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9.1: Aislamiento, secuenciación y síntesis de ADN - Biología

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5.1 Aislamiento, secuenciación y síntesis de ADN

ADN genómico vs ADN complementario

Ácido desoxirribonucleico genómico es el ADN cromosómico, en contraste con el ADN extracromosómico, como el que se encuentra en las mitocondrias de los mamíferos o las estructuras plasmídicas en las bacterias (Figura 5.1). Luego también se abrevia como ADNg. La mayoría de los organismos tienen el mismo ADN genómico en todas las células; sin embargo, solo ciertos genes están activos en cada célula para permitir la función celular y la diferenciación dentro del cuerpo.

El genoma de un organismo (codificado por el ADN genómico) es la información (biológica) de la herencia que se transmite de una generación de organismo a la siguiente. Ese genoma se transcribe para producir varios ARN, que son necesarios para la función del organismo. El ARNm precursor (pre-ARNm) es transcrito por la ARN polimerasa II en el núcleo. El pre-ARNm se procesa luego empalmando para eliminar los intrones, dejando los exones en el ARN mensajero maduro (ARNm). El procesamiento adicional incluye la adición de una tapa 5 'y una cola de poli (A) al pre-ARNm. El ARNm maduro puede transportarse luego al citosol y ser traducido por el ribosoma en una proteína. Otros tipos de ARN incluyen ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt). Estos tipos son transcritos por la ARN polimerasa II y la ARN polimerasa III, respectivamente, y son esenciales para la síntesis de proteínas. Sin embargo, el ARNr 5s es el único ARNr que es transcrito por la ARN polimerasa III.

En genética, ADN complementario (ADNc) es ADN sintetizado a partir de una plantilla de ARN monocatenario (p. ej., ARN mensajero (ARNm) o microARN) en una reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa (Figura 5.1). La transcriptasa inversa es una enzima que se encuentra en retrovirus como el VIH que tienen el ARN como material genético central. Al entrar en la célula huésped, el ARN se transcribe de forma inversa para producir una copia del ADNc que luego puede integrarse en el ADN genómico del huésped. En biotecnología, la transcriptasa inversa se usa a menudo para crear ADNc a partir del ARNm expresado en células o tejidos específicos. De esta forma, los genes eucariotas se pueden clonar sin ningún intrón alojado en la estructura. Esto es especialmente útil si el objetivo es expresar la proteína en un huésped procariota (bacteriano). Recuerde que el ADN bacteriano no alberga ninguna secuencia de intrones dentro de su ADN cromosómico. Por lo tanto, si está utilizando un sistema procariótico para expresar proteínas eucarióticas, debe utilizar ADNc, ya que el sistema procariótico no podrá eliminar las secuencias de intrones después de la transcripción génica.

El término ADNc también se usa, típicamente en un contexto bioinformático, para referirse a una secuencia de transcripción de ARNm, expresada como bases de ADN (GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).

  • El ADNc se deriva del ARNm, por lo que solo contiene exones pero no intrones.

Figura 5.1. ADN genómico (ADNg) frente a ADN complementario (ADNc). El diagrama de la izquierda muestra el procesamiento del ADN genómico dentro de una célula para producir una proteína (Panel azul superior muestra los elementos estructurales comunes a los genes eucariotas. El proceso de transcripción de genes produce una molécula de ARN mensajero (ARNm) que debe modificarse postraduccionalmente, panel gris, para eliminar las secuencias de intrones no codificantes y agregar las secciones 5'-CAP y Poly-A-Tail. El ARNm maduro se transporta desde el núcleo hasta el citoplasma, donde el ribosoma lo traduce a la secuencia de la proteína. panel rojo.) El diagrama de la derecha muestra que el aislamiento de ARNm de una célula puede usarse para sintetizar ADNc usando la enzima transcriptasa inversa. El ADNc resultante solo contiene elementos del ARNm maduro, incluidos los exones y la cola poli-A.

Imagen modificada de Wikipedia


Técnicas de aislamiento de ADN

Aislamiento de ADN es un proceso de purificación de ADN a partir de una muestra mediante una combinación de métodos físicos y químicos. El primer aislamiento de ADN fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher. Actualmente es un procedimiento de rutina en biología molecular o análisis forenses. Para el método químico, se utilizan muchos kits diferentes para la extracción, y seleccionar el correcto ahorrará tiempo en la optimización del kit y los procedimientos de extracción. Se considera que la detección de sensibilidad por PCR muestra la variación entre los kits comerciales.

Hay tres técnicas estándar de purificación de ADN que se describen a continuación:

  • Es necesario recolectar las células que se van a estudiar.
  • Romper las membranas celulares para exponer el ADN junto con el citoplasma interno (lisis celular).
    • Los lípidos de la membrana celular y el núcleo se descomponen con detergentes y tensioactivos.
    • Romper proteínas agregando una proteasa (opcional).
    • Romper el ARN agregando una ARNasa (opcional).
  • La solución se trata con una solución salina concentrada (solución salina) para hacer que los desechos como las proteínas rotas, los lípidos y el ARN se agrupen.
  • Centrifugación de la solución, que separa los restos celulares agrupados del ADN.
  • Purificación de ADN a partir de detergentes, proteínas, sales y reactivos utilizados durante la etapa de lisis celular. Los procedimientos más utilizados son:
    1. Precipitación de etanol generalmente con etanol helado o isopropanol. Dado que el ADN es insoluble en estos alcoholes, se agregará, dando una bolita tras la centrifugación. La precipitación del ADN se mejora aumentando la fuerza iónica, generalmente agregando acetato de sodio.
    2. Extracción de fenol-cloroformo en el que el fenol desnaturaliza las proteínas de la muestra. Después de la centrifugación de la muestra, las proteínas desnaturalizadas permanecen en la fase orgánica mientras que la fase acuosa que contiene ácido nucleico se mezcla con el cloroformo que elimina los residuos de fenol de la solución.
    3. Purificación de minicolumnas que se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos pueden unirse (adsorción) a la fase sólida (sílice u otra) dependiendo del pH y la concentración de sal del tampón (Figura 5.2).

Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN se pueden eliminar añadiendo una proteasa o precipitando las proteínas con acetato de sodio o amonio, o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.

Después del aislamiento, el ADN se disuelve en un tampón ligeramente alcalino, normalmente en un tampón Tris-EDTA o en agua ultrapura. Las modificaciones realizadas a estas técnicas estándar a menudo se realizan si el tejido que se usa es difícil de descomponer, si persisten contaminantes en la solución de lisis que inhiben reacciones posteriores, o si la muestra es extremadamente mínima, como suele ser el caso en las investigaciones forenses. Además, se adaptarán diferentes kits comerciales para el aislamiento de ADN genómico más grande o ADN plásmido más pequeño.

Figura 5.2 Columna de centrifugación de sílice utilizada para la purificación de ADN. La purificación de ácidos nucleicos basada en columna de centrifugación es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos nucleicos. Este método se basa en el hecho de que el ácido nucleico se unirá a la fase sólida de la sílice en determinadas condiciones y luego se liberará cuando se alteren esas condiciones. Para la unión, se agrega una solución tampón al lisado de ADN junto con etanol o isopropanol. Esto forma la solución vinculante. La solución de unión se transfiere a una columna de centrifugación y la columna se coloca en una centrífuga. La centrífuga fuerza la solución de unión a través de una membrana de gel de sílice que se encuentra dentro de la columna de centrifugado. Si el pH y la concentración de sal de la solución de unión son óptimos, el ácido nucleico se unirá a la membrana de gel de sílice a medida que la solución la atraviese. Para lavar los componentes celulares no específicos de la columna, se elimina el flujo continuo y se agrega un tampón de lavado a la columna. La columna se vuelve a colocar en una centrífuga, lo que obliga al tampón de lavado a través de la membrana. Esto elimina las impurezas restantes de la membrana, dejando solo el ácido nucleico unido al gel de sílice. Para eluir, se elimina el tampón de lavado y se añade a la columna un tampón de elución bajo en sal (o simplemente agua). La columna se vuelve a colocar en una centrífuga, lo que obliga al tampón de elución a través de la membrana. El tampón de elución desplaza el ácido nucleico de la columna permitiendo que se recoja en el flujo. A diferencia del ARN, que se degrada muy rápidamente, el ADN es bastante estable y puede almacenarse durante largos períodos de tiempo a -20ºC.oC.

Imagen de Squidonius

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Técnicas de secuenciación de ADN

secuencia ADN es el proceso de determinar la secuencia de ácido nucleico, el orden de los nucleótidos en el ADN. Incluye cualquier método o tecnología que se utilice para determinar el orden de las cuatro bases: adenina, guanina, citosina y timina. El advenimiento de los métodos rápidos de secuenciación del ADN ha acelerado enormemente la investigación y el descubrimiento biológicos y médicos.

El conocimiento de las secuencias de ADN se ha vuelto indispensable para la investigación biológica básica y en numerosos campos aplicados como el diagnóstico médico, la biotecnología, la biología forense, la virología y la sistemática biológica. La comparación de secuencias de ADN sanas y mutadas puede diagnosticar diferentes enfermedades, incluidos varios cánceres, caracterizar el repertorio de anticuerpos y puede usarse para guiar el tratamiento del paciente. Tener una forma rápida de secuenciar el ADN permite administrar una atención médica más rápida e individualizada, y para identificar y catalogar más organismos.

La rápida velocidad de secuenciación lograda con la tecnología moderna de secuenciación de ADN ha sido fundamental en la secuenciación de secuencias completas de ADN, o genomas, de numerosos tipos y especies de vida, incluido el genoma humano y otras secuencias completas de ADN de muchos animales, plantas y microbios. especies.

Las primeras secuencias de ADN fueron obtenidas a principios de la década de 1970 por investigadores académicos utilizando laboriosos métodos basados ​​en cromatografía bidimensional. Tras el desarrollo de métodos de secuenciación basados ​​en fluorescencia con un secuenciador de ADN, la secuenciación de ADN se ha vuelto más fácil y mucho más rápida.

La estructura canónica del ADN tiene cuatro bases: timina (T), adenina (A), citosina (C) y guanina (G). La secuenciación del ADN es la determinación del orden físico de estas bases en una molécula de ADN. Sin embargo, las bases de ADN a menudo se modifican mediante procesos epigenéticos para controlar la expresión génica. Por lo tanto, muchas otras bases modificadas que pueden estar presentes en una molécula de ADN que las cuatro bases estándar. Por ejemplo, en algunos virus (específicamente, bacteriófagos), la citosina puede ser reemplazada por hidroximetil- o hidroximetilglucosa citosina. En el ADN eucariota, se pueden encontrar bases variantes con grupos metilo o fosfosulfato (Figura 5.3). Dependiendo de la técnica de secuenciación, una modificación particular, por ejemplo, la 5mC (5-metilcitosina) común en humanos, puede detectarse o no.

Figura 5.3 Modificaciones del ADN con funciones reguladoras epigenéticas y sus interdependencias. La citosina (C) se metila a 5-metilcitosina (5mC) mediante ADN metiltransferasas (DNMT) y luego se oxida adicionalmente a 5hmC, 5fC y 5caC mediante Tet dioxigenasas. El 5-hidroxiuracilo (5hmU) se produce por oxidación de timina (T) catalizada por Tet. N6-metiladenina (6mA) probablemente es catalizada por ADN N6 adenina metiltransferasas (DAMT-1 en C. elegans), aunque queda por caracterizar la actividad bioquímica de estas enzimas. Se ha demostrado que las enzimas ALKB similares a Tet NMAD (N6-metil adenina desmetilasa 1) y DMAD (ADN 6mA desmetilasa) están involucradas en la desmetilación de 6 mA en C. elegans y en Drosophila, respectivamente, posiblemente mediante el uso de un mecanismo de dioxigenasa conservada.

