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¿Cómo no pierden potasio las células (marinas)?

¿Cómo no pierden potasio las células (marinas)?


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Las células eucariotas mantienen un gradiente de sodio-potasio a través de su membrana externa. La concentración de iones de potasio es de aproximadamente 5 mM fuera de la célula. Aunque el gradiente de potencial mantiene la mayoría de estos iones cerca de la membrana, ¿no se difunden algunos de estos iones fuera de la célula / organismo? Durante largos períodos de tiempo, ¿las células no se 'secarían' sin potasio? Supongo que se puede hacer el mismo tipo de pregunta sobre el fosfato.


Gill Na + / K + -ATPase (NKA) en peces teleósteos está involucrado en la regulación de iones tanto en agua dulce como en agua de mar. Hemos desarrollado y validado anticuerpos policlonales de conejo específicos para las isoformas proteicas NKA α1a y α1b del salmón del Atlántico (Salmo salar Linnaeus), y utilizó transferencias de Western e inmunohistoquímica para caracterizar su tamaño, abundancia y localización. La masa molecular relativa de NKA α1a es ligeramente menor que la de NKA β1b. La abundancia de branquias NKA α1a fue alta en agua dulce y se volvió casi indetectable después de la aclimatación al agua de mar. NKA α1b estaba presente en pequeñas cantidades en agua dulce y aumentó 13 veces después de la aclimatación al agua de mar. Ambas isoformas de NKA se detectaron solo en células de cloruro. NKA α1a se localizó en las células de cloruro filamentosas y laminares en agua dulce, mientras que en el agua de mar estaba presente solo como un fondo tenue en las células de cloruro filamentoso. En agua dulce, NKA α1b se encontró en un pequeño número de células de cloruro filamentosas y, después de la aclimatación al agua de mar, se encontró en todas las células de cloruro en el filamento y las laminillas. La inmunofluorescencia simultánea doble indicó que NKA α1a y α1b se encuentran en diferentes células de cloruro en agua dulce. En muchas células de cloruro en agua de mar, NKA α1b estaba presente en mayores cantidades en la región subapical que en cualquier otra parte de la célula. Los patrones combinados en abundancia y la inmunolocalización de estas dos isoformas pueden explicar los cambios relacionados con la salinidad en la abundancia total de células de cloruro y NKA. Los resultados indican que hay una isoforma de agua dulce y una isoforma de la subunidad α de NKA en las branquias del salmón del Atlántico y que están presentes en distintas células de cloruro.

La bomba de sodio, Na + / K + -ATPasa (NKA), está presente en todas las células animales y regula los gradientes iónicos intracelulares utilizados para la homeostasis celular y el transporte secundario de otros compuestos (Skou y Esmann, 1992). Está presente en concentraciones especialmente altas en la mayoría de las células epiteliales que regulan el transporte de iones para todo el organismo, como el riñón, las glándulas salinas y las branquias (Epstein et al., 1967). En las branquias de los peces teleósteos, NKA está presente en células especializadas de transporte de iones conocidas como cloro o células ricas en mitocondrias. Estas células son el sitio de absorción de iones en el agua dulce y secreción de sal en el agua de mar (Foskett y Scheffey, 1982), y tienen la concentración celular más alta conocida de NKA, con más de 100 millones de moléculas por célula (Karnaky, 1986).

Todos los teleósteos mantienen una presión osmótica interna casi constante, aproximadamente un tercio de la del agua de mar, independientemente de si se encuentran en agua dulce o salada (Evans et al., 2005). En agua dulce, los peces deben contrarrestar la pérdida pasiva de iones, principalmente sodio y cloruro, y la ganancia de agua. Lo hacen absorbiendo iones de sus alimentos y absorbiendo activamente sodio y cloruro a través de las branquias. El exceso de agua se excreta a través de la producción de orina muy diluida por el riñón y la vejiga urinaria. Los teleósteos en el agua de mar se encuentran en un estado constante de deshidratación inminente y deben contrarrestar la ganancia pasiva de iones y la pérdida de agua. Los teleósteos abordan este desafío bebiendo agua de mar y absorbiendo sal y agua a través del intestino, mientras que el exceso de sodio y cloruro son secretados por las branquias. Por lo tanto, la transición de agua dulce a agua de mar requiere que las branquias inviertan su función de captación de iones a órgano secretor de sal.

Parece haber varios mecanismos para la absorción apical de sodio por las branquias de los peces. El intercambio de sodio-hidrógeno parece ser el mecanismo predominante, ya sea mediante intercambiadores de sodio-hidrógeno (NHE), o mediante una H + -ATPasa apical que genera un gradiente eléctrico favorable para la entrada de sodio a través de un canal de sodio (ENaC) (Evans et al. al., 2005). También hay evidencia de que algunos peces teleósteos utilizan un cotransportador apical de NaCl para la absorción de sodio (Hiroi et al., 2008). Es probable que la NKA participe en la salida basolateral de sodio a la sangre (McCormick, 1995).

