcripciones codificantes y no codificantes. Las transcripciones de codificación y posiblemente algunas transcripciones no caracterizadas estables (SUT) casi siempre se procesan en el extremo 3 'mediante la maquinaria de escisión y poliadenilación (pA) y se procesan mediante los mecanismos de terminación dependientes de pA descritos anteriormente. Por el contrario, los ncRNA son terminados y procesados ​​por una vía alternativa que, en la levadura, requiere las proteínas de unión al ARN Nrd1 y Nab3, así como la ARN helicasa Sen1 (Fig. 10.18 C). Nrd1 y Nab3 reconocen los elementos de la secuencia de ARN aguas abajo de snoRNA y CUT y esto conduce a la asociación de un complejo que contiene la helicasa de ADN / ARN Sen1 y la exosoma nuclear. los exosoma nuclear es un complejo de ribonucleasas con actividad endonucleasa y exonucleasa 3 & # 8242 a 5 & # 8242. Funciona para degradar las transcripciones de ARN inestables o incorrectas.

Tanto el agotamiento de Nrd1 como el de Sen1 conducen a la transcripción completa de ncRNA, lo que sugiere su importancia en la terminación de la transcripción no dependiente de pA (Fig. 10.18 C & amp D). Además, el agotamiento de Nrd1 también provoca la acumulación de ncRNA de lectura más larga, lo que sugiere su papel en el tráfico de ncRNA al exosoma nuclear después de la terminación.

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10.5 Procesamiento de ARN

Las modificaciones postranscripcionales de ARNr y ARNt serán temas del Capítulo 11, ya que su estructura y función en la síntesis de proteínas será un punto focal. Por tanto, esta sección se centrará en las modificaciones postranscripcionales del ARNm.

Procesamiento de ARN procariótico

Las células bacterianas no tienen una modificación postranscripcional extensa del ARNm principalmente porque la transcripción y la traducción son procesos acoplados. Las células bacterianas carecen de la barrera física de un núcleo, lo que permite que los mecanismos de transcripción y traducción funcionen al mismo tiempo, lo que permite la traducción simultánea de un ARNm mientras se transcribe (fig. 10.19). Dentro de este sistema, la proteína NusG juega un papel fundamental. NusG tiene tres dominios separados y se conocen las funciones de dos de ellos. El dominio N-terminal NusG (NusG-NTD) tiene la capacidad de unirse a RNAP, mientras que el dominio C-terminal (NusG-CTD) puede combinarse con el componente NusE (RpsJ) de los ribosomas. Estas dos funciones de NusG permiten acoplar la transcripción con la traducción. NusG CTD también puede unirse a Rho para terminar la transcripción (Figura 10.19).

Figura 10.19. Los roles de NusG en el acoplamiento de transcripción / traducción. (a) Composición de un complejo RNAP activo. El RNAP se muestra en gris oscuro, el ADN en azul y el ARN naciente en rojo. El ribosoma se muestra en verde con la cadena polipeptídica naciente en gris claro, el bulto en la subunidad pequeña indica la ubicación de NusE (RpsJ). NusG se muestra en naranja: su forma denota dos secciones funcionales. La sección más grande denota el dominio N-terminal, que se une a RNAP. La sección más pequeña denota el dominio C-terminal, que interactúa con NusE in situ. Rho se muestra en violeta. (b) Una vez completada la traducción, NusG permanece unido a RNAP y también puede unirse a Rho a través del dominio C-terminal que conduce a la terminación de la transcripción.

Procesamiento de ARN eucariota

En los organismos multicelulares, casi todas las células contienen el mismo genoma, sin embargo, se observa una compleja diversidad espacial y temporal en las transcripciones de genes. Esto se logra a través de múltiples niveles de procesamiento que van de un gen a otra proteína, de los cuales el procesamiento de ARN es una etapa esencial. Después de la transcripción de un gen por las ARN polimerasas para producir una transcripción de ARNm primaria, se requiere un procesamiento adicional para producir un producto de ARN maduro estable y funcional. Esto implica varios pasos de procesamiento, incluida la escisión del ARN en sitios específicos, eliminación de intrones, denominada empalme, que aumentan sustancialmente el repertorio de transcripciones, y la adición de un 5 & # 8217CAP. Otra característica crucial del procesamiento del ARN de la mayoría de los genes es la generación de extremos 3 'a través de una escisión endonucleolítica inicial, seguida en la mayoría de los casos por la adición de una cola de poli (A), un proceso denominado escisión del extremo 3' y poliadenilación (CPA) .