Imagen de Breiling y Lyko (2015) Epigenética y cromatina 8:24


  • Métodos tempranos de secuenciación de ADN

El primer método para determinar las secuencias de ADN involucró una estrategia de extensión de cebadores específica de la ubicación establecida por Ray Wu en la Universidad de Cornell en 1970. Para secuenciar los extremos cohesivos se utilizaron la catálisis de la ADN polimerasa y el marcaje de nucleótidos específicos, que figuran de manera prominente en los esquemas de secuenciación actuales. del ADN del fago lambda. Entre 1970 y 1973, Wu, R Padmanabhan y sus colegas demostraron que este método se puede emplear para determinar cualquier secuencia de ADN utilizando cebadores sintéticos específicos de la ubicación. Frederick Sanger adoptó luego esta estrategia de extensión de cebadores para desarrollar métodos de secuenciación de ADN más rápidos en el Centro MRC, Cambridge, Reino Unido, y publicó un método para "secuenciar el ADN con inhibidores de terminación de cadena" en 1977. Walter Gilbert y Allan Maxam de Harvard también desarrollaron métodos de secuenciación, incluido uno para la "secuenciación del ADN por degradación química". En 1973, Gilbert y Maxam informaron la secuencia de 24 pares de bases utilizando un método conocido como análisis de puntos errantes. Los avances en la secuenciación se vieron favorecidos por el desarrollo simultáneo de tecnología de ADN recombinante, que permitió aislar muestras de ADN de fuentes distintas de los virus.

Secuenciación de Maxam-Gilbert requiere el marcaje radiactivo en un extremo 5 'del ADN y la purificación del fragmento de ADN que se va a secuenciar. El tratamiento químico genera entonces roturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases de nucleótidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A + G, C, C + T). La concentración de los químicos modificadores se controla para introducir en promedio una modificación por molécula de ADN. Por tanto, se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo radiomarcado hasta el primer sitio de "corte" en cada molécula. Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis uno al lado del otro en geles de acrilamida desnaturalizantes para la separación por tamaños. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para autorradiografía, produciendo una serie de bandas oscuras, cada una correspondiente a un fragmento de ADN radiomarcado, a partir del cual se puede inferir la secuencia.

Los aspectos técnicos de la secuenciación de Maxam-Gilbert hicieron que perdiera el favor una vez que el método de secuenciación de Sanger se había establecido bien, como se describe a continuación.

El método de terminación de cadena desarrollado por Frederick Sanger y sus colaboradores en 1977 pronto se convirtió en el método de elección, debido a su relativa facilidad y confiabilidad. Cuando se inventó, el método de terminación de cadena utilizaba menos productos químicos tóxicos y menores cantidades de radiactividad que el método Maxam-Gilbert. Debido a su facilidad comparativa, el método Sanger pronto se automatizó y fue el método utilizado en la primera generación de secuenciadores de ADN.

El método clásico de terminación de cadena requiere una plantilla de ADN monocatenario, un cebador de ADN, una ADN polimerasa, trifosfatos de desoxinucleótido normales (dNTP) y trifosfatos de di-desoxinucleótido modificados (ddNTP), el último de los cuales termina la elongación de la cadena de ADN. Estos nucleótidos que terminan la cadena carecen de un grupo 3'-OH requerido para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, lo que hace que la ADN polimerasa cese la extensión del ADN cuando se incorpora un ddNTP modificado. Los ddNTP se pueden marcar de forma radiactiva o fluorescente para su detección en máquinas de secuenciación automatizadas.

La muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas, que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y la ADN polimerasa. A cada reacción se le agrega solo uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP), mientras que los otros nucleótidos agregados son los ordinarios (Figura 5.4).

Figura 5.4. DdNTP fluorescentes para secuenciación de Sanger. Los didesoxinucleótidos se utilizan para la secuenciación ya que no pueden extenderse más una vez que se incorporan al ADN nacente.

Imagen de Fibonachi

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La concentración de didesoxinucleótido debe ser aproximadamente 100 veces menor que la del desoxinucleótido correspondiente (por ejemplo, ddTTP 0,005 mM: dTTP 0,5 mM) para permitir que se produzcan suficientes fragmentos mientras se sigue transcribiendo la secuencia completa. En total, se necesitan cuatro reacciones separadas en este proceso para probar los cuatro ddNTP (Figura 5.5).

Figura 5.5. El método de Sanger (terminación de cadena) para la secuenciación del ADN. (1) Se hibrida un cebador con una secuencia, (2) Se agregan reactivos al cebador y al molde, que incluyen: ADN polimerasa, dNTP y una pequeña cantidad de los cuatro didesoxinucleótidos (ddNTP) marcados con fluoróforos. Durante el alargamiento del cebador, la inserción aleatoria de un ddNTP en lugar de un dNTP termina la síntesis de la cadena porque la ADN polimerasa no puede reaccionar con el hidroxilo faltante. Esto produce todas las longitudes posibles de cadenas. (3) Los productos se separan en un gel capilar de un solo carril, donde las bandas resultantes son leídas por un sistema de imágenes. (4) Esto produce varios cientos de miles de nucleótidos al día, datos que requieren almacenamiento y análisis computacional posterior.

Imagen de Estevezj


Después de rondas de extensión del ADN molde del cebador unido, los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan por tamaño usando electroforesis en gel. Esta técnica se realizó con frecuencia usando un gel de poliacrilamida-urea desnaturalizante con cada una de las cuatro reacciones desarrolladas en uno de los cuatro carriles individuales (carriles A, T, G, C). Las bandas de ADN se pueden visualizar mediante autorradiografía o luz ultravioleta y la secuencia de ADN se puede leer directamente en la película de rayos X o en la imagen del gel (Figura 5.6).

Figura 5.6. Gel secuenciador tradicional de Sanger. Secuencia visualizada por autorradiografía. Cada carril contiene una única reacción que tiene los cuatro nucleótidos regulares y una pequeña cantidad de uno de los didesoxinucleótidos (ddNTP). Con el tiempo, los ddNTP se incorporarán en cada posición que contenga ese nucleótido específico. El gel se puede leer de abajo hacia arriba, ya que los fragmentos más pequeños (aquellos fragmentos terminados más cerca del cebador en el extremo 5 ') correrán la distancia más lejana en el gel. La secuencia de este fragmento es:

5'-TACGAGATATATGGCGTTAATACGATATATTGGAACTTCTATTGC-3 '

Imagen de John Schmidt


La automatización del método de secuenciación de Sanger fue posible cuando se realizó el cambio de nucleótidos marcados radiactivamente a nucleótidos marcados con fluorescencia. Dentro de los secuenciadores automáticos, la electroforesis capilar en gel se realiza en lugar de separar las muestras usando electroforesis en gel. La salida de la electroforesis capilar son cromatogramas de trazas de picos fluorescentes (Figura 5.7). Los instrumentos de secuenciación de ADN automatizados (secuenciadores de ADN) pueden secuenciar hasta 384 muestras de ADN en un solo lote. Las ejecuciones por lotes pueden ocurrir hasta 24 veces al día, lo que mejora en gran medida la velocidad con la que se pueden secuenciar y analizar las muestras. Los desafíos comunes de la secuenciación de ADN con el método Sanger incluyen la mala calidad en las primeras 15-40 bases de la secuencia debido a la unión del cebador y el deterioro de la calidad de las trazas de secuenciación después de 400-500 bases.

Figura 5.7 Comparación lado a lado de electroforesis en gel y electroforesis capilar. Diagrama de la mano izquierda muestra el autorradiograma tradicional de muestras de secuenciación de Sanger. los Diagrama de la mano derecha muestra las mismas reacciones usando ddNTP marcados con fluorescencia separados por electroforesis capilar. La salida del cromatograma se muestra en el extremo derecho.

Imagen de Abizar


La secuenciación de Sanger es el método que prevaleció desde la década de 1980 hasta ~ 2005. Durante ese período, se lograron grandes avances en la técnica, como el marcaje fluorescente, la electroforesis capilar y la automatización general. Estos desarrollos permitieron una secuenciación mucho más eficiente, lo que condujo a menores costos. El método Sanger, en forma de producción en masa, es la tecnología que produjo el primer genoma humano en 2001, marcando el comienzo de la era de la genómica.

  • Secuenciación Sanger de microfluidos

La secuenciación microfluídica de Sanger es una aplicación de laboratorio en un chip para la secuenciación de ADN, en la que los pasos de secuenciación de Sanger (ciclos térmicos, purificación de muestras y electroforesis capilar) se integran en un chip a escala de oblea utilizando volúmenes de muestra a escala de nanolitros (Figura 5.8). Esta tecnología genera lecturas de secuencia largas y precisas, al tiempo que elimina muchas de las deficiencias significativas del método Sanger convencional (por ejemplo, alto consumo de reactivos costosos, dependencia de equipos costosos, manipulaciones intensivas en personal, etc.) al integrar y automatizar los pasos de secuenciación de Sanger. .

Figura 5.8 Tecnologías Lab-On-A-Chip. Ejemplo de un laboratorio de microfluidos en un dispositivo de chip colocado sobre un plato de poliestireno. Las agujas de acero inoxidable insertadas en el dispositivo sirven como puntos de acceso para los fluidos en pequeños canales dentro del dispositivo, que son aproximadamente del tamaño de un cabello humano.

Imagen de Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST)


  • Secuenciación de próxima generación

La secuenciación de próxima generación (NGS), también conocida como secuenciación de alto rendimiento, es el término general que se utiliza para describir varias tecnologías de secuenciación modernas diferentes. Estas tecnologías permiten la secuenciación de ADN y ARN de manera mucho más rápida y económica que la secuenciación de Sanger utilizada anteriormente y, como tal, revolucionaron el estudio de la genómica y la biología molecular. Dichas tecnologías incluyen:

Secuenciación de Illumina - En NGS, una gran cantidad de lecturas cortas se secuencian de un solo golpe utilizando la tecnología lab-on-a-chip descrita anteriormente. Para hacer esto, la muestra de entrada debe dividirse en secciones cortas. En la secuenciación de Illumina, se utilizan lecturas de 100-150 pb. Los fragmentos algo más largos se ligan a adaptadores genéricos y se recocen en un portaobjetos utilizando los adaptadores. Se lleva a cabo una PCR para amplificar cada lectura, creando un punto con muchas copias de la misma lectura. Luego se separan en ADN monocatenario para secuenciar (Figura 5.9).

Figura 5.9 Procedimiento para la secuenciación de Illumina. (A) El portaobjetos con fragmentos de ADN amplificados por PCR se inunda con nucleótidos y ADN polimerasa. Estos nucleótidos están marcados con fluorescencia y cada color corresponde a una base específica. Las reacciones también tienen un terminador presente, de modo que solo se agrega una base a la vez. (B) Se toma una imagen de la diapositiva. En cada lugar de reacción, habrá una señal fluorescente que indica que se ha agregado una base específica. (C) Los datos se registran y la diapositiva se prepara para el siguiente ciclo. En preparación, se eliminan los terminadores, lo que permitirá agregar la siguiente base, y la señal fluorescente se escinde, evitando que la señal fluorescente contamine la siguiente imagen. El proceso se repite, agregando un nucleótido a la vez (G, A, T o C) y obteniendo imágenes en el medio. Todas las lecturas de la secuencia tendrán la misma longitud ya que se agregan bases individuales en cada ciclo.

Imagen modificada de EMBL-EBI

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Roche 454-Secuenciaciónes similar al proceso de Illumina pero puede secuenciar lecturas mucho más largas. Al igual que Illumina, lo hace secuenciando varias lecturas a la vez mediante la lectura de señales ópticas a medida que se agregan las bases.

Como en Illumina, el ADN o ARN se fragmenta en lecturas más cortas, en este caso hasta 1 kb (1000 pb). Se añaden adaptadores genéricos a los extremos y estos se recogen en perlas, un fragmento de ADN por perla. A continuación, los fragmentos se amplifican mediante PCR utilizando cebadores específicos del adaptador. Luego, cada cuenta se coloca en un solo pozo de un portaobjetos. Por lo tanto, cada pocillo contendrá una sola perla, cubierta con muchas copias de PCR de una sola secuencia. Los pocillos también contienen ADN polimerasa y tampones de secuenciación (Figura 5.10).