Tres proteínas principales de transporte de iones están involucradas en la secreción de sodio y cloruro por las branquias cuando los peces están en agua de mar. NKA bombea tres iones de sodio fuera de la celda mientras bombea dos iones de potasio, lo que hace que el interior de la celda de cloruro sea altamente negativo y bajo en sodio. El gradiente de sodio es luego utilizado por el cotransportador Na + / K + / 2Cl - (NKCC) para llevar el cloruro al interior de la célula. Posteriormente, el cloruro deja las células en un gradiente eléctrico favorable a través de un canal de cloruro apical, que se ha demostrado que es un homólogo del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) (Marshall, 2002). Además de proporcionar el gradiente electroquímico para la secreción de cloruro, NKA también bombea sodio al espacio paracelular donde el sodio sale a través de uniones sueltas en un gradiente eléctrico favorable. Las tres principales proteínas transportadoras de iones implicadas en la secreción de sal, NKA, NKCC y CFTR, se han co-localizado en células de cloruro en varias especies de peces teleósteos (McCormick et al., 2003 Hiroi et al., 2005).

NKA se compone de dos subunidades esenciales, α y β. La subunidad α se considera la unidad catalítica principal y contiene todos los principales sitios de unión para ATP, Na +, K + y ouabaína (un inhibidor específico de la enzima). La subunidad α es un polipéptido glicosilado que ayuda a plegar y posicionar la proteína en la membrana plasmática basolateral. Una tercera subunidad denominada γ, también conocida como FXYD, no es necesaria para la función catalítica de NKA, pero aparentemente actúa para adaptar las propiedades cinéticas del transporte de sodio y potasio para las funciones de diferentes tipos de células (Garty y Karlish, 2006). Dentro de la subunidad α existen al menos cuatro isoformas que se expresan en vertebrados estas tienen diferentes propiedades cinéticas para la unión de Na +, K + y ATP, y varían en su inhibición por ouabaína y calcio, y su regulación por segundos mensajeros intracelulares (Blanco y Mercer, 1998). Estas propiedades únicas, junto con su distribución específica de células, sugieren que las isoformas de NKA tienen una función y regulación fisiológicas distintas.

Recientemente, Richards y sus colegas (Richards et al., 2003) proporcionaron evidencia genética molecular de que hay varias isoformas de la subunidad α expresadas en el tejido branquial de la trucha arco iris. El nivel de ARNm de la isoforma α1a de NKA aumenta después de la transferencia del agua de mar al agua dulce, y el de la isoforma α1b aumenta después de la transferencia de agua dulce a agua de mar. Se han encontrado efectos similares de la salinidad en estas isoformas en el salmón del Atlántico (Salmo salar Linnaeus) además, el nivel de ARNm de NKA α1a branquial disminuye y el de NKA α1b aumenta en agua dulce durante la transformación de parr-smolt cuando aumenta la tolerancia a la salinidad de los juveniles (Nilsen et al., 2007). Sin embargo, hasta la fecha, la evidencia de estas isoformas α1 específicas de salinidad se basa únicamente en cambios en los niveles de ARNm, y no ha habido caracterización o localización de las proteínas mismas. Para comenzar la caracterización de estas isoformas de NKA, desarrollamos y validamos anticuerpos específicos para NKA α1a y NKA α1b. Luego examinamos la abundancia y localización de cada isoforma en el tejido branquial del salmón atlántico juvenil en función de la salinidad ambiental.


Decir hacia arriba y hacia abajo: cómo los gusanos planos marinos aprenden a sentir la gravedad

Todos los organismos vivos están equipados con órganos sensoriales para detectar cambios en su entorno circundante. Puede que no nos parezca obvio de inmediato, pero, de manera similar a cómo podemos sentir el calor, el frío, la luz y la oscuridad, también somos extremadamente expertos en sentir la gravedad. En nuestro caso, es nuestro oído interno el que hace este trabajo, ayudándonos a mantener el equilibrio, la postura y la orientación en el espacio. Pero, ¿qué pasa con otros organismos, por ejemplo, los invertebrados que carecen de columna vertebral?

El órgano sensor de gravedad en algunos invertebrados acuáticos, conocido como "estatocisto", es, de hecho, bastante fascinante. El estatocisto es esencialmente un saco lleno de líquido con células sensoriales que recubren su pared interna y una pequeña masa mineralizada llamada "estatolito" contenida en su interior. Durante cualquier movimiento del cuerpo, el estatolito se mueve y, en consecuencia, entra en contacto con las células sensoriales de la pared interna, desviándolas. Las desviaciones, a su vez, activan las neuronas (células nerviosas), que luego transmiten señales al cerebro sobre cambios en la orientación del cuerpo.

Sin embargo, exactamente cómo las células sensoriales estimulan las neuronas no está particularmente claro para los gusanos planos acoel: animales marinos de cuerpo blando con una anatomía simple, que representan una de las primeras formas de vida existentes con simetría bilateral (izquierda-derecha). Lo que los zoólogos saben hasta ahora, basándose en el hallazgo de que los gusanos planos juveniles de acebo ocasionalmente no detectan la gravedad, es que la capacidad se adquiere en algún momento después de la eclosión de los huevos.