3 & # 8242-Poliadenilación

Como se vio en la Sección 10.4, la poliadenilación es un paso necesario para la terminación correcta de casi todas las transcripciones de ARNm. Con la excepción de los genes de histonas dependientes de la replicación, los ARNm que codifican la proteína metazoica contienen un extremo uniforme 3 & # 8242 que consiste en un tramo de adenosinas. Además de determinar la longitud correcta de la transcripción en la terminación de la transcripción, la cola poli (A) ayuda a asegurar la translocación de la molécula de ARN naciente desde el núcleo al citoplasma, mejora la eficiencia de la traducción, actúa como una característica de señal para la degradación del ARN y, por lo tanto, contribuye a la eficiencia de producción de una proteína.

El CPA se lleva a cabo mediante un complejo de procesamiento del extremo 3 'de múltiples subunidades, que involucra más de 80 trans-actuando proteínas, compuestas por cuatro subcomplejos de proteínas centrales (Figura 10.20 A). Estos consisten en (1) factor de especificidad de escisión y poliadenilación (CPSF), compuesto por proteínas CPSF1-4, factor que interactúa con PAPOLA y CPSF1 (FIP1L1) y dominio de repetición 33 de WD (WDR33) (mostrado en verde en la Figura 10.20 A) (2) factor de estimulación de escisión (CstF), un trímero de CSTF1-3 (mostrado en rojo en la Figura 10.20 A (3) factor de escisión I (CFI), un tetrámero de dos subunidades pequeñas de nudix hidrolasa 21 (NUDT21) y dos subunidades grandes de CPSF7 y / o CPSF6 (mostradas en naranja en la Figura 10.20 A) y (4) factor de escisión II (CFII), compuesto por la subunidad 1 de polirribonucleótido quinasa del factor de escisión (CLP1) y la subunidad del factor de escisión y poliadenilación de PCF11 (PCF11) (mostrada en amarillo en la Figura 10.20 A). Los factores adicionales incluyen symplekin, la poli (A) polimerasa (PAP) y las proteínas de unión a poli (A) nucleares como la proteína de unión a poli (A) nuclear 1 (PABPN1).

El CPA es iniciado por este complejo reconociendo específicos cis-secuencias de elementos dentro de las transcripciones de pre-ARNm nacientes denominadas señales de poliadenilación (PAS). La secuencia PAS normalmente consta de un hexámero AATAAA canónico o una variante cercana que generalmente se diferencia en un solo nucleótido (por ejemplo, ATTAAA, TATAAA). Se localiza de 10 a 35 nucleótidos corriente arriba del sitio de escisión (CS) que generalmente consiste en un dinucleótido CA. El PAS también está determinado por los elementos auxiliares circundantes, como los elementos ricos en U aguas arriba (USE), o los elementos ricos en U y ricos en U aguas abajo y las secuencias ricas en G (DSE).

Tan pronto como la molécula de ARN naciente emerge de la ARN polimerasa II (ARN Pol II), el complejo CPSF se recluta en el hexámero PAS a través de numerosas interacciones.Tras el ensamblaje exitoso de esta maquinaria macromolecular, CPSF3 realiza la escisión endonucleolítica seguida de una adición sin plantilla de aproximadamente 50-100 residuos A.

Figura 10.20. La maquinaria de procesamiento de ARN del extremo 3 'del núcleo y su impacto en la poliadenilación alternativa. (A) La maquinaria de procesamiento del extremo 3 'del núcleo consta de complejos compuestos por múltiples proteínas de acción trans que interactúan con el ARN a través de múltiples elementos cis (USE = elemento de secuencia ascendente PAS = señal poli (A) CS = sitio de escisión DSE = elemento de secuencia descendente CTD = C -dominio terminal). Tras el ensamblaje cotranscripcional de estos complejos, se produce la escisión y poliadenilación del ARN para formar el extremo 3 'de la molécula de ARN naciente. (B) Más del 70% de todos los genes albergan más de una señal de poliadenilación (PAS). Esto da lugar a isoformas de transcripción que difieren en el extremo 3 'del ARNm. Mientras que la poliadenilación alternativa (APA) en 3'UTR cambia las propiedades del ARNm (estabilidad, localización, traducción), el uso de PAS interno (en intrones o la secuencia codificante (CDS)) cambia los extremos C de la proteína codificada, lo que resulta en diferentes propiedades funcionales o reguladoras.