5.10 Procedimiento para la secuenciación de Roche 454. (A) Una vez que el producto de PCR se adhiere a la perla, el portaobjetos se inunda con una de las cuatro especies de NTP. Cuando este nucleótido es el siguiente en la secuencia, se agrega a la secuencia leída. Si esa base única se repite, se agregarán más. Entonces, si inundamos con bases de guanina, y el siguiente en la secuencia es G, se agregará un G, sin embargo, si la siguiente parte de la secuencia es GGGG, se agregarán cuatro Gs. (B) La adición de cada nucleótido libera una señal luminosa. Estas ubicaciones de señales se detectan y utilizan para determinar a qué perlas se añaden los nucleótidos. (C) La mezcla de NTP se elimina por lavado. Ahora se agrega la siguiente mezcla de NTP y se repite el proceso, pasando por los cuatro NTP. Todas las lecturas de secuencia de la secuenciación 454 tendrán diferentes longitudes, porque se agregarán diferentes números de bases con cada ciclo.

Imagen modificada por EMBL-EBI


Nuevas tecnologías como la Tecnología Ion Torrenty el Sistema MinION detectar datos de secuencia utilizando señales eléctricas en un chip semiconductor, en lugar de leer ópticamente nucleótidos marcados con colorante. Esto es posible ya que la adición de un dNTP al polímero de ADN provoca la liberación de un H+ ion (Figura 5.11). Como en otros tipos de NGS, el ADN o ARN de entrada está fragmentado, esta vez ~ 200 pb. Se agregan adaptadores y se coloca una molécula en una cuenta. Las moléculas se amplifican en la perla mediante PCR en emulsión. Cada cuenta se coloca en un solo pozo de un portaobjetos.

Figura 5.11 Tecnología de secuenciación Ion Torrent. (A) Similar a la secuenciación 454, el portaobjetos se inunda con una única especie de dNTP, junto con tampones y polimerasa. El pH se controla en cada uno de los pocillos después de la adición del dNTP específico. El pH disminuirá cuando el dNTP se incorpore al polímero provocando la liberación de un protón (H+). Los cambios en el pH nos permiten determinar si esa base y cuántas de ella se agregaron a la secuencia leída. (B) Los dNTP se eliminan por lavado y el proceso se repite ciclando a través de las diferentes especies de dNTP. (C) El cambio de pH, si lo hay, se usa para determinar cuántas bases (si alguna) se agregaron con cada ciclo.

Imagen modificada de EMBL-EBI


Estas tecnologías de iones, que no requieren detección óptica, han permitido la producción de pequeños dispositivos portátiles de secuenciación de ADN que se pueden conectar a la unidad USB de una computadora portátil y utilizar en el campo en condiciones de recolección en tiempo real (Figura 5.12).

Figura 5.12 Dispositivo de secuenciación portátil en tiempo real MinION. El MinION puede producir hasta 30 Gb de datos de secuencia de ADN por muestra

Imagen de Tecnologías Oxford Nanopore


Las cuatro ventajas principales de NGS sobre la secuenciación clásica de Sanger son:

Tamaño de la muestra

NGS es significativamente más barata, más rápida, necesita mucho menos ADN y es más precisa y confiable que la secuenciación de Sanger. Miremos esto más de cerca. Para la secuenciación de Sanger, se necesita una gran cantidad de ADN molde para cada lectura. Se necesitan varias hebras de ADN molde para cada base que se secuencia (es decir, para una secuencia de 100 pb, necesitaría muchos cientos de copias, para una secuencia de 1000 pb, necesitaría muchos miles de copias), ya que una hebra que termina en cada base es necesario para construir una secuencia completa. En NGS, se puede obtener una secuencia de una sola hebra. En ambos tipos de secuenciación, se toman múltiples copias escalonadas para la construcción de contig y validación de secuencia.

Velocidad

NGS es más rápido que la secuenciación de Sanger de dos formas. En primer lugar, la reacción química puede combinarse con la detección de señales en algunas versiones de NGS, mientras que en la secuenciación de Sanger estos son dos procesos separados. En segundo lugar, y de manera más significativa, solo se puede tomar una lectura (máximo ~ 1 kb) a la vez en la secuenciación de Sanger, mientras que NGS es enormemente paralelo, lo que permite leer 300 Gb de ADN en una sola ejecución en un solo chip.

Costo

La reducción de tiempo, mano de obra y reactivos en NGS significa que los costos son mucho más bajos. La primera secuencia del genoma humano costó en la región de $ 2.7 mil millones en 2003. Usando métodos modernos de secuenciación de Sanger, con la ayuda de datos de la secuencia conocida, un genoma humano completo todavía costaba $ 300,000 en 2006. Secuenciar un genoma humano con NGS hoy cuesta aproximadamente $ 1,000.

Precisión

Las repeticiones son intrínsecas a NGS, ya que cada lectura se amplifica antes de la secuenciación y debido a que se basa en muchas lecturas cortas superpuestas, por lo que cada sección de ADN o ARN se secuencia varias veces. Además, debido a que es mucho más rápido y económico, es posible hacer más repeticiones que con la secuenciación de Sanger. Más repeticiones significa una mayor cobertura, lo que conduce a una secuencia más precisa y confiable, incluso si las lecturas individuales son menos precisas para NGS.

La secuenciación de Sanger se puede utilizar para obtener lecturas de secuencia mucho más largas. Sin embargo, la naturaleza paralela de NGS significa que se pueden construir lecturas más largas a partir de muchas lecturas cortas contiguas.

Técnicas de síntesis de ADN

Síntesis de ADN es la creación natural o artificial de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN). El término síntesis de ADN puede referirse a Replicación de ADN (que se tratará con más detalle en el Capítulo XX), reacción en cadena de la polimerasa (PCR)o síntesis de genes (creando físicamente secuencias de genes artificiales).

  • Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se refiere a una técnica ampliamente empleada en las ciencias básicas y biomédicas. La PCR es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar segmentos específicos de ADN para una amplia gama de aplicaciones clínicas y / o de laboratorio. Sobre la base del trabajo de la exitosa amplificación del ADN de Panet y Khorana in vitro, Kary Mullis y sus colaboradores desarrollaron la PCR a principios de la década de 1980, después de haber obtenido un premio Nobel solo una década después. Al permitir una amplificación de más de mil millones de veces de regiones objetivo específicas, se ha convertido en un instrumento en muchas aplicaciones, incluida la clonación de genes, el diagnóstico de enfermedades infecciosas y la detección de anomalías genéticas deletéreas en bebés prenatales.

Fundamentos

Los componentes principales de la PCR son una plantilla, cebadores, bases de nucleótidos libres y la enzima ADN polimerasa. los Plantilla de ADNcontiene la región específica que desea amplificar, como el ADN extraído de un mechón de cabello, por ejemplo. Imprimaciones, u oligonucleótidos, son hebras cortas de ADN monocatenario complementarias al extremo 3 'de cada región diana. Se requieren tanto un cebador directo como uno inverso, uno para cada hebra complementaria de ADN. ADN polimerasa es la enzima que realiza la replicación del ADN. Los análogos termoestables de la ADN polimerasa I, como la polimerasa Taq, que se encontró originalmente en una bacteria que crece en aguas termales, es una elección común debido a su resistencia a los ciclos de calentamiento y enfriamiento necesarios para la PCR.

La PCR aprovecha el apareamiento de bases complementarias, la naturaleza bicatenaria y la temperatura de fusión de las moléculas de ADN. Este proceso implica un ciclo a través de 3 rondas secuenciales de reacciones dependientes de la temperatura: fusión del ADN (desnaturalización), hibridación y replicación del ADN impulsada por enzimas (elongación). Desnaturalizacióncomienza calentando la reacción a aproximadamente 95oC, interrumpiendo los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras de ADN molde. A continuación, la reacción se reduce a alrededor de 50 a 65oC, dependiendo de las variables fisicoquímicas de los cebadores, lo que permite recocidode pares de bases complementarios. Los cebadores, que se añaden a la solución en exceso, se unen al comienzo del extremo 3 'de cada hebra molde y previenen la re-hibridación de la hebra molde consigo misma. Por último, la replicación del ADN impulsada por enzimas, o alargamiento, comienza ajustando la temperatura de reacción a la cantidad que optimiza la actividad de la ADN polimerasa, que es de alrededor de 75 a 80ºC.oC. En este punto, la ADN polimerasa, que necesita ADN de doble hebra para comenzar la replicación, sintetiza una nueva hebra de ADN ensamblando nucleótidos libres en solución en la dirección 3 'a 5' para producir 2 conjuntos completos de hebras complementarias. El ADN recién sintetizado ahora es idéntico a la hebra molde y se usará como tal en los ciclos de PCR progresiva (Video 5.1).

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Video por Mousa Ghannam

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Dado que las cadenas de ADN sintetizadas previamente sirven como plantillas, la amplificación de ADN mediante PCR aumenta a una tasa exponencial, donde las copias de ADN se duplican al final de cada paso de replicación. La replicación exponencial del ADN diana finalmente se estabiliza alrededor de 30 a 40 ciclos debido principalmente a la limitación del reactivo, pero también puede deberse a los inhibidores de la reacción de la polimerasa que se encuentran en la muestra, el autoanillado del producto acumulado y la acumulación de moléculas de pirofosfato.

PCR en tiempo real

En su advenimiento, la tecnología de la PCR se limitó al análisis cualitativo o semicuantitativo debido a limitaciones en la capacidad de cuantificar ácidos nucleicos. En ese momento, para verificar si el gen diana se amplificó con éxito, el producto de ADN se separó por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. El bromuro de etidio, una molécula que emite fluorescencia cuando se une a dsDNA, podría dar una estimación aproximada de la cantidad de ADN comparando aproximadamente el brillo de las bandas separadas, pero no era lo suficientemente sensible para un análisis cuantitativo riguroso.

Las mejoras en el desarrollo y la instrumentación de fluoróforos llevaron a termocicladores que ya no requerían la medición de solo el ADN del producto final. Este proceso, conocido como PCR en tiempo real,o PCR cuantitativa (qPCR), ha permitido la detección de dsDNA durante la amplificación. Los termocicladores qPCR están equipados con la capacidad de excitar fluoróforos en longitudes de onda específicas, detectar su emisión con un fotodetector y registrar los valores. La colección sensible de valores numéricos durante la amplificación ha mejorado considerablemente el poder analítico cuantitativo.

Hay dos tipos principales de fluoróforos utilizados en qPCR: los que se unen específicamente a una secuencia diana determinada y los que no. La sensibilidad de los fluoróforos ha sido un aspecto importante del desarrollo de qPCR. Uno de los marcadores inespecíficos más efectivos y ampliamente utilizados, SYBR Green, después de unirse al surco menor del dsDNA, exhibe un aumento de 1000 veces en la fluorescencia en comparación con estar libre en solución (Video 5.1). Sin embargo, si se desea incluso más especificidad, se puede añadir un oligonucleótido específico de secuencia, o sonda de hibridación, que se une al gen diana en algún punto delante del cebador (después del extremo 3 '). Estas sondas de hibridación contienen una molécula informadora en el extremo 5 'y una molécula extintora en el extremo 3'. La molécula inhibidora inhibe eficazmente al informador de la fluorescencia mientras la sonda está intacta. Sin embargo, al entrar en contacto con la ADN polimerasa I, la sonda de hibridación se escinde, lo que permite la fluorescencia del tinte (Video 5.1).

PCR de transcripción inversa

Desde su advenimiento, la tecnología de PCR se ha expandido creativamente y PCR de transcripción inversa (RT-PCR) es uno de los avances más importantes. La PCR en tiempo real se confunde con frecuencia con la PCR de transcripción inversa, pero son técnicas independientes. En la RT-PCR, el ADN amplificado se deriva del ARNm mediante el uso de enzimas de transcriptasa inversa para producir una copia de ADNc del gen. Usando secuencias de cebadores para genes de interés, se pueden usar métodos de PCR tradicionales con el ADNc para estudiar la expresión de genes de manera cualitativa. Actualmente, la PCR de transcripción inversa se usa comúnmente con la PCR en tiempo real, lo que permite medir cuantitativamente el cambio relativo en la expresión génica en diferentes muestras.