En un nuevo estudio publicado en Zoomorfología, científicos de la Universidad de Okayama, Japón, dirigidos por el profesor Motonori Ando, ​​han intentado comprender mejor a estas curiosas criaturas. Pero, ¿qué es exactamente tan atractivo sobre los gusanos planos del acoel? El profesor Ando explica: "Comprender el mecanismo de respuesta al estímulo de Acoela puede descubrir un mecanismo de control biológico fundamental que se remonta al origen de los animales bilaterales, incluidos los humanos. Estos organismos, por lo tanto, son clave para desentrañar el proceso de evolución".

Para su estudio, los científicos utilizaron una especie de acelga llamada Praesagittifera naikaiensis o P. naikaiensis que es endémica de las costas del mar de la isla de Seto en Okayama. "El misterioso plan corporal de P. naikaiensis podría ser clave para conectar Okayama y el medio ambiente natural del mundo ", dice el profesor Ando.

Examinar la relación entre el estatocisto y el sistema nervioso de P. naikaiensis, los científicos tenían que hacerlos a ambos visibles, una tarea que generalmente se realiza mediante un "marcador" o una "etiqueta". Sin embargo, debido a la falta de una etiqueta adecuada para el estatocisto, adoptaron una estrategia diferente en la que etiquetaron en su lugar la lámina basal, la capa sobre la que se asientan las células sensoriales. En cuanto al sistema nervioso, etiquetaron las terminales nerviosas con un marcador bien conocido. Finalmente, estudiaron la muestra utilizando microscopía confocal, una técnica en la que la luz se enfoca en un punto definido a una profundidad específica para estimular solo los marcadores locales.

Los resultados fueron esclarecedores. Los científicos encontraron que el gusano plano acoel desarrolló una capacidad de detección de la gravedad dentro de 0 a 7 días después de la eclosión, y el estatolito se formó después de la eclosión. El estatocisto comprendía cordones nerviosos longitudinales y transversales, formando lo que se llama un "cerebro comisural" y una "comisura asociada a estatocisto" (stc) caracterizada por fibras transversales. Ellos plantearon la hipótesis de que una capacidad de detección de la gravedad se desarrolló cuando: 1) el estatolito adquirió una concentración suficiente de sales de calcio, 2) stc funcionó como neuronas transmisoras de señales y 3) las células sensoriales estaban presentes fuera del saco y estimuladas indirectamente por el statolito a través de la lámina basal y stc.

Inspirado por estos hallazgos, el profesor Ando ha visualizado futuras direcciones de investigación e incluso aplicaciones prácticas de su estudio. "Se ha informado de que especies estrechamente relacionadas de este organismo habitan en la costa del Mar del Norte, la costa mediterránea y la costa este de América del Norte. Dado que existe un gran interés por la similitud de sus hábitats, podemos ampliar nuestra investigación a más a nivel mundial, utilizando estos animales como un novedoso sistema de bioensayo para el medio ambiente en el que viven, especialmente ante el ritmo acelerado del cambio climático y la degradación antropogénica del hábitat. Además, los gusanos planos acoel podrían ser un excelente modelo biológico para el estudio de enfermedades causadas en humanos debido a anomalías de las células ciliadas sensoriales ", dice el Prof. Ando.


Efecto del cloruro de sodio sobre las características de crecimiento de la levadura marina Debaryomyces hansenii en cultivo discontinuo y continuo bajo limitación de carbono y potasio

Debaryomyces hansenii se ha hecho crecer en un cultivo discontinuo de volumen relativamente grande (& gt 1 l) en un medio con pH inicial de 5 · 0, 7 · 2 y 8 · 3 en presencia y ausencia de 1 · 5 m -NaCl añadido. El pH del medio se mantuvo o se dejó que cambiara. Las características de crecimiento parecieron ser muy similares en todos los tratamientos, excepto que la fase de retraso se extendió por la presencia de 1 · 5 MNaCl.