La poliadenilación alternativa (APA) ocurre cuando más de un PAS está presente dentro de un pre-ARNm y proporciona un nivel adicional de complejidad en el procesamiento del ARN mediado por CPA (Figura 10.20 B). Los primeros estudios revelaron que una parte significativa de los genes se someten a APA, y con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de ARN de próxima generación, la regulación de genes a gran escala se ha hecho evidente, con aproximadamente el 70% del transcriptoma que exhibe regulación de APA. Como APA determina el contenido de 3'UTR y, por lo tanto, las características reguladoras disponibles para el ARNm, los cambios en el perfil de APA de un gen pueden tener un impacto enorme en la expresión.

Formación 5 & # 8242-CAP

En eucariotas, el casquete 5 ′, que se encuentra en el extremo 5 ′ de una molécula de ARNm, consiste en un nucleótido de guanina conectado al ARNm mediante un enlace trifosfato de 5 ′ a 5 ′ inusual (fig. 10.21). Esta guanosina se metila en la posición 7 directamente después de tapar en vivo por una metiltransferasa. Se le conoce como un casquete de 7-metilguanilato, abreviado m 7 G.

En eucariotas multicelulares y algunos virus, existen otras modificaciones, incluida la metilación de los grupos hidroxi 2 'de los 2 primeros azúcares ribosa del extremo 5' del ARNm. Cap-1 tiene un grupo 2'-hidroxi metilado en el primer azúcar ribosa, mientras que cap-2 tiene grupos 2'-hidroxi metilado en los dos primeros azúcares ribosa. La tapa 5 'es químicamente similar al extremo 3' de una molécula de ARN (el carbono 5 'de la tapa ribosa está enlazado y el 3'-OH no enlazado). Esto proporciona una resistencia significativa a las exonucleasas 5 '.

Los ARNnn contienen tapas 5 ′ únicas. Los snRNA de clase Sm se encuentran con tapas de 5′-trimetilguanosina, mientras que los snRNA de clase Lsm se encuentran con tapas de 5′-monometilfosfato. En las bacterias, y potencialmente también en los organismos superiores, algunos ARN están cubiertos con NAD +, NADH o 3′-defosfocoenzima A. En todos los organismos, las moléculas de ARNm se pueden decapar en un proceso conocido como mensajero. Desencapsulado de ARN.

Para la protección con 7-metilguanilato, el complejo enzimático de protección (CEC) se une a la ARN polimerasa II antes de que comience la transcripción. Tan pronto como el extremo 5 'de la nueva transcripción emerge de la ARN polimerasa II, el CEC lleva a cabo el proceso de taponamiento (este tipo de mecanismo asegura el taponamiento, como ocurre con la poliadenilación). Las enzimas para la protección solo pueden unirse a la ARN polimerasa II que participa en la transcripción del ARNm, lo que garantiza la especificidad de la capa de m 7 G casi por completo para el ARNm.

Figura 10.21 Estructura del CAP de 7-metilguanilato.

La tapa de 5 ′ tiene cuatro funciones principales:

  1. Regulación de la exportación nuclear
  2. Prevención de la degradación por exonucleasas.
  3. Promoción de la traducción (ver ribosoma y traducción)
  4. Promoción de la escisión del intrón proximal 5 '

Además de la cola de poliA, la exportación nuclear de ARN está regulada por el complejo de unión de la tapa (CBC), que se une al ARN con la tapa de 7-metilguanilato (figura 10.22). A continuación, el complejo de poros nucleares reconoce el CBC y se exporta el ARNm. Una vez en el citoplasma después de la ronda pionera de traducción, el CBC es reemplazado por los factores de traducción eIF4E y eIF4G del complejo eIF4F. Luego, este complejo es reconocido por otra maquinaria de iniciación de la traducción, incluido el ribosoma, lo que ayuda a la eficiencia de la traducción.

El taponamiento con 7-metilguanilato evita la degradación de 5 'de dos formas. En primer lugar, se evita la degradación del ARNm por exonucleasas 5 'pareciendo funcionalmente un extremo 3'. En segundo lugar, el CBC y el eIF4E / eIF4G bloquean el acceso de las enzimas de desencadenamiento a la tapa. Esto aumenta la vida media del ARNm, esencial en eucariotas, ya que los procesos de exportación y traducción toman un tiempo significativo.

El mecanismo que promueve la escisión del intrón proximal 5 'durante el empalme no se comprende bien, pero la tapa de 7-metilguanilato parece girar e interactuar con el espliceosoma, lo que potencialmente juega un papel en el proceso de empalme.