Cuestiones de interés

Una desventaja de la tecnología de PCR es que es extremadamente sensible. Las trazas de contaminación de ARN o ADN en la muestra pueden producir resultados extremadamente engañosos. Otra desventaja es que los cebadores diseñados para PCR requieren datos de secuencia y, por lo tanto, solo se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de un patógeno o gen conocido. Otra limitación es que a veces los cebadores utilizados para la PCR pueden aparearse de forma no específica con secuencias que son similares, pero no idénticas, al gen diana.

Otro problema potencial del uso de PCR es la posibilidad de formación de dímeros de cebadores (PD). La PD es un subproducto potencial y consiste en moléculas de cebadores que se han hibridado entre sí debido a las cadenas de bases complementarias en los cebadores. La ADN polimerasa amplifica la PD, lo que conduce a la competencia por reactivos de PCR que podrían usarse para amplificar las secuencias diana.

Significación clínica

La amplificación por PCR es una herramienta indispensable con diversas aplicaciones dentro de la medicina. A menudo, se usa para probar la presencia de alelos específicos, como en el caso de los padres potenciales que examinan la presencia de portadores genéticos, pero también se puede usar para diagnosticar la presencia de una enfermedad directamente y para detectar mutaciones en el embrión en desarrollo. Por ejemplo, la primera vez que se utilizó la PCR de esta forma fue para el diagnóstico de anemia de células falciformes mediante la detección de una única mutación genética.

Además, la PCR ha revolucionado enormemente el potencial de diagnóstico de enfermedades infecciosas, ya que se puede utilizar para determinar rápidamente la identidad de microbios que tradicionalmente no se podían cultivar o que requerían semanas para crecer. Los patógenos que se detectan habitualmente mediante PCR incluyen Mycobacterium tuberculosis, virus de inmunodeficiencia humana, virus del herpes simple, sífilis e innumerables otros patógenos. Además, la qPCR no solo se utiliza para probar la presencia cualitativa de microbios, sino también para cuantificar las cargas bacterianas, fúngicas y virales.

La sensibilidad de las herramientas de diagnóstico para mutaciones a oncogenes y genes de supresión de tumores se ha mejorado al menos 10.000 veces gracias a la PCR, lo que permite un diagnóstico más temprano de cánceres como la leucemia. La PCR también ha permitido terapias más matizadas e individualizadas para pacientes con cáncer. Además, la PCR se puede utilizar para la tipificación de tejidos que es vital para la implantación de órganos e incluso se ha propuesto como un reemplazo de las pruebas basadas en anticuerpos para el tipo de sangre. La PCR también tiene aplicaciones clínicas en el campo de las pruebas prenatales para diversas enfermedades genéticas y / o patologías clínicas. Las muestras se obtienen mediante amniocentesis o muestreo de vellosidades coriónicas.

En la medicina forense, se amplifican fragmentos cortos de ADN repetido altamente polimórfico, repeticiones cortas en tándem (STR), y se utilizan para comparar variaciones específicas dentro de los genes para diferenciar a los individuos. [9] Los cebadores específicos para los loci de estos STR se utilizan y amplifican mediante PCR. Varios loci contienen STR en el genoma humano, y el poder estadístico de esta técnica se mejora al verificar múltiples sitios.

Síntesis de genes artificiales, a veces conocido como Impresión de ADN es un método de biología sintética que se utiliza para crear genes artificiales en el laboratorio. Basado en la síntesis de ADN en fase sólida, se diferencia de la clonación molecular y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en que no tiene que comenzar con secuencias de ADN preexistentes.Por lo tanto, es posible hacer una molécula de ADN de doble hebra completamente sintética sin límites aparentes ni en la secuencia ni en el tamaño de nucleótidos.

El método se ha utilizado para generar cromosomas funcionales bacterianos o de levadura que contienen aproximadamente un millón de pares de bases. La creación de nuevos pares de nucleobase además de los dos pares de bases en la naturaleza podría expandir enormemente el código genético.

La síntesis del primer gen completo, un ARNt de levadura, fue demostrada por Har Gobind Khorana y colaboradores en 1972. La síntesis de los primeros genes codificadores de péptidos y proteínas se realizó en los laboratorios de Herbert Boyer y Alexander Markham, respectivamente.

Los servicios comerciales de síntesis de genes ya están disponibles. Los enfoques se basan en la mayoría de los casos en una combinación de técnicas de química orgánica y biología molecular y pueden sintetizarse genes completos "de novo", sin la necesidad de un ADN molde. La síntesis de genes es una herramienta importante en muchos campos de la tecnología del ADN recombinante, incluida la expresión de genes heterólogos, el desarrollo de vacunas, la terapia génica y la ingeniería molecular. La síntesis de secuencias de ácido nucleico puede ser más económica que los procedimientos clásicos de clonación y mutagénesis. También es una herramienta de ingeniería poderosa y flexible para crear y diseñar nuevas secuencias de ADN y funciones de proteínas.

Optimización de genes

Si bien la capacidad de producir tramos de ADN cada vez más largos de manera eficiente y a precios más bajos es un motor tecnológico de este campo, cada vez se presta más atención a mejorar el diseño de genes para fines específicos. Al principio de la era de la secuenciación del genoma, la síntesis de genes se utilizó como una fuente (cara) de ADNc que se predijo mediante información de ADNc genómico o parcial, pero que era difícil de clonar. A medida que se dispone de fuentes de ADNc clonado de secuencia verificada de mayor calidad, esta práctica se ha vuelto menos urgente.

Producir grandes cantidades de proteína a partir de secuencias de genes (o al menos las regiones codificantes de proteínas de los genes, el marco de lectura abierto) que se encuentra en la naturaleza a veces puede resultar difícil y es un problema de suficiente impacto para que se hayan dedicado conferencias científicas al tema. Muchas de las proteínas más interesantes buscadas por los biólogos moleculares normalmente están reguladas para expresarse en cantidades muy bajas en células de tipo salvaje. El rediseño de estos genes ofrece un medio para mejorar la expresión génica en muchos casos. Es posible reescribir el marco de lectura abierto debido a la degeneración del código genético. Por tanto, es posible cambiar hasta aproximadamente un tercio de los nucleótidos en un marco de lectura abierto y seguir produciendo la misma proteína. El número disponible de diseños alternativos posibles para una proteína dada es astronómico. Para una secuencia de proteína típica de 300 aminoácidos hay más de 10150 combinaciones de codones que codificarán una proteína idéntica. La optimización de codones, o la sustitución de codones poco utilizados por codones más comunes, a veces tiene efectos dramáticos. También se pueden incluir optimizaciones adicionales, como la eliminación de estructuras secundarias de ARN. Al menos en el caso de E. coli, la expresión de proteínas se maximiza utilizando predominantemente codones correspondientes al ARNt que retienen la carga de aminoácidos durante la inanición. Los programas de computadora escritos para realizar estas y otras optimizaciones simultáneas se utilizan para manejar la enorme complejidad de la tarea. Un gen bien optimizado puede mejorar la expresión de proteínas de 2 a 10 veces y, en algunos casos, se han informado mejoras de más de 100 veces. Debido a la gran cantidad de cambios de nucleótidos realizados en la secuencia de ADN original, la única forma práctica de crear los genes de nuevo diseño es utilizar la síntesis de genes.

Síntesis de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando componentes básicos llamados fosforamiditas de nucleósidos. Estos pueden ser nucleósidos normales o modificados que tienen grupos protectores para evitar que sus aminas, grupos hidroxilo y grupos fosfato interactúen incorrectamente. Se agrega una fosforamidita a la vez, se desprotege el grupo hidroxilo 5 'y se agrega una nueva base y así sucesivamente. La cadena crece en la dirección de 3 'a 5', que es hacia atrás en relación con la biosíntesis de ADN. en vivo. Al final, se eliminan todos los grupos protectores.

Figura 5.13 Ciclo de síntesis de oligodesoxinucleótidos de fosforamidita de cuatro pasos. El método de la fosforamidita, iniciado por Marvin Caruthers a principios de la década de 1980 y mejorado por la aplicación de la tecnología de fase sólida y la automatización, está ahora firmemente establecido como el método de elección. La síntesis de oligonucleótidos de fosforamidita avanza en la dirección 3 a 5 (opuesta a la dirección 5 a 3 de la biosíntesis del ADN en la replicación del ADN). Se agrega un nucleótido por ciclo de síntesis. El ciclo de síntesis de ADN de fosforamidita consta de una serie de pasos que se describen en la figura

Imagen de Ni, S., et al (2017) Revista Internacional de Ciencias Moleculares 18 (8): 1683


Sin embargo, al tratarse de un proceso químico, se producen varias interacciones incorrectas que dan lugar a algunos productos defectuosos. Cuanto más larga sea la secuencia de oligonucleótidos que se está sintetizando, más defectos habrá, por lo que este proceso solo es práctico para producir secuencias cortas de nucleótidos. El límite práctico actual es de aproximadamente 200 pb (pares de bases) para un oligonucleótido con calidad suficiente para usarse directamente para una aplicación biológica. Se puede utilizar HPLC para aislar productos con la secuencia adecuada. Mientras tanto, se puede sintetizar una gran cantidad de oligos en paralelo en chips genéticos. Para un rendimiento óptimo en los procedimientos posteriores de síntesis de genes, deben prepararse individualmente y en escalas más grandes.

  • Síntesis de ADN y biología sintética.

La importante caída en el costo de la síntesis de genes en los últimos años debido a la creciente competencia de las empresas que brindan este servicio ha llevado a la capacidad de producir plásmidos bacterianos completos que nunca han existido en la naturaleza. El campo de la biología sintética utiliza la tecnología para producir circuitos biológicos sintéticos, que son tramos de ADN manipulados para cambiar la expresión génica dentro de las células y hacer que la célula produzca un producto deseado.

La capacidad de producir ADN sintéticamente permitirá el desarrollo de productos medioambientales, médicos y comercialmente relevantes. Por ejemplo, en 2015, Novartis, en colaboración con Synthetic Genomics Vaccines inc. y la Autoridad de Desarrollo e Investigación Biomédica Avanzada de EE. UU., anunciaron que habían creado efectivamente una vacuna contra la influenza de ADN sintético. Las nuevas vacunas de ADN sintético prometen ofrecer una alternativa a las actuales vacunas convencionales producidas en huevos que pueden verse afectadas por una baja eficacia.

Las vacunas de ADN pueden evitar muchos problemas asociados con la producción de vacunas a base de huevo al generar proteínas virales dentro de las células huésped. Para crear una vacuna de ADN, se clona un gen que codifica un antígeno en un plásmido de expresión no replicativo, que se administra al huésped mediante las rutas de vacunación tradicionales. Las células hospedadoras que captan el plásmido expresan el antígeno de la vacuna que puede presentarse a las células inmunitarias a través de las vías del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La activación de las células T auxiliares CD4 + después de la presentación del MHC de clase II de la proteína de la vacuna de ADN secretada es fundamental para la producción de anticuerpos específicos de antígeno (Figura 5.14).

Figura 5.14 Creación de una vacuna de ADN. Un gen antigénico se sintetiza y se clona en un vector plasmídico. (Los pasos relacionados con el proceso de clonación se describen con más detalle en la sección 5.3). La vacuna de ADN se entrega al huésped, donde se expresará para producir y presentar antígeno al sistema inmunológico del huésped.