La levadura también se hizo crecer en cultivo continuo bajo limitación de carbono en presencia o ausencia de NaCl 1 · 5 M añadido con el pH descontrolado o mantenido a pH 8 · 3. Los estudios intensivos mostraron que la levadura se ajusta osmóticamente mediante dos mecanismos. Uno es relativamente a corto plazo e implica un influjo de sodio, mientras que el otro implica la pérdida de sodio de la célula. Ambos están asociados con la síntesis de glicerol. El análisis de los rendimientos de biomasa y contenido molar de solutos dentro de las células, ambos por mol de glucosa utilizado, mostró que a las tasas de crecimiento específicas más bajas, las células estaban limitadas en glucosa pero limitadas en energía a velocidades más altas. La tasa de crecimiento específica a la que las células se volvieron limitadas en energía fue menor en medio salino (y más baja cuando el pH se mantuvo en 8 · 3). Cuando el cultivo estaba limitado en glucosa, en condiciones no salinas, el crecimiento dependía mucho de la absorción de potasio, cuyo contenido intracelular por mol de glucosa utilizado era mucho mayor que el de cualquier otro soluto medido. En condiciones salinas con un medio ácido, gran parte de la glucosa utilizada se gastó en generar el potencial de soluto apropiado principalmente con glicerol y sodio. Las condiciones bajo las cuales las células están limitadas en energía se consideran en relación con el ciclo inútil del glicerol y el mantenimiento de un gradiente apropiado de protones a través del plasmalema en un medio alcalino. La limitación de potasio en cultivo continuo se estudió en medios de baja salinidad y de alta salinidad (0 · 5 m -NaCl) con el pH no controlado externamente o mantenido en 5 · 5 u 8 · 3. Los osmolitos principales parecían ser potasio y glicerol en medios de baja salinidad y sodio, glicerol y arabitol en 0,5 m -NaCl. La relación entre el rendimiento y la concentración interna de potasio por mol de glucosa utilizado para cualquier medio indicó que la producción de biomasa y la absorción de potasio están estrechamente relacionadas. La concentración de glicerol por mol de glucosa utilizado fue proporcional al rendimiento en todos los medios a pH 8 · 3 en el medio 0 · 5 m -NaCl se produjo relativamente menos arabitol. Las concentraciones celulares más altas de sodio y glicerol se observaron en este medio a las tasas de crecimiento específicas más altas. Estos estudios confirman datos previos que muestran que en medios salinos el crecimiento de la levadura en condiciones alcalinas es fisiológicamente diferente del que se produce en condiciones ácidas.

Dirección actual: Departamento de Microbiología, Universidad de Sheffield Sheffield, S10 2TN, Reino Unido.


¿Cómo funciona la tinción de Gram?

La tinción de Gram implica tres procesos: tinción con un tinte soluble en agua llamado cristal violeta, decoloración y contratinción, generalmente con safanina. Debido a las diferencias en el grosor de una capa de peptidoglicano en la membrana celular entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, las bacterias Gram positivas (con una capa de peptidoglicano más gruesa) retienen la tinción de cristal violeta durante el proceso de decoloración, mientras que las bacterias Gram negativas pierden la tinción cristal violeta y en su lugar se tiñen con safranina en el proceso de tinción final. El proceso consta de tres pasos:

  1. Las células se tiñen con colorante violeta cristal. A continuación, se agrega una solución de yodo Gram & # 039s (yodo y yoduro de potasio) para formar un complejo entre el cristal violeta y el yodo. Este complejo es una molécula más grande que la tinción cristal violeta original y el yodo y es insoluble en agua.
  2. Se agrega a la muestra un decolorante como alcohol etílico o acetona, que deshidrata la capa de peptidoglicano, encogiéndola y apretándola. El gran complejo de cristal violeta-yodo no puede penetrar esta capa de peptidoglicano apretada y, por lo tanto, queda atrapado en la célula en bacterias Gram positivas. Por el contrario, la membrana externa de las bacterias Gram negativas se degrada y la capa más fina de peptidoglicano de las células Gram negativas es incapaz de retener el complejo cristal violeta-yodo y se pierde el color.
  3. Se agrega a la muestra una contratinción, como la safranina débilmente soluble en agua, y se tiñe de rojo. Dado que la safranina es más clara que el cristal violeta, no altera la coloración púrpura en las células Gram positivas. Sin embargo, las células Gram negativas decoloradas se tiñen de rojo.

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¿Cómo no pierden potasio las células (marinas)? - biología

Buena pregunta.
La vida evolucionó en el océano, por lo que el interior de las células de las especies marinas tiene una salinidad que es como la salinidad del agua de mar.

Para comprender los problemas con el equilibrio de agua y sal en los seres vivos, es necesario comprender un proceso llamado ósmosis. Voy a empezar dándoles un "experimento mental" para que lo imaginen. Imagínese dos habitaciones que tienen corrales para cachorros. Los corrales están conectados por una puerta para cachorros a través de la pared. Los cachorros pueden ir y venir entre las habitaciones usando la puerta. Imagina que se mueven al azar. ¿Aproximadamente qué fracción de los cachorros habría en cada corral? Probablemente alrededor de la mitad y la mitad. Ahora imagina que las personas amantes de los cachorros son colocadas en UNO de los corrales. La gente no entrará por la puerta de los cachorros. Ahora cada persona sostiene y juega con los cachorros, por lo que casi todos los cachorros están en un corral. ¿Por qué te hablo de los cachorros cuando me preguntaste sobre el pescado y las algas? Vamos a llegar. Si tuvieras una celda que solo contuviera agua y la pusieras en agua pura, el agua entraría y saldría aproximadamente a la misma velocidad. La celda no ganaría ni perdería agua en general. Esto es como los cachorros moviéndose de un lado a otro por su cuenta. Sin embargo, las células no contienen solo agua. Contienen sales, azúcares, proteínas y otras cosas. Actúan como las personas de nuestro experimento mental. Las sales y demás "agarran" las moléculas de agua. La ósmosis es un proceso en el que el agua "sigue" la sal o algo similar a través de una membrana que permite que el agua se mueva, pero no permite que la sal (y otras cosas) se muevan a través de ella. Obviamente, el agua no persigue realmente a la sal, pero cuando su movimiento aleatorio la lleva a la sal, es atraída por cargas y no es probable que se vaya.