El decapitado de un ARNm protegido con 7-metilguanilato es catalizado por el complejo de decaptación formado por al menos Dcp1 y Dcp2, que deben competir con eIF4E para unirse al casquete. Por lo tanto, el casquete de 7-metilguanilato es un marcador de un ARNm que se traduce activamente y es utilizado por las células para regular la vida media del ARNm en respuesta a nuevos estímulos. Durante el proceso de descomposición, los ARNm pueden enviarse a los cuerpos P. Los cuerpos P son focos granulares dentro del citoplasma que contienen altos niveles de actividad exonucleasa.

Figura 10.22 Importancia del 5-CAP durante la vida útil de una transcripción de ARNm (a) Se requiere CBC para el procesamiento previo al ARNm. La unión cotranscripcional de CBC a 7mG previene las actividades de desintegración de los complejos de degradación de pre-ARNm [DXO (exoribonucleasa de desencadenamiento) y Dcp (ARNm de desencadenamiento) Xrn2 (5′-3 ′ exoribonucleasa 2)] y promueve el procesamiento de pre-ARNm. CBC recluta P-TEFb [Cdk9 / Cyclin T1 (CycT1)] en los sitios de inicio de la transcripción de genes específicos que promueven la fosforilación del RNA pol II CTD en los residuos Ser2. Esto da como resultado el reclutamiento de factores de empalme, incluido SRSF1, que regula los eventos de empalme tanto constitutivos como alternativos. Además, el CBC interactúa con los componentes de la maquinaria de empalme que da como resultado el ensamblaje espliceosomal. CBC interactúa con NELF y promueve el procesamiento previo al ARNm de las transcripciones de histonas dependientes de la replicación. (b) CBC forma un complejo con Ars2 y promueve la biogénesis de miARN mediando el procesamiento de pri-miARN. (c) CBC / Ars2 promueve el procesamiento previo al ARNm de las transcripciones de histonas dependientes de la replicación. (d) CBC promueve la exportación de U snRNA. CBC interactúa con PHAX, que recluta factores de exportación, incluidos CRM1 y RAN · GTP. (e) CBC promueve la exportación de ARNm. Para la exportación de transcripciones de más de 300 nucleótidos, hnRNP C interactúa con CBC e inhibe la interacción entre CBC y PHAX, lo que permite que CBC interactúe con TREX y la transcripción se transloque al citoplasma. El CBC interactúa con la deadenilasa de PARN e inhibe su actividad, protegiendo los ARNm de la degradación. (f) CBC media en la ronda pionera de traducción. Cbp80 interactúa con CTIF, que recluta la subunidad ribosómica 40S a través de eIF3 en el extremo 5 'del ARNm para el inicio de la traducción. Tras la unión de importina-β (Imp-β) a importina-α (Imp-α), el ARNm se libera de CBC y se une a eIF4E para el inicio del modo estándar de traducción. Los componentes de mRNP unidos a CBC que no se encuentran en los mRNP unidos a eIF4E son CTIF, complejo de unión de exón (EJC) y PABPN1. (g) El modo estándar de traducción está mediado por la proteína de unión al casquete eIF4E. eIF4E es un componente del complejo eIF4F que promueve el inicio de la traducción.

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Empalme de ARNm

Los genes eucariotas que codifican polipéptidos se componen de secuencias codificantes llamadas exones(ex-on significa que son expresionado) y secuencias intermedias llamadas intrones(En t-ron denota su En tpapel de acompañamiento). Las secuencias de ARN transcritas correspondientes a intrones no codifican regiones del polipéptido funcional y se eliminan del pre-ARNm durante el procesamiento. Es esencial que todas las secuencias de ARN codificadas por intrones se eliminen de forma completa y precisa de un pre-ARNm antes de la síntesis de proteínas para que las secuencias de ARN codificadas por el exón se unan adecuadamente para codificar un polipéptido funcional. Si el proceso se equivoca incluso en un solo nucleótido, las secuencias de los exones reunidos se desplazarían y el polipéptido resultante no sería funcional. El proceso de eliminar secuencias de ARN codificadas por intrones y reconectar las codificadas por exones se denomina Empalme de ARN. Las secuencias de ARN codificadas por intrones se eliminan del pre-ARN mientras todavía está en el núcleo. Aunque no se traducen, los intrones parecen tener varias funciones, incluida la regulación génica y el transporte de ARNm. Una vez completadas estas modificaciones, el transcripción madura, el ARNm que codifica un polipéptido, se transporta fuera del núcleo, destinado al citoplasma para su traducción. Los intrones pueden empalmarse de manera diferente, lo que da como resultado que se incluyan o excluyan varios exones del producto de ARNm final. Este proceso se conoce como splicing alternativo. La ventaja del corte y empalme alternativo es que se pueden generar diferentes tipos de transcripciones de ARNm, todas derivadas de la misma secuencia de ADN. En los últimos años, se ha demostrado que algunas arqueas también tienen la capacidad de empalmar su pre-ARNm.