Figura de Lee, L.Y.Y., Izzard, L. y Hurt, A.C. (2018) Frontiers in Immunology, doi: 10.3389 / fimmu.2018.01568

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Después de dos décadas de investigación, la tecnología de las vacunas de ADN está ganando madurez; actualmente, varias vacunas de ADN veterinarias están autorizadas para el virus del Nilo Occidental y el melanoma y, significativamente, la primera vacuna comercial de ADN contra el H5N1 en pollos ha sido aprobada condicionalmente recientemente por el USDA. Además, los grandes ensayos con animales en curso de vacunas de ADN contra otras enfermedades como el VIH, la hepatitis y el virus del Zika ofrecen información valiosa que se puede aplicar al diseño de vacunas de ADN contra la influenza. Han surgido enfoques prometedores a partir de los numerosos estudios que evalúan diferentes formulaciones de vacunas de ADN y sistemas de administración, pero aún no ha surgido una estrategia que genere protección contra la influenza de manera consistente en modelos animales grandes. La entrega exitosa de plásmidos y el uso de adyuvantes apropiados siguen siendo desafíos clave que deben abordarse antes de que las vacunas de ADN contra la influenza sean efectivas para uso humano.


Cómo crear bibliotecas de genes (con diagrama)

La colección de fragmentos de ADN (específicamente genes) de una especie particular representa bibliotecas de genes.

La creación o construcción de bibliotecas de genes (en general bibliotecas genómicas) se logra mediante el aislamiento del genoma completo (ADN completo de una célula) que se corta en fragmentos y se clona en vectores adecuados.

Luego, el clon específico que lleva el ADN deseado (diana) puede identificarse, aislarse y caracterizarse. De esta manera, se puede construir una biblioteca de genes o clones (apropiadamente considerada como banco de genes) para el genoma completo de una especie. Los tamaños de los genomas en diferentes especies son variables (Tabla 9.1). Una biblioteca genética completa para cada organismo contiene todo el ADN genómico.

Los biotecnólogos están particularmente interesados ​​en el aislamiento de genes (y por lo tanto en la creación de bibliotecas de genes) que codifican proteínas. Existe una clara diferencia en los genes de las células procariotas y eucariotas. En los organismos procariotas, los genes estructurales que codifican proteínas son continuos. Sin embargo, en el caso de eucariotas, las regiones codificantes (exones) de los genes estructurales están separadas por regiones no codificantes (intrones). Por esta razón, la construcción de bibliotecas de genes para eucariotas es más complicada.

Crear una biblioteca de genes:

El ADN del organismo fuente se digiere mediante endonucleasa de restricción (por ejemplo, EcoRI), para dar como resultado fragmentos. Es deseable crear condiciones para que se produzca una digestión parcial y no una digestión completa. De esta manera, se pueden producir todos los posibles fragmentos de ADN de tamaño variable. La digestión parcial de un ADN con una endonucleasa de restricción se muestra en la figura 9.1.

Las escisiones ocurren en diferentes sitios para dar como resultado fragmentos de ADN de diferentes longitudes, algunos de ellos pueden ser grandes mientras que otros son pequeños. En la práctica, se utiliza una combinación de enzimas de restricción para digerir el ADN de origen y liberar una gran cantidad de fragmentos de ADN. Los fragmentos deseados se pueden aislar y clonar.

Algunos trabajadores utilizan el término experimento de escopeta (o enfoque de escopeta) para la creación de clones aleatorios (sin identificarlos necesariamente a todos) a partir de un ADN genómico. En el enfoque de escopeta, el ADN se somete a una escisión aleatoria mediante endonucleasas de restricción.

Técnica de Maniatis para crear una biblioteca genética:

En la técnica desarrollada por Maniatis et al (1978), se utilizan dos endonucleasas de restricción para cortar el ADN diana. La digestión parcial permite la formación de la mayoría de los fragmentos de ADN con una longitud de 10-30 kb. Los fragmentos se superponen con frecuencia y pueden fraccionarse mediante electroforesis en gel. Los fragmentos aislados (de aproximadamente 20 kb de tamaño) se insertan en el vector de fago λ y se clonan.

Establecimiento de una biblioteca genética para humanos:

El ADN celular humano (el genoma completo) puede someterse a digestión mediante endonucleasas de restricción (por ejemplo, EcoRI). Los fragmentos formados en promedio tienen un tamaño de aproximadamente 4 kb (es decir, 4000 bases de nitrógeno y # 8217s). Cada cromosoma humano, que contiene aproximadamente 100.000 kb, se puede cortar en unos 25.000 fragmentos de ADN. Como los seres humanos tienen 23 cromosomas diferentes (24 en el hombre), se han formado un total de 575.000 fragmentos de 4 kb de longitud. Entre estos 575.000 fragmentos de ADN se encuentra el ADN o gen de interés (por ejemplo, el gen de la insulina).

Ahora es la selección de un vector y el proceso de clonación. La E. coli, una bacteria inofensiva para los seres humanos, es la más utilizada. Se aíslan los plásmidos de E. coli. Son digeridos por la misma enzima de restricción que se usó para cortar el genoma humano para formar plásmidos abiertos. Los fragmentos de ADN cromosómico humano y los plásmidos abiertos se unen para producir plásmidos recombinados.

Estos plásmidos contienen diferentes fragmentos de ADN de humanos. Los plásmidos recombinados se insertan en E. coli y las células se multiplican (fig. 9.2). Las células de E. coli poseen todo el ADN humano en fragmentos. Sin embargo, debe recordarse que cada célula de E. coli contiene diferentes fragmentos de ADN. Todas las células de E. coli juntas representan una biblioteca genómica (que contiene aproximadamente 575.000 fragmentos de ADN).

Otros vectores para la creación de bibliotecas genómicas:

En lugar de fagos y plásmidos, se utilizan otros vectores para la construcción de bibliotecas de ADN de gran tamaño. Estos incluyen cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Estos se consideran vectores de alta capacidad. Aunque son ideales para la construcción de bibliotecas de genes, existen muchas dificultades prácticas asociadas con su uso.

PCR como alternativa a la construcción de bibliotecas genómicas:

La PCR es una técnica para la amplificación de una secuencia de ADN específica. La PCR con cebadores se puede utilizar para aislar el ADN diana directamente del genoma. Por tanto, la PCR sirve como una alternativa a la construcción de la biblioteca de ADN (biblioteca de genes) mediante clonación. Esto no siempre es posible, ya que la técnica de PCR se puede emplear para la amplificación de ADN de longitud corta (generalmente 1-2 kb con un máximo de 5 kb). Además, la alta temperatura utilizada en la PCR a veces daña las bases y genera cortes en las cadenas de ADN.

Con algunas modificaciones en la PCR, ahora es posible amplificar fragmentos de ADN hasta una longitud de 22 kb a partir del ADN genómico humano. Esto se logra mediante el uso de una combinación de dos enzimas ADN polimerasa, además de reducir la temperatura de reacción. Una de las ADN polimerasas tiene actividad de corrección de pruebas para eliminar las bases que no coinciden.

De hecho, algunas empresas comerciales ofrecen cócteles de enzimas ideales para PCR larga, por ejemplo, el sistema TaqPlus Long PCR comercializado por Strata gene. Contiene polimerasa Taq y la enzima correctora termoestable Pfee polimerasa.

La PCR larga se ha aplicado para el análisis estructurado de genes humanos y genomas del VIH. Es poco probable que la PCR larga reemplace la construcción de bibliotecas genómicas. Esto se debe a que la creación de bibliotecas de ADN es permanente, mientras que la PCR larga es temporal. Además, la PCR se puede emplear para amplificar fragmentos de ADN seleccionados (de interés) de bibliotecas genómicas.

Bibliotecas de fragmentos:

Los biotecnólogos a menudo se encuentran con cantidades diminutas de materiales de partida, por ejemplo, células individuales, tejidos fijos, fósiles, etc. Es bastante difícil aplicar la técnica tradicional para la construcción de bibliotecas genómicas a partir de tales muestras. La PCR es ideal para el aislamiento y la amplificación de genes de muestras muy pequeñas. Por tanto, la PCR se puede utilizar para la creación de bibliotecas de fragmentos genómicos aleatorios.

Bibliotecas de ADN complementarias:

La clonación de genes eucariotas es bastante complicada y requiere técnicas especiales. Esto se debe principalmente a las secuencias no codificantes (intrones) en el ADN. En la célula eucariota, a medida que se transcribe el gen, el ARN sufre varios cambios en el núcleo (denominados empalme) para liberar un ARNm maduro y funcional en el citoplasma.

De esta manera, se eliminan los intrones. En algunos genes, los intrones forman la mayor parte del gen. Por ejemplo, en el gen de la distrofina humana, hasta el 99% de la secuencia de ADN está compuesta por intrones. ¡Hay hasta 79 intrones!

Los procariotas, particularmente las bacterias, no poseen la capacidad de eliminar los intrones. Por tanto, el ARNm funcional no se forma correctamente en una célula procariota para un gen eucariota. Por tanto, la clonación de genes eucariotas se convierte en una tarea difícil.

Síntesis de ADN complementario:

El ADN complementario (ADNc) es un complemento bicatenario de un ARNm. El ADNc se puede sintetizar a partir del ARNm mediante transcripción inversa. Un ARNm funcional eucariota que no tiene intrones posee un casquete G en 5 & # 8242 y una cola poli (A) en el extremo 3 & # 8242 (aproximadamente 200 residuos de adenina).

El ARNm requerido se aísla y se purifica (particularmente de células que son ricas en ARNm específico, por ejemplo, células pancreáticas para ARNm de insulina). Se agrega un cebador oligo-dT para unirse al segmento corto de la región de la cola de poli A (por hibridación). Este cebador proporciona un grupo 3 & # 8242-hidroxilo para la síntesis de una hebra de ADN.

Con la adición de la enzima transcriptasa inversa y cuatro desoxinucleótidos (dATP, dTTP, dGTP y dCTP), procede la síntesis de ADN. Para las bases A, G, C y U en la plantilla (ARNm), las bases complementarias correspondientes en el ADN, respectivamente, son T, C, G y A. La primera cadena de ADN recién sintetizada tiene una tendencia a doblarse sobre sí misma durante un pocos nucleótidos para formar un bucle de horquilla (Fig. 9.3).

El bucle de la primera hebra de ADN sirve como molde para la síntesis de la segunda hebra de ADN. Mediante la adición de la ADN polimerasa de E. coli (fragmento de Klenow), se produce la síntesis de la segunda hebra de ADN comenzando desde el final del bucle de horquilla. En el tratamiento con la enzima RNasa H, las moléculas de ARNm se degradan. La enzima SI nucleasa escinde, los bucles en horquilla y degrada las extensiones de ADN monocatenario. Los productos finales son copias de ADN complementarias del ARNm original, algunos de ellos están completos mientras que otros están incompletos.

Limitación de la técnica:

La principal desventaja del método de horquilla es la pérdida de una pequeña secuencia en el extremo 5 & # 8242 del ADNc debido a la escisión por la nucleasa SI.

Método mejorado para la síntesis de ADNc:

Para superar la limitación descrita anteriormente, se han realizado algunas mejoras en la síntesis de ADNc. Una de estas técnicas mejoradas se muestra en la figura 9.4.

A medida que se sintetiza la primera hebra de ADNc, se acumula con residuos de citidina con la ayuda de la enzima transferasa terminal. La cadena de ARNm se hidroliza con álcali y se recupera el ADNc de longitud completa. A continuación, se hibrida un cebador de oligo-dG sintético con oligo-dC. Esto, a su vez, permite la síntesis de la segunda cadena de ADNc. Mediante esta técnica mejorada, se obtiene una longitud completa de ADNc correspondiente al ARNm (a su vez, el gen). Pero la eficiencia de este método es comparativamente menor.

Construcción de bibliotecas de ADNc:

Las moléculas de ADN complementarias se pueden clonar en un vector de clonación (por ejemplo, plásmido), para crear bibliotecas de ADNc. La inserción de ADNc en el vector debe tener la orientación correcta. Esto se logra mediante la adición de un enlazador sintético al ADNc bicatenario. En una técnica desarrollada por Okayama y Berg (1982), el ARNm se une primero al vector de clonación del plásmido y luego se lleva a cabo la síntesis de ADNc.