Si dejara caer la célula de un pez en agua pura, el agua entraría en la célula mucho más rápido de lo que salió debido a las sales y las cosas en la célula. Eventualmente, la celda del pez se llenaría de agua y estallaría. Si la celda del pez no tuviera muchas sales y otras cosas, y la arrojabas al agua de mar, la mayor parte del agua saldría de la celda, siguiendo a la sal del exterior. La célula del pez se marchitaría. En el agua salada, la celda de un pez debe tener suficiente material "pegajoso" para que el agua evite que la sal del agua de mar salga de las celdas. Los peces de agua salada tienen la piel que es en su mayor parte impermeable, pero pierden algo de agua dulce y absorben algo de sal a través de la piel. El pescado con hueso puede producir una orina muy concentrada para eliminar la sal extra. También segregan sal extra a través de sus branquias. Los tiburones y sus parientes tienen glándulas que secretan el exceso de sal en su sistema digestivo para que se deshaga de sus desechos. Por lo tanto, no crean agua dulce a partir del agua de mar por separado, pero pueden eliminar la sal adicional. Las algas son técnicamente un alga, no una planta, pero se ocupan del equilibrio hídrico de la misma manera. Las algas pueden producir sustancias que también son "pegajosas" para el agua y permanecen en sus células. La sal no fluye mucho hacia las células y el agua no deja mucho. Las algas y las plantas pueden salirse con la suya si atraen agua a sus células porque tienen una pared celular rígida fuera de la delicada membrana celular. Piense en llenar un globo de agua. Si pones demasiado, el globo estallará como la celda de un pez en agua corriente. Si coloca el globo de agua dentro de una caja del tamaño correcto, simplemente llenaría la caja y dejaría de tomar agua. Así es como una pared celular protege a una célula de dejar entrar demasiada agua.

¿Qué problemas crees que tienen los peces de agua dulce? ¿Cómo podrían solucionarlos? Quizás te interese estudiar fisiología ambiental.

En realidad tenemos mucha sal en nuestra sangre, principalmente en forma de iones de sodio, que son positivos, y iones negativos como los iones de cloruro que los neutralizan. Una vez había un postdoctorado de física en mi laboratorio que temía que muriéramos si bebíamos el agua destilada pura en el laboratorio, porque los glóbulos rojos se hinchan y estallan cuando se ponen en agua destilada. Estaba equivocado, y fue un error bastante estúpido acerca de la biología. Todas las células vivas tienen bombas en sus membranas externas que bombean iones dentro y fuera de las células, para dar la cantidad correcta de sal en las células y en la sangre que las rodea. Las bombas también utilizan energía química para bombear iones de potasio al interior de las células y iones de sodio fuera de las células.

Eso explica su pregunta sobre cómo viven las plantas y los animales en el agua salada. No me parece más extraño que cómo vivimos en el aire o cómo otras plantas y animales viven en el agua dulce. Todos nosotros y todos tenemos las bombas y otras moléculas complejas necesarias para mantener las cantidades adecuadas de sales y agua en nuestros cuerpos.

Tengo una idea de cómo empezó la vida entre láminas de mica. Esta idea explica por qué las células vivas contienen cantidades tan grandes de iones de potasio, porque los iones de potasio mantienen unidas las hojas de mica. Puede encontrar más información sobre esta idea buscando en Google: hojas de mica granny.

Lo importante es darse cuenta de que lo que es importante para un organismo es el agua e incluso el agua de mar más salada sigue siendo aproximadamente un 96% de agua. Pero sí, la sal restante podría ser un problema para una planta o un animal marino. Lo importante es que los organismos tienen formas de utilizar la energía para bombear sales o secuestrarlas de la importante maquinaria celular. Con las plantas, pueden almacenar sales o excretar las sales a través de las hojas. Con los peces de agua salada, lidian con la alta concentración de sal al tener una orina que tiene un alto contenido de sal. La idea básica es que los seres vivos pueden adaptarse a entornos salados de diversas formas, ya sea escondiendo la sal en un compartimento celular separado o excretando la sal.

La respuesta corta es que las algas marinas y otras algas de agua salada no son en realidad plantas y utilizan una bioquímica interna que no requiere agua dulce como lo hacen las plantas terrestres. Dicho esto, la hierba marina ES una planta, pero también ha logrado adoptar una bioquímica que puede arreglárselas con agua salada en lugar de agua dulce.

Las plantas y los animales que viven en agua salada tienen algunos mecanismos para regular su contenido fisiológico de sal. Esto se conoce como osmorregulación. La ósmosis se refiere al flujo de solutos desde una concentración alta (presión osmótica alta salada) a una concentración baja (presión osmótica baja diluida).