La reacción de empalme es catalizada por el espliceosoma, un complejo macromolecular formado por cinco pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP), denominadas U1, U2, U4, U5 y U6, y aproximadamente 200 proteínas (fig. 10.23). El ensamblaje del espliceosoma en pre-ARNm incluye la unión de U1 snRNP, U2 snRNP, el triple snRNP preformado U4 / U6-U5 y el complejo Prp19. Este ensamblaje se produce mediante el reconocimiento de varios elementos de secuencia en el pre-ARNm que definen los límites exón / intrón, que incluyen los sitios de empalme (SS) 5 ′ y 3 ′, las secuencias 3 ′ asociadas para la escisión del intrón, la polipirimidina (Py ) tracto y la secuencia de puntos de ramificación (BPS). El ensamblaje del espliceosoma durante el proceso se muestra en la Figura 10.23.

Figura 10.23 Representación esquemática del ensamblaje de espliceosomas y empalme de pre-ARNm. En el primer paso del proceso de empalme, el sitio de empalme 5 ′ (GU, 5 ′ SS) está unido por el U1 snRNP, y los factores de empalme SF1 / BBP y U2AF reconocen cooperativamente la secuencia de puntos de ramificación (BPS), la polipirimidina ( Py) y el sitio de empalme 3 '(AG, 3' SS) para ensamblar el complejo E. La unión del U2 snRNP al BPS da como resultado el complejo preespliceosómico A. Los pasos posteriores conducen a la unión del U4 / U5-U6 tri-snRNP y la formación del complejo B. El complejo C se ensambla después de reordenamientos que separan los snRNP de U1 y U4 para generar el complejo B *. El complejo C es responsable de las dos reacciones de transesterificación en el SS. Los reordenamientos adicionales dan como resultado la escisión del intrón, que se elimina como un ARN en lazo, y la ligadura de los exones. Los snRNP de U2, U5 y U6 se liberan del complejo y se reciclan para las rondas posteriores de empalme.

En los mamíferos, el primer paso catalítico de la reacción de empalme comienza cuando el U1 snRNP se une al 5 'SS del intrón (definido por la secuencia consenso AGGURAGU), y los factores de empalme SF1 y U2AF reconocen cooperativamente BPS, Py y 3' SS al complejo ensamblado E o al complejo de compromiso (Figura 10.23). Posteriormente, U2 snRNP y proteínas adicionales se reclutan en el pre-mRNA BPS para formar el pre-espliceosoma o complejo A. La unión del U4 / U6-U5 tri-snRNP forma el pre-espliceosoma o complejo B. Después del RNA- Los reordenamientos de ARN y ARN-proteína en el corazón del espliceosoma, U1 y U4 se liberan para formar el complejo B activado o complejo B * Este complejo es responsable de ejecutar el primer paso catalítico, a través del cual se une el fosfodiéster en el 5 ′ SS de el intrón es modificado por el 2′-hidroxilo de una adenosina del BPS para formar un exón 5 ′ libre y un intrón ramificado (fig. 10.24). La reacción del 2 & # 8242-hidroxilo del nucleótido de adenosina del punto de ramificación se conoce como reacción de transesterificación. Durante este proceso, ocurren reordenamientos adicionales para generar el espliceosoma catalítico o complejo C (fig. 10.23), que es responsable de catalizar la segunda reacción de transesterificación que conduce a la escisión del intrón y la ligadura exón-exón (fig. 10.24). La estructura del intrón resultante se conoce como estructura de lazo. Después del segundo paso catalítico, los snRNP de U2, U5 y U6 se liberan del complejo post-spliceosomal y se reciclan para rondas adicionales de empalme.