RT-PCR como alternativa a la clonación de cDNA:

La transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR) puede amplificar el ARNm para dar ADNc. La RT-PCR es muy rápida, por lo que se pueden obtener moléculas de ADNc en un período corto. Además, incluso los ARNm de longitud larga pueden usarse convenientemente en RT-PCR. También hay algunas desventajas en RT-PCR.La ADN polimerasa utilizada en RT-PCR es propensa a errores, e incluso una contaminación muy mínima del ARNm (con otros ARNm) dará resultados falsos.

Estrategias de detección:

Una vez que se crea una biblioteca de ADN o una biblioteca de ADNc, los clones (es decir, las líneas celulares) deben analizarse para identificar clones específicos. Las técnicas de cribado se basan principalmente en la secuencia del clon o en la estructura / función de su producto.

Cribado por hibridación de ADN:

La secuencia diana en un ADN se puede determinar con una sonda de ADN (Fig. 9.5). Para empezar, el ADN de doble hebra de interés se convierte en hebras simples mediante calor o álcali (desnaturalización). Las dos hebras de ADN se mantienen separadas uniéndose a una matriz sólida como la nitrocelulosa o la membrana de nailon.

Ahora, se añaden las hebras simples de sonda de ADN (100-1.000 pb) marcadas con radioisótopo. La hibridación (es decir, el apareamiento de bases) se produce entre las secuencias de nucleótidos complementarias del ADN diana y la sonda. Para un emparejamiento de bases estable, al menos el 80% de las bases en las dos cadenas (el ADN diana y la sonda) deben coincidir. El ADN hibridado puede detectarse mediante autorradiografía.

Sondas de ADN:

Las sondas de ADN utilizadas con fines de detección se pueden sintetizar de muchas formas.

Método de imprimación aleatoria:

Con esta técnica se pueden producir cebadores de ADN marcados con radioisótopos (fig. 9.6). Se desnaturaliza el ADN de doble hebra que contiene la secuencia necesaria para servir como sonda. Una mezcla de oligonucleótidos sintéticos, con todas las posibles combinaciones de bases (A, G, C y T), con una longitud de 6 nucleótidos cada una, sirven como cebadores. Algunos de estos cebadores con secuencias complementarias se hibridarán con el ADN molde. Esta ocurrencia es completamente casual y la probabilidad es razonablemente buena.

Mediante la adición de cuatro desoxirribonucleótidos (uno de ellos está radiomarcado) y en presencia de la enzima ADN polimerasa de E. coli (fragmento de Klenow), los cebadores se extienden sobre el ADN molde. Dado que se usa un marcador radiactivo, los fragmentos de ADN recién sintetizados se etiquetan en los lugares apropiados, y estos son las sondas de ADN. Se pueden producir varias sondas de ADN marcadas a partir de una plantilla de ADN sin marcar.

Sondas de ADN no isotópicas:

Para la producción de sondas de ADN no isotópicas, uno de los cuatro desoxinucleótidos (usados ​​para la extensión del cebador descrita anteriormente) se etiqueta con un marcador (por ejemplo, biotina). El marcador de las sondas de ADN se puede detectar mediante el uso de reacciones químicas y enzimáticas.

Detección por hibridación de colonias:

La secuencia de ADN en las colonias transformadas se puede detectar mediante hibridación con sondas de ADN radiactivo (a veces también se pueden usar sondas de ARN marcadas). Algunos autores también se refieren a la técnica de hibridación de colonias como placas de réplica. La técnica que se muestra en la figura 9.7 se describe brevemente.

Las células transformadas se cultivan como colonias en una placa maestra. Las muestras de cada colonia se transfieren a una matriz sólida como una membrana de nitrocelulosa o nailon. La transferencia se lleva a cabo con cuidado para retener el patrón de las colonias en la placa maestra. Por tanto, el papel de nitrocelulosa contiene un patrón de fotocopia de las colonias de la placa maestra. Las células de la colonia se lisan y desproteinizan.

El ADN está desnaturalizado y unido irreversiblemente a la matriz. Ahora se agrega una sonda de ADN radiomarcada que se hibrida con el ADN diana complementario. Las moléculas de sonda no hibridadas se eliminan por lavado. La colonia con la sonda hibridada se puede identificar en la autorradiografía. Las células de esta colonia (de la placa maestra) se pueden aislar y cultivar.

Muchas veces se detectan múltiples colonias en la hibridación mediante una sonda de ADN. Esto se debe a secuencias superpuestas. Para identificar qué colonia tiene la secuencia completa del gen diana, serán útiles los datos observados del análisis de endonucleasas de restricción.

Modificaciones de la técnica de hibridación de colonias:

En los últimos años se han realizado varias mejoras en la técnica de hibridación de colonias, descrita anteriormente. En la técnica de levantamiento de placa, el papel de nitrocelulosa se aplica directamente sobre la superficie superior de la placa de agar maestra haciendo un contacto directo. De esta manera, se pueden levantar las placas y se pueden realizar varias impresiones de ADN idénticas a partir de una sola placa. Esta técnica aumenta la confiabilidad. Más recientemente, el cribado de bibliotecas de ADN se lleva a cabo mediante técnicas automatizadas.

Cribado por PCR:

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es tan buena como una técnica de hibridación para la detección de bibliotecas de ADN. Pero se debe disponer de información adecuada (sobre las secuencias de franqueo del ADN diana) para preparar cebadores para este método. Las colonias se mantienen en placas de paredes múltiples, cada pocillo se criba mediante PCR y se identifican los pocillos positivos.

Cribado por ensayo inmunológico:

Pueden usarse técnicas inmunológicas para la detección de una proteína o un polipéptido, sintetizados por un gen (mediante transcripción seguida de traducción). El procedimiento adoptado para el ensayo inmunológico y la técnica de hibridación (ya descritos) son bastante comparables. El procedimiento de cribado mediante ensayo inmunológico se muestra en la figura 9.8 y se describe brevemente a continuación.

Las células se cultivan como colonias en placas maestras que se transfieren a una matriz sólida (es decir, nitrocelulosa). A continuación, las colonias se someten a lisis y las proteínas liberadas se unen a la matriz. Luego, estas proteínas se tratan con un anticuerpo primario que se une específicamente a la proteína (actúa como un antígeno), codificado por el ADN diana. Después de eliminar el anticuerpo no unido mediante lavados, se agrega un segundo anticuerpo que se une específicamente al primer anticuerpo.

Nuevamente, los anticuerpos no unidos se eliminan mediante lavados. El segundo anticuerpo lleva un marcador enzimático (p. Ej., Peroxidasa rojiza de caballo o fosfatasa alcalina) unido a él. El proceso de detección está diseñado de tal manera que, como sustrato incoloro sobre el que actúa esta enzima, se forma un producto coloreado. Se identifican las colonias que dan un resultado positivo (es decir, manchas de color). Las células de una colonia específica se pueden subcultivar a partir de la placa maestra.

Detección por función proteica:

Si el ADN diana de la biblioteca de genes es capaz de sintetizar una proteína (particularmente una enzima) que normalmente no es producida por la célula huésped, la actividad de la proteína puede usarse para el cribado. Se utiliza un sustrato específico y su utilización por una colonia de células indica la presencia de una enzima que actúa sobre el sustrato. Por ejemplo, los genes que codifican las enzimas α-amilasa y β-glucosidasa pueden identificarse mediante esta técnica.


Aislamiento de genes y clonación de ADN | Biotecnología

En este artículo discutiremos sobre el aislamiento de genes y la clonación de ADN.

La formación de nuevas combinaciones de material genético mediante la inserción de ácido nucleico producido fuera de la célula en un virus, plásmido bacteriano o cualquier otro sistema de vector para permitir su incorporación en un organismo huésped en el que es capaz de replicación y expresión continuas se denomina como Ingeniería genética.

Las técnicas involucradas también se denominan clonación de genes, manipulación genética in vitro o tecnología recombinante. La transferencia de material genético entre individuos tiene lugar en la naturaleza por conjugación, transducción y transformación.

Cualquiera que sea el objetivo a largo plazo de un proyecto de biología molecular, el objetivo inicial suele ser aislar un solo gen u otro segmento de ADN específico del organismo que se está estudiando. Este es el paso preliminar esencial para la secuenciación del ADN, para examinar el perfil de expresión de un gen o para la purificación de la proteína codificada por un gen.

Este objetivo inicial se puede lograr de dos formas:

I. ¿Mediante clonación de ADN, que implica la inserción de la molécula de ADN deseada en un vector de clonación seguida de la replicación del vector de clonación en un cultivo de bacterias E. coli?

ii. Por PCR, ¿que implica la amplificación enzimática del fragmento de ADN deseado?

& # 8216Gene Cloning & # 8217 es un método para aislar una región específica de ADN y producir millones de copias idénticas del ADN (gen) dentro de un cultivo de células microbianas.

Los pasos básicos en un experimento de clonación de genes son:

I. Aislamiento y purificación de ADN

ii. Corte de ADN en los sitios requeridos por las mismas enzimas de restricción.

iii. Unir (ligar) la pieza requerida de ADN a un vector

iv. Implantar el vector en la célula huésped por transformación.

v. Selección de los transformantes

vi. Las moléculas de ADN recombinante se replican dentro de las células huésped.

vii. Cuando la célula huésped se divide, las copias de las moléculas de ADN recombinante se transmiten a la progenie.

viii. La replicación continua de las células huésped da como resultado clones, cada uno de los cuales consta de células idénticas que contienen copias de una única molécula de ADN recombinante.

Esta serie de manipulaciones da como resultado una biblioteca de clones, que comprende muchos clones diferentes, cada uno con un segmento diferente del ADN original. Por lo tanto, el siguiente paso es identificar el clon que contiene el gen de interés. La PCR es un enfoque muy diferente para aislar el segmento de ADN.

En lugar de una larga serie de manipulaciones que involucran células vivas, la PCR es una reacción de probeta que se lleva a cabo simplemente mezclando los reactivos apropiados e incubándolos en un termociclador, un equipo que permite variar la temperatura de incubación durante tiempo de una manera preprogramada.

Los pasos básicos en un experimento de PCR son los siguientes. El ADN se prepara a partir del organismo que se está estudiando y se desnaturaliza calentando a 94 ° C. Se agrega un par de oligonucleótidos al ADN; las secuencias de estos oligonucleótidos les permiten hibridar cualquier lado del gen u otro segmento de ADN que se va a aislar, y la mezcla se enfría a 50-60 ° C para que estos oligonucleótidos se unan a sus sitios de destino.

Se agrega una ADN polimerasa termoestable junto con un suministro de desoxi-ribonucleótidos y la mezcla se calienta a la temperatura óptima para la síntesis de ADN. El ciclo de desnaturalización-hibridación-extensión se repite de 25 a 30 veces, y el número de moléculas de ADN recién sintetizadas se duplica durante cada ciclo. Esta amplificación exponencial da como resultado la síntesis de un gran número de copias de la secuencia de ADN flanqueada por el par de oligonucleótidos.

Las técnicas básicas necesarias para la clonación y la PCR son:

4. Separación de ADN y ARN mediante electroforesis en gel

5. Purificación de moléculas de ADN a partir de geles de electroforesis

6. Construcción de moléculas de ADN recombinante

7. Introducción de moléculas recombinantes en células hospedadoras y selección recombinante

Una de las habilidades prácticas más importantes que usted, como microbiólogo, es la capacidad de cultivar cultivos puros de bacterias, incluidos cultivos infectados con bacteriófagos. Esto se debe a que la mayoría de los experimentos de clonación de genes utilizan la bacteria E. coli como organismo huésped. Incluso si el objetivo a largo plazo es clonar un gen en un organismo distinto de E. coli, las manipulaciones iniciales se llevarán a cabo en E. coli debido a la facilidad con la que se puede manipular esta bacteria.

Para muchos, la primera biología molecular real que se intentará es la purificación del ADN del organismo en estudio.