Muchos peces de agua salada se osmorregulan mediante la excreción activa de sal a través de las branquias y la orina salada. Esto permite que los peces mantengan una concentración de sal más baja en su cuerpo que en el agua salada circundante. El adjetivo "activo" significa que el proceso consume energía. El cuerpo del pez empuja los iones de sal en dirección opuesta a la que se difundirían naturalmente por ósmosis, y esto consume energía, que el pez debe proporcionar a través de su consumo de alimentos.

Algas son un poco más complicadas. Muchos las algas sintetizan alcoholes y otros solutos moleculares orgánicos dentro de sus células en respuesta al aumento de los niveles de salinidad de su entorno. Esto aumenta la presión osmótica dentro de la celda para que coincida con el entorno exterior y, por lo tanto, evita que el exceso de sal se difunda dentro de la celda.


Resultados

Durante el crecimiento rápido, la mayor parte de la transcripción celular se deriva de la iniciación en las siete regiones promotoras ribosómicas casi idénticas. Estas regiones están correguladas y la expresión de los principales promotores P1 explica la mayor parte de la transcripción ribosómica (Paul et al, 2004). Prior work has established a primer extension assay for new ribosomal transcription, and we used this to follow changes upon osmotic shock ( Zhi et al, 2003). The primer hybridizes within the 5′ leader region of the unprocessed preribosomal RNA of four of the seven promoters. Because mature ribosomal RNA does not contain this leader, this assay is taken as a measure of newly initiated transcripts.

The physiological context for these RNA measurements is shown in Figure 1. Cells are grown to early to mid-log phase and then challenged by addition of 0.4 M NaCl (addition noted by an arrow in the figure). The rise in optical density halts immediately (compare to unchallenged growth curve), reflecting the known inhibition of growth that is triggered by hyperosmotic shock ( Jovanovich et al, 1988 ). After a lag of 20 min growth apparently resumes, signaling the completion of the adaptation period. RNA was isolated moderately early in the adaptation period (5 min postshock broken arrow in Figure 1) and was probed to reveal the preribosomal RNA transcripts (Figure 1, inset). Compared to a control sample lacking added salt, the signal is very weak (lane 2 versus the lane 1 control). We infer that hyperosmotic shock severely inhibits ribosomal transcription en vivo.

A similar experiment was performed using potassium acetate shock and is shown in Figure 2. The growth behavior (Figure 2) is similar to that seen with salt shock there is an immediate halt, followed by a lag, in turn followed by resumed growth. In this case, the lag is much longer likely due to the toxic effects of imported acetate ( Roe et al, 1998). Preribosomal RNA analysis 5 min after addition (broken arrow) shows that potassium acetate also leads to a severe inhibition of ribosomal transcription (Figure 2, inset lane 2 compared to the lane 1 control).

Next, the kinetics of changed ribosomal transcription was monitored. This is important for two reasons. Most important, the initial event after hyper-smotic shock is the rapid import of potassium accompanied by the accumulation of glutamate (see Introduction). Other osmoprotectants accumulate more slowly than potassium glutamate, and it is this slower accumulation that likely completes the adaptation. Thus, very short-time measurements reflect primarily a potassium glutamate environment. In addition, ribosomal transcription can be affected by changes in the levels of chromosomal proteins Fis and H-NS (reviewed in Paul et al, 2004 Gralla, 2005 ). Such changes are also slow and if they occur are expected later in the adaptation period. Therefore, strong inhibition at the very earliest times should reflect increases in potassium glutamate levels rather than these other potential macromolecular effectors.

Figure 3A shows the time course of expression beginning immediately after the salt shock and extending throughout the adaptation period. These data reflect primarily newly initiated ribosomal transcripts, and thus are an approximate measure of transcription initiation (see above). There are two important aspects to these data. First, newly synthesized RNA is at much reduced levels immediately after addition of salt (lane 1 and also compare lanes 1 and 2 of Figure 3B). This implies that the inhibition is a primary response and does not require changes in levels of the neutral osmoprotectants that accumulate more slowly. Potassium glutamate has been reported to accumulate in this same short time ( Dinnbier et al, 1988 ). The specificity of the inhibition is confirmed by analysis of the effect on gadB RNA, which is shown to be largely unaffected by the salt shock (Figure 3B, lane 3 versus lane 4).

Second, the data show that after this initial strong inhibition there is a slow recovery of ribosomal transcription (Figure 3A, lanes 2–5). The kinetics of this recovery follows that of the apparent resumption of growth and roughly correspond to decreases in intracellular potassium glutamate levels ( Dinnbier et al, 1988 ). As the cells approach the slow stationary phase of growth, the amount of r-RNA is reduced (lane 6) as already known to be the case ( Paul et al, 2004). We infer that ribosomal transcription is immediately halted upon hyper-osmotic shock and only recovers as the intracellular environment adapts to allow renewed growth under high salt conditions.