Figura 10.24 Reacciones de transesterificación implicadas en el empalme de ARNm. (A) Diagrama esquemático del pre-ARNm con exones e intrones indicados. Se requieren secuencias clave para empalmar en las ubicaciones de intrones 5 & # 8242 y 3 & # 8242, y para el reconocimiento y posicionamiento del residuo de adenosina del punto de ramificación para la primera reacción de transesterificación. (B) Esquema de las dos reacciones de transesterificación necesarias para la eliminación de intrones. El residuo del punto de ramificación 2 & # 8242-OH media el ataque sobre el 5 & # 8242-fosfato del residuo de guanosina del intrón situado en el sitio de corte y empalme 5 & # 8242. Esto libera el hidroxilo 3 & # 8242 del exón 1 que posteriormente media el ataque del fosfato 5 & # 8242 del primer residuo de guanosina en el exón 2. El hidroxilo 3 & # 8242 del residuo de guanina intrón se libera formando la estructura Lariat y el exón 1 se liga al exón 2.

Empalme alternativo (AS)ofrece un mecanismo adicional para regular la producción y función de proteínas. Las opciones de AS están determinadas por la expresión o exposición a en trans elementos presentes en ubicaciones y entornos celulares únicos. Elementos de secuencia adicionales dentro del ARNm, conocidos como exónicoy intrónicoempalmes silenciadores o potenciadores (ESS, ISS, ESE e ISE, respectivamente), participan en la regulación de AS. Las proteínas de unión a ARN específicas, incluidas las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP) y las proteínas ricas en serina / arginina (SR), reconocen estas secuencias para regular positiva o negativamente la AS (figura 10.25). Estos reguladores, junto con un número cada vez mayor de factores auxiliares adicionales, proporcionan la base para la especificidad de este evento de procesamiento de pre-ARNm en diferentes ubicaciones celulares dentro del cuerpo.

Figura 10.25 Regulación de empalme alternativo (AS) por cis elementos de ARNm y trans-actuando factores. El núcleo cis los elementos de secuencia que definen los límites exón / intrón (sitios de empalme 5 'y 3' (SS), GU-AG, tracto de polipirimidina (Py) y secuencia de puntos de ramificación (BPS)) están poco conservados. Los elementos potenciadores y silenciadores adicionales en exones e intrones (ESE: potenciadores de empalme exónico ESI: silenciadores de empalme exónico ISE: potenciadores de empalme intrónico ISI: silenciadores de empalme intrónico) contribuyen a la especificidad de la regulación AS. Trans-actuando Los factores de empalme, como las proteínas de la familia SR y las partículas de ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP), se unen a potenciadores y silenciadores e interactúan con los componentes espliceosomales. En general, las proteínas SR unidas a potenciadores facilitan la definición del exón y las hnRNP inhiben este proceso. Estas trans-actuando Los elementos se expresan de manera diferencial en diferentes ubicaciones o bajo diferentes estímulos ambientales para regular la EA.

Hay varios tipos diferentes de eventos de EA, que se pueden clasificar en cuatro subgrupos principales. El primer tipo es la omisión de exón, que es el principal evento de EA en eucariotas superiores. En este tipo de evento, se elimina un exón en casete del pre-ARNm (fig. 10.26 a). El segundo y tercer tipo son la selección SS alternativa 3 ′ y 5 ′ (Fig. 10.26 by amp c). Estos tipos de eventos de AS ocurren cuando el espliceosoma reconoce dos o más sitios de empalme en un extremo de un exón. El cuarto tipo es la retención de intrones (fig. 10.26 d), en la que un intrón permanece en la transcripción de ARNm maduro. Este evento de AS es mucho más común en plantas, hongos y protozoos que en vertebrados. Otros eventos que afectan el resultado de la isoforma de la transcripción incluyen exones mutuamente excluyentes (figura 10.26 e), uso de promotor alternativo (figura 10.26 f) y poliadenilación alternativa (figura 10.26 g).

Figura 10.26 Representación esquemática de diferentes tipos de eventos alternativos de transcripción o empalme, con exones (recuadros) e intrones (líneas). Los exones constitutivos se muestran en verde y los exones empalmados alternativamente en violeta. Las líneas discontinuas indican el evento AS. Salto de exón (a) alternativa 3 ′ (B) y selección 5 ′ SS (C) retención de intrones (D) exones mutuamente excluyentes (mi) uso alternativo de promotores (F) y poliadenilación alternativa (gramo) se muestran los eventos. Al igual que el empalme alternativo (AS), el uso de promotores alternativos y sitios de poliadenilación permiten que un solo gen codifique múltiples transcripciones de ARNm.


10.3: Detalles de la transcripción - Biología

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