La preparación de ARN puro e intacto es relativamente difícil debido a la ubicuidad de enzimas contaminantes que degradan las moléculas de ARN. Las ARNasas presentes en las células de las que se extrae el ARN pueden inactivarse durante el procedimiento de purificación mediante un inhibidor de ARNasa adecuado, pero el material de vidrio y las soluciones contaminadas con ARNasas derivadas de secreciones cutáneas pueden presentar problemas considerables. Estas enzimas son muy resistentes a los tratamientos físicos algunas incluso soportan el autoclave y su control puede ser un problema. También se puede usar ARN en lugar de ADN como material de partida para la PCR.

Separación de ADN y ARN por electroforesis en gel:

La separación de moléculas de ADN y ARN de diferentes tamaños se logra mediante electroforesis en un gel de agarosa o, más raramente, de poliacrilamida. Los geles de agarosa se procesan de forma rutinaria para estimar los tamaños de las moléculas de ADN y ARN, lo que permite evaluar el éxito de una técnica preparativa o manipulación enzimática. La electroforesis en gel de agarosa también es un paso previo al análisis de moléculas de ADN mediante técnicas como la hibridación Southern.

Purificación de moléculas de ADN a partir de geles de electroforesis:

En algunas áreas de la biología molecular existen varios procedimientos alternativos para lograr el mismo objetivo.

1. La purificación de moléculas de ADN a partir de geles es uno de esos casos. Con frecuencia, un gel de agarosa o poliacrilamida proporcionará una banda que puede identificarse con seguridad como que contiene un fragmento de ADN de interés.

2. El siguiente paso podría ser escindir la banda y purificar las moléculas de ADN antes de la construcción de moléculas de ADN recombinante y estudios adicionales.

Construcción de moléculas de ADN recombinante:

El primer paso real en un experimento de clonación de genes es la construcción de moléculas recombinantes mediante la inserción de fragmentos de ADN en moléculas de vector.

Introducción de moléculas recombinantes en células hospedadoras y selección recombinante:

Una vez que se han construido las moléculas de ADN recombinante, deben introducirse en las células de E. coli. Esta es una técnica bastante sencilla y estándar para diferentes tipos de vectores.

A estas alturas debería estar claro que la elección del vector de clonación es importante. Debería determinar la naturaleza del procedimiento utilizado para introducir las moléculas recombinantes en las células huésped y debería especificar la forma en que se seleccionan los recombinantes.

Es importante elegir un vector que sea adecuado para el tamaño de los fragmentos de ADN que desea clonar, ya que algunos vectores están diseñados para fragmentos relativamente pequeños (5 kb y menos) mientras que otros requieren fragmentos por encima de cierto tamaño.


Aislamiento de ADN genómico

El rendimiento, la pureza y la integridad son esenciales para el rendimiento en aplicaciones posteriores como la PCR y la secuenciación. La optimización de las metodologías de extracción es clave para el éxito con tipos de muestras desafiantes y aplicaciones posteriores exigentes. El ADN diana purificado debe estar libre de contaminantes, incluidas proteínas, otros componentes celulares y ácidos nucleicos no deseados.

Es posible que se necesiten kits de purificación especializados y específicos de tipo de muestra para muestras más complejas y desafiantes que contienen ADN degradado o tienen bajas concentraciones de ADN. Los tipos de muestras desafiantes incluyen tejido FFPE, plasma o suero que contiene ADN libre de células, muestras forenses o cualquier fuente donde la cantidad de muestra sea limitada.

Promega fue una de las primeras empresas en proporcionar kits para la purificación de ADN, así como de plásmidos, con más de 30 años de experiencia en extracción de ácidos nucleicos. Ofrecemos una amplia gama de kits de extracción de ADN genómico adecuados para una variedad de tipos de muestras y necesidades de rendimiento, produciendo altos rendimientos y ADN de alta calidad para usar en sus aplicaciones posteriores. Nuestros productos cubren una variedad de opciones de rendimiento y métodos de procesamiento adecuados para sus necesidades específicas y mdash, desde preparaciones individuales manuales hasta pequeños sistemas automatizados de sobremesa o a gran escala.

Utilizando métodos basados ​​en centrifugado, vacío o magnéticos, nuestras soluciones manuales de preparación única son las mejores para procesar menos de 24 muestras a la vez. Si está buscando una solución automatizada, nuestros kits basados ​​en cartuchos para usar con Maxwell & reg Instruments pueden procesar hasta 48 muestras en la misma ejecución. También ofrecemos opciones de extracción de alto rendimiento totalmente automatizadas que utilizan métodos de procesamiento basados ​​en placas, totalmente compatibles con las plataformas de manipulación de líquidos.

Aunque las técnicas como la transferencia Southern, que requieren microgramos de ADN, todavía se realizan en los laboratorios de biología molecular, la mayoría de las evaluaciones del ADN cromosómico se realizan mediante tecnologías basadas en PCR. Estos incluyen PCR monoplex o multiplex, matrices SNP, análisis y PCR en tiempo real, ddPCR y secuenciación de próxima generación (NGS). Estas últimas técnicas utilizan cantidades de nanogramos de ADN por reacción. Independientemente del sistema elegido, los kits de purificación de ADN genómico de Promega proporcionan los rendimientos requeridos de ADN de alta calidad con un mínimo de contaminantes.

Sistemas de purificación manual

Sistemas basados ​​en soluciones

Promega ofrece sistemas de aislamiento de ADN genómico basados ​​en la lisis de muestras con detergentes y la purificación mediante varios métodos. Estos incluyen sistemas basados ​​en membranas (p. Ej., El sistema de purificación de ADN genómico de una sola columna Wizard & reg SV (n.o de cat. A2360, A2361) o el sistema de purificación de ADN genómico de 96 pocillos Wizard & reg SV 96 de alto rendimiento (n.o de cat. A2371) y sistemas de sílice paramagnética fácilmente automatizados.Todos estos sistemas purifican el ADN genómico que se puede utilizar en muchas aplicaciones posteriores.

El kit de purificación de ADN genómico Wizard & reg (Cat. # A1120, A1125, A1620) es un sistema versátil y escalable para aislar ADN genómico mediante un método basado en precipitación. Con este sistema solo, el ADN cromosómico se puede aislar de sangre completa (5), hojas de plantas (6), bacterias Gram positivas (7) y Gram negativas (8), cola de ratón (9) y levadura (10). También se han utilizado con éxito tipos de muestras adicionales como hongos (11), tejidos de rana infectados incrustados en parafina (12), saliva (13) y escarabajos de la harina (14).

Este sistema de purificación genómica no solo es exitoso con muchos tipos de muestras, sino que también se escala fácilmente para la cantidad de material de partida ajustando los volúmenes de reactivo para adaptarse a sus necesidades.

Sistemas basados ​​en columnas

Sistemas tradicionales basados ​​en columnas

Para el aislamiento de una sola columna, el sistema de purificación de ADN genómico Wizard® SV proporciona una técnica rápida y sencilla para la preparación de ADN purificado e intacto a partir de colas de ratón, tejidos y células cultivadas en tan solo 20 minutos, según la cantidad de muestras procesadas. (hasta 24 por centrifugación, dependiendo del tamaño del rotor, o hasta 20 por vacío). Se utiliza un colector de vacío o una microcentrífuga para el procesamiento de muestras. Con algunas modificaciones, también se puede utilizar sangre completa con este sistema de aislamiento (15). Este es un sistema basado en membranas de sílice, lo que significa que existen limitaciones en la cantidad de material que se puede cargar en una sola columna SV de hasta 20 mg de tejido (cola de ratón o tejido animal) o entre 1 × 10 4 y 5 × 10 6 las células de cultivo de tejidos se pueden procesar por purificación. Con más muestra, es posible que el lisado preparado deba dividirse en dos o más columnas para evitar atascos.

Figura 2. Amplificación de ADN genómico aislado de diversas fuentes de tejido utilizando el sistema de purificación de ADN genómico Wizard & reg SV. Se amplificó un microlitro de ADN genómico purificado usando PCR Master Mix (Cat. # M7502) y cebadores IL-1 y beta específicos de ratón (producto de 1,2 kb). Se realizaron reacciones con ADN genómico de ratón (nº de cat. G3091 + C) y sin ADN (& ndashC) como controles positivos y negativos, respectivamente. Las condiciones de ciclo térmico fueron: un ciclo de 3 minutos a 95 ° C seguido de 30 ciclos de: 95 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 1 minuto, 70 ° C durante 1 minuto y extensión final de 30 segundos a 70 ° C durante 7 minutos 4 ° C de remojo. Todos los carriles contenían 105 microlitros de producto de reacción separados en un gel de agarosa al 1%. Los productos de PCR se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.Las designaciones & ldquoSpin & rdquo y & ldquoVacuum & rdquo indican el protocolo utilizado para el aislamiento del ADN genómico.

El ADN genómico aislado con el sistema de purificación de ADN genómico Wizard® SV es de alta calidad y funciona bien en análisis de gel de agarosa, digestiones con enzimas de restricción y análisis de PCR como se ve en la Figura 2. La Tabla 1 proporciona rendimientos típicos de ADN genómico purificado de una variedad de fuentes.

Tabla 1. Rendimiento de ADN genómico típico de varios tejidos utilizando el sistema de purificación de ADN genómico Wizard® SV.

Muestra Monto Rendimiento medio
Recorte de cola 20 mg 20 µg
Hígado 20 mg 15 µg
Corazón 20 mg 10 µg
Cerebro 20 mg 6 µg
Células CHO 1 × 10 6 5 µg
Células NIH / 3T3 1 × 10 6 9 µg
293 celdas 1 × 10 6 8 µg

Los investigadores han utilizado este sistema simple y rápido para muchos tipos de muestras y aplicaciones adicionales, incluidos mosquitos (16), células madre mamarias (17), Bacillus subtilis (18), Escherichia coli (19), la forma larvaria del Schistosoma mansoni parásito (20) y ADN viral de células BC3 infectadas con el virus del herpes del sarcoma de Kaposi & rsquos (21).

Para un aislamiento de 96 pocillos de alto rendimiento, está disponible el sistema de purificación de ADN genómico Wizard & reg SV 96. El ADN genómico amplificable se puede aislar de hasta 5 veces 106 células, 20 mg de tejido o hasta 1,2 cm de la punta de la cola de un ratón sin centrifugar el lisado antes de la purificación.

Este sistema de pozos múltiples requiere un colector de vacío (Vac-Man & reg 96 Vacuum Manifold, Cat. # A2291) y una bomba de vacío capaz de generar 15 & ndash20 pulgadas de mercurio o su equivalente. El ADN genómico se aisló de tres tipos de fuentes diferentes y luego se usó en una PCR monoplex y se procesó en un gel de agarosa como se muestra en la Figura 3. La Figura 4 compara el rendimiento de los tres métodos de purificación de ADN genómico Wizard & reg SV (placa de 96 pocillos, vacío y centrifugación ).

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR amplificados a partir de 1 & microlitro de cola de ratón, células CHO y muestra de ADN genómico de hoja de tomate aislado usando el sistema de purificación de ADN genómico Wizard & reg SV 96. Se visualiza un total de 10 µl de producto de PCR en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio. Panel A. IL-1 & beta (1,2 kb) amplificada a partir de cola de ratón. Panel B. & beta-actina (250 pb) amplificada a partir de células CHO. Panel C. ADN de cloroplasto (600 pb) amplificado de hoja de tomate. Carril M, escalera de ADN de 1 kb (nº de cat. G5711).

Figura 4. Comparación de los rendimientos de ADN utilizando los sistemas de purificación de ADN genómico Wizard & reg SV y SV 96. Rendimiento medio de ADN genómico en microgramos purificado a partir de 20 mg de recortes de cola de ratón. El promedio A260/A280 las proporciones son: SV 96, 1.7 y más de 0.08 SV método de vacío, 1.7 y más de 0.14 SV método de centrifugado, 1.7 y más de 0.14.

Sistemas basados ​​en columnas de alto rendimiento

Ofrecemos dos sistemas ReliaPrep & trade gDNA Miniprep diferentes que purifican el ADN genómico utilizando un método basado en columna de celulosa: ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep System (Cat. # A5081, A5082) y ReliaPrep & trade gDNA Tissue Miniprep System (Cat. # A2051, A2052). Ambos son sistemas listos para usar que obtienen ADN genómico intacto sin utilizar lavados o precipitaciones con etanol. El sistema ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep procesa 200 & mul de sangre o fluidos corporales, frescos o congelados, en menos de 40 minutos. Los rendimientos de sangre son típicamente 4 & ndash10 & mug, dependiendo del recuento de glóbulos blancos. Se pueden procesar hasta 25 mg de tejido, un hisopo bucal (mejilla) o una cola de ratón de 1 cm con ReliaPrep & trade gDNA Tissue Miniprep System y el ADN eluido se recupera en 30 minutos o menos. El ADN purificado se puede eluir en tan solo 50 microlitros y es adecuado para su uso en aplicaciones posteriores como RT-qPCR.

Figura 5. El rendimiento de ADN genómico del sistema ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep System varía con el recuento de glóbulos blancos. Se obtuvo sangre completa de varios individuos y se determinaron los recuentos de glóbulos blancos usando un hemocitómetro. Se utilizaron doscientos microlitros de sangre para la purificación del ADN genómico (n = 3 o 4) y la cantidad de ADNg aislado se cuantificó mediante espectroscopía de absorbancia.

Figura 6. Comparación del volumen de elución con concentración, rendimiento y pureza. Se procesaron alícuotas de sangre (200 µl) usando el sistema ReliaPrep & trade Blood gDNA Miniprep System (n = 4) y se eluyeron con 30 µm de agua libre de nucleasas. Concentración (Panel A), rendimiento total (Panel B) y pureza (Panel C) se evaluaron mediante espectroscopia de absorbancia. El rendimiento disminuyó ligeramente con la disminución del volumen de elución, mientras que la concentración aumentó. La pureza medida por las relaciones de densidad óptica permaneció constante.

Sistemas automatizados para la purificación de ADN

A medida que los laboratorios intentan mejorar la productividad para la investigación, el diagnóstico y las pruebas aplicadas, ha aumentado la necesidad de una automatización de los procesos de purificación que sea fácil de usar y de rendimiento bajo a moderado. La automatización elimina el tiempo de práctica y el trabajo de la purificación manual, lo que le brinda más tiempo y energía para concentrarse en su investigación.

Sistemas basados ​​en cartuchos

Tradicionalmente, la automatización se refiere al uso de equipos grandes, especializados y costosos que requieren una amplia capacitación para operar y mantener. Promega ha desarrollado los sistemas Maxwell®, que brindan alternativas flexibles, confiables, compactas y fáciles de usar a los sistemas automatizados tradicionales.

Los sistemas Maxwell® están diseñados para una purificación eficiente y automatizada de una amplia gama de tipos de muestras (consulte la Tabla 2). Los instrumentos Maxwell® se suministran con métodos de purificación automatizados preprogramados y pueden procesar hasta 48 muestras en tan solo 30 a 40 minutos (según el instrumento, el tipo de muestra y el método). El ADN o ARN concentrado purificado son de alta calidad y alto rendimiento, lo que los hace compatibles con muchas aplicaciones posteriores comunes, incluidas qPCR, ddPCR, genotipado, secuenciación y NGS.

Figura 7. Maxwell® RSC (izquierda) y Maxwell® RSC 48 (derecha).

Tabla 2. Rendimiento de ADN de varios tipos de muestras después de la purificación con los kits de purificación de ADN e instrumentos Maxwell & reg RSC.

Hasta 50 mg de tejido hepático
Hasta 50 mg de tejido pulmonar

Los kits Maxwell & reg ofrecen cartuchos de reactivos predispensados ​​para la purificación de ADN genómico, ARN y ácido nucleico total. Los kits centrados en la aplicación y el tipo de muestra hacen de Maxwell & reg Instruments un instrumento de extracción versátil para laboratorios que pueden trabajar con una o todas estas aplicaciones diferentes.

Figura 8. Los métodos de extracción de ADN o ARN de Maxwell® RSC comienzan con cartuchos precargados con reactivos de purificación y partículas paramagnéticas, listos para sus muestras. Después de la adición de la muestra, el Maxwell® RSC mueve las partículas paramagnéticas y los ácidos nucleicos asociados a través de múltiples pasos que finalmente producen ARN o ADN de alta pureza en 30–100 µl.

Los sistemas Maxwell & reg purifican muestras utilizando partículas paramagnéticas (PMP), que proporcionan una fase sólida móvil que optimiza la captura de muestras, el lavado y elución del ácido nucleico. Los instrumentos Maxwell & reg son instrumentos de manipulación de partículas magnéticas que unen de manera eficiente los ácidos nucleicos a la partícula paramagnética en el primer pocillo de un cartucho precargado. Las muestras se procesan mediante una serie de lavados antes de eluir el ácido nucleico. La metodología sistemática basada en partículas magnéticas utilizada por Maxwell & reg Instruments evita problemas comunes asociados con los sistemas de purificación automatizados basados ​​en manipuladores de líquidos, como puntas obstruidas o transferencias parciales de reactivos, que pueden resultar en un procesamiento de purificación subóptimo.

Los instrumentos Maxwell & reg compactos de sobremesa son fáciles de configurar y no requieren capacitación especial para su uso. Los métodos automatizados optimizados están precargados, los cartuchos de reactivos precargados se colocan en su lugar, se agrega la muestra y usted selecciona "Iniciar" para comenzar con el método apropiado. Una lista completa de kits de extracción de ácido nucleico está disponible aquí.

Hay disponibles varios kits de reactivos Maxwell & reg Instrument que permiten una extracción óptima de una variedad de tipos de muestras, que incluyen sangre, suero y plasma, tejido fijado con formalina, incluido en parafina (FFPE), bacterias, tejido vegetal, alimentario y animal.

Los sistemas Maxwell & reg HT permiten la purificación de ADN o ARN a escala en cualquier manipulador de líquidos de laboratorio en formato SLAS de 24 o 96 pocillos. Las químicas de purificación de Maxwell & reg utilizan soluciones novedosas basadas en partículas magnéticas que reducen naturalmente el arrastre de contaminación.

Además de la química confiable, usted y rsquoll obtienen el apoyo de expertos para comenzar con la automatización u optimizar su flujo de trabajo actual de HT. Nuestro equipo de expertos en automatización puede ofrecer asistencia con la mayoría de los principales proveedores de automatización de laboratorios del mundo y ayudarlo a desarrollar e implementar una solución automatizada de purificación de ácidos nucleicos personalizada para las necesidades de su laboratorio.

Kits de extracción de ADN genómico

¿Busca opciones de extracción por escala o tipo de muestra? Explore nuestro portafolio de extracción de ADN para descubrir la solución adecuada para sus necesidades de purificación.

Soluciones de automatización escalables

Los instrumentos Maxwell® RSC proporcionan una plataforma de purificación de ácidos nucleicos compacta y automatizada que procesa hasta 16 (Maxwell® RSC) o hasta 48 (Maxwell® RSC 48) muestras simultáneamente.

Soporte de automatización y química de purificación de alto rendimiento

Las químicas Maxwell® HT permiten la automatización de la purificación de ácidos nucleicos en manipuladores de líquidos. Nuestro equipo de expertos en automatización ofrece asistencia para ayudar a desarrollar e implementar una solución automatizada de purificación de ácidos nucleicos personalizada según las necesidades de su laboratorio.

Sistemas de alto rendimiento para el aislamiento de ADN genómico

Promega ofrece varias opciones automatizadas de alto rendimiento para aislar el ADN genómico de muestras de sangre. Algunos laboratorios, como los biobancos, desean aislar el ADN de grandes cantidades de material de partida (por ejemplo, 10 ml de sangre). El sistema de aislamiento de ADNg HT de gran volumen ReliaPrep & trade (n.º de cat. A2751) proporciona un medio eficaz para el aislamiento de ADN genómico derivado de fracciones de sangre derivadas de muestras de sangre completa de 2,5 y 10 ml. Esta química se puede automatizar en manipuladores de líquidos mediante el uso de un dispositivo Promega HSM, que permite el procesamiento de reacciones de purificación en tubos cónicos de 50 ml.

El software de operación de instrumentos y detección de nivel de líquido escala la química al volumen de entrada de muestra para cada muestra individual, lo que reduce el desperdicio y el gasto de reactivos. El sistema automatizado también puede procesar muestras en tubos de 14 ml utilizando el adaptador de bajo volumen XAT1020 (LVA y métodos) que permite procesar muestras de 0,25 y ndash3 ml.

No hay tediosos pasos de centrifugación o productos químicos peligrosos, que son inherentemente a la estación de trabajo de manipulación, lo que ofrece una purificación sencilla del ADN genómico de la sangre completa, independientemente del almacenamiento de la muestra o las condiciones de envío.

Figura 9. El ADN se aisló de sangre completa mediante tres métodos, se separó mediante electroforesis en gel CHEF y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. El ADN aislado con el sistema de aislamiento de ADNg HT de gran volumen ReliaPrep & trade proporcionó ADN con un rango de tamaño de 20 a 125 kb.

Existe una opción para el aislamiento de bajo rendimiento de ADNg de hasta 32 muestras a la vez cuando el Instrumento magnético con agitador calefactor (HSM 2.0 Cat. # A2715) se usa en un banco en lugar de estar integrado en un manipulador de líquidos donde el usuario dispensa y aspira reactivos de las muestras según lo indique el software en la pantalla de una computadora. Los métodos preprogramados controlan el calentamiento, la agitación, la magnetización y la sincronización de los pasos necesarios para la purificación semiautomática.

Además de la sangre entera, también se pueden procesar una variedad de otros tipos de muestras, que incluyen saliva estabilizada, muestras de lavado bucal, fracciones de sangre, capas leucocíticas, sedimentos de glóbulos rojos y todos los sedimentos de células. Para una purificación totalmente automatizada, el instrumento HSM 2.0 se puede integrar con una estación de trabajo robótica de manipulación de líquidos.

La automatización de reactivos en la instrumentación requiere un enfoque cuidadosamente planeado y ejecutado. Colaborar con Promega le brinda acceso a científicos que han diseñado la purificación automatizada para cientos de laboratorios, en una amplia gama de tipos de muestras.

La automatización de reactivos en la instrumentación requiere un enfoque cuidadosamente planeado y ejecutado. Colaborar con Promega le brinda acceso a científicos que han diseñado la purificación automatizada para cientos de laboratorios, en una amplia gama de tipos de muestras.

Figura 10. Rendimientos automatizados de ADN para fracciones de sangre. El rendimiento de ADN es lineal con respecto a los volúmenes originales de sangre. Panel A. Rendimientos de ADN según lo determinado por el espectrofotómetro NanoDrop. Panel B. Rendimientos de ADN determinados mediante el sistema dsDNA de QuantiFluor & trade. Todas las muestras se prepararon a partir de un solo donante. Las muestras manuales se procesaron utilizando el kit de purificación de ADN genómico Wizard & reg. Cada punto es la media de n = 4 valores con barras de error de 1 desviación estándar.

Purificación de ácido nucleico HT personalizada

La implementación de tecnologías automatizadas de purificación de ácidos nucleicos en su flujo de trabajo de alto rendimiento puede ser un desafío y llevar mucho tiempo. Nuestros científicos de soporte de campo pueden brindarle el apoyo que necesita para comenzar.

Kits de purificación de ADN seleccionados por tipo de muestra

Obtenga más información sobre algunos de nuestros kits especializados a continuación, explore la amplitud de nuestra cartera y compare nuestros kits de extracción de ADN con la ayuda de nuestra página de comparación de productos para descubrir la solución adecuada para sus necesidades de purificación de ADN.

Aislamiento de ADN genómico de tejido fijo

MagneSil® Genomic, Fixed-Tissue System (Cat. # MD