The complex LB media used in these experiments may contain neutral osmoprotectants such as glycine betaine or related molecules. In minimal media, the accumulation of neutral osmoprotectants relies on known synthetic pathways and cells primarily produce the osmoprotectant trehalose ( Kempf and Bremer, 1998 ). New transcription in minimal media begins after a lag of several minutes, and is maintained during the adaptation period ( Jovanovich et al, 1988 ). Figure 3C shows that salt shock in minimal media leads to an immediate and strong inhibition of ribosomal transcription (compare lanes 1 and 2). The level of inhibited transcription appears to be similarly low to that in LB the level prior to shock is lower than in LB, as is expected from the lower levels known to accompany the reduced doubling time in minimal media. There is a very modest restoration of transcription during the adaptation period (lanes 2–8), but this never reaches high levels, as expected for slow growth in minimal media ( Bremer and Dennis, 1996 ). Overall, the pattern is similar in rich and minimal media, with an immediate inhibition of ribosomal transcription followed by a slow recovery.

Transcription of ribosomal RNA is known to be strongly affected by the nucleotide ppGpp and the macromolecules Fis and H-NS ( Paul et al, 2004 Gralla, 2005 ). There have been no reports of rapid changes in Fis or H-NS activities, but kinetic studies after growth downshifts suggest that ppGpp levels might change over the time scale of these experiments ( Murray et al, 2003). To assess the potential contribution of changing ppGpp levels to the observed rapid reduction in transcription, a quantitative experiment was performed to compare the salt-induced reduction in r-RNA transcription of wild-type cells with those deficient in ppGpp production.

The results, done in LB media, are shown in Figure 4. Cells with low ppGpp levels are seen to produce the same amount of ribosomal RNA as wild-type cells (lanes 1 versus 7), and this amount is lowered five-fold for both wild type and mutant cells immediately after shock (lanes 2 versus 8) and 5 min later (lanes 3 versus 9). A parallel comparison was performed with cells deficient in the transcriptional activator Fis. In this case, the initial RNA level is lower (lanes 1 versus 4), as expected. Both strains strongly reduce RNA levels after salt shock (lanes 2 and 5) although the Fis-deficient strain appears to show some difficulty in recovery (lanes 3 versus 6), again as may be expected. Basically, the data show that there is no detectable contribution made by ppGpp or Fis to the rapid inhibition of r-RNA expression upon salt challenge. The available data do suggest that macromolecular regulators might contribute to total amounts of r-RNA at later times during the recovery period (see Afflerbach et al, 1998 for H-NS). However, the initial strong inhibition appears to be mostly independent of the known regulators of r-RNA transcription.

It is also possible that changes in the leader r-RNA turnover rate could contribute to the rapid reduction in level observed. This process, measured previously in a plasmid expression context, was estimated to have a halftime of slightly more than a minute ( Schaferkordt and Wagner, 2001 ). We conducted rifampicin challenge experiments using the current experimental protocol and found a similar r-RNA leader half-life after salt challenge (data not shown), suggesting that enhanced turnover is not the cause of the observed reduction in transcription.

This immediate severe reduction in ribosomal transcription is roughly coincident with a rapid increase in intracellular potassium glutamate levels. As discussed above, array analyses have shown that a number of promoters, primarily those transcribed by sigma38 RNA polymerase, are activated under these conditions. Sigma70 promoters show diverse responses to potassium glutamate, and both stimulation and repression have been noted in vitro ( Leirmo et al, 1987 Lee and Gralla, 2004 ). Ribosomal promoters (sigma70-controlled) are known to be unusually sensitive to salt inhibition ( Ohlsen and Gralla, 1992 ). To assess how ribosomal transcription responds to increases in potassium glutamate levels, in vitro transcription was carried out.

Figure 5A shows the transcription response of the supercoiled rrnb promoter as potassium glutamate levels are increased in vitro. The data show that high concentrations of potassium glutamate lead to strong reductions in ribosomal transcription (see also Zhi et al, 2003). The data suggest that the increasing potassium glutamate concentration known to occur upon osmotic shock is expected to strongly inhibit ribosomal transcription.

The addition of potassium acetate also inhibits ribosomal transcription en vivo (see Figure 2) and en vivo acetate anion is known to become rapidly concentrated in the cytoplasm ( Roe et al, 1998). This raises the possibility that the reduction in transcription is caused directly by acetate salts acting at the ribosomal promoters. To assess this possibility, the in vitro experiments were repeated as a potassium acetate titration and the results showed strong inhibition (Figure 5B). These inhibitory effects of salts of acetate and glutamate can be viewed as part of the known sodium chloride-sensitivity of ribosomal transcription ( Ohlsen and Gralla, 1992 ), reproduced here for potassium chloride (Figure 5C). As a comparison, we show that the common lac UV5 test promoter is only slightly inhibited at 200 mM salts compared to 50 mM (Figure 5D: KCl, compare lanes 1 and 2 potassium glutamate, compare lanes 3 and 4), the same range that leads to severe reductions in ribosomal transcription (Figure 5A and C). Overall, we infer that the inhibition of ribosomal transcription upon accumulation of salts of glutamate or acetate en vivo can be explained in significant part by direct inhibition by salts at the salt-sensitive promoters.

Inspection of the salt inhibition data shows that although glutamate and chloride anions are both inhibitory, transcription is higher with glutamate, consistent with the known ability of general transcription to be increased when glutamate is substituted for chloride (compare fraction of transcription remaining at 300 mM) ( Leirmo et al, 1987 ). Apparently, the built-in salt sensitivity of the rrn promoters is sufficiently severe so as to direct strong inhibition when potassium glutamate accumulates, allowing physiologically appropriate inhibition of ribosomal transcription upon hyperosmotic shock.

The nature of the sensitivity to potassium glutamate is not known. When potassium glutamate accumulates upon osmotic shock, it induces certain sigma38 promoters and at osmY this is proposed to occur by triggering escape of RNA polymerase already bound and poised at that promoter ( Lee and Gralla, 2004 ). To test whether potassium glutamate is blocking binding or escape of RNA polymerase at the rrnb promoter DNase footprints were carried out, as described previously at the same promoter without potassium glutamate ( Ohlsen and Gralla, 1992 ). The data compare promoter occupancy at 50 mM potassium glutamate where transcription is high to 300 mM where transcription is low. At 50 mM potassium glutamate, where transcription is high (Figure 5A), a clear open complex footprint is observed (Figure 6A, lanes 1 versus 2). At 300 mM potassium glutamate, where transcription is very low, a footprint is either absent or barely detectable (Figure 6B, lanes 5 versus 6). These footprints were carried out on supercoiled DNA, using primer extension methods ( Gralla, 1985 ), to allow direct comparisons with the transcription experiments. Because supercoiling appears to change upon osmotic shock ( Higgins et al, 1988 Hsieh et al, 1991 ) and because ribosomal promoters are sensitive to changes in supercoiling ( Ohlsen and Gralla, 1992 ), the footprints were repeated on linearized DNA. The data show again that high potassium glutamate concentrations eliminate RNA polymerase binding (similar signals in lanes 7 and 8 compared to the footprint seen by comparing lanes 3 and 4). We infer that the high concentrations of potassium glutamate that accumulate upon osmotic shock would be expected to block the binding of RNA polymerase to the ribosomal promoters.

The kinetic data (above) show that ribosomal transcription eventually recovers as cell growth resumes. Renewed growth requires the accumulation of neutral osmoprotectants, most likely glycine betaine in rich media and trehalose in minimal media ( Kempf and Bremer, 1998 ). Figure 7A and B shows that high concentrations of these components do not inhibit rrnb transcription. These experiments were conducted over the same range of concentrations over which salts were strongly inhibitory (Figure 5). We suggest that the accumulation of these neutral osmoprotectants contributes to the restoration of ribosomal transcription needed for resumption of growth (Figures 1 and 2).


How Do Guard Cells Regulate the Opening and Closing of the Stomata?

A plant's guard cells regulate the opening and closing of the epidermal stomata by expanding or contracting in response to environmental signals. When a pair of guard cells surrounding a stoma receives the signal that the stomatal pore needs to open, the guard cell pair fill with water, changing the cell's shape and opening the pore. An inverse process occurs when the guard cells receive a signal to close the stoma, initiating a loss of water and causing them to shrink and close the pore.

The change in turgor, or hydrostatic pressure, within a guard cell pair is the result of the osmotic water flow across the cell walls. The water potential inside the cell pair changes as a result of the related movements of ions and sugar solutes, and when that potential decreases, it lets the cells absorb water, expand and open the stoma.

Although sugar solutes within the guard cells play a role in the expansion and contraction processes, the primary mediators are chlorine and potassium ions. The accumulation of potassium ions within a guard cell, triggered by an environmental signal such as sunlight, causes the osmotic pressure to decrease and attracts water into the cell. The triggered increase of chlorine ions and an additional anion called malate within the cell contribute to the opposite effect, causing water to exit and the guard cell pair to contract and close the stomatal pore.


There is a trade-off between photosynthesis and transpiration in leaves because (a) numerous stomatal pores provide both gas exchange for photosynthesis and openings through which water vapor escapes (b) a waxy layer, the cuticle, reduces water loss (c) blue light triggers an influx of potassium ions (K + ) into the guard cells (d) leaves of deciduous plants abscise as winter approaches in temperate climates (e) stomata are closed at night, although water continues to move into the roots by osmosis

There is a trade-off between photosynthesis and transpiration in leaves because (a) numerous stomatal pores provide both gas exchange for photosynthesis and openings through which water vapor escapes (b) a waxy layer, the cuticle, reduces water loss (c) blue light triggers an influx of potassium ions (K + ) into the guard cells (d) leaves of deciduous plants abscise as winter approaches in temperate climates (e) stomata are closed at night, although water continues to move into the roots by osmosis



Comentarios:

  1. Kaktilar

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  2. Vijind

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  3. Calibom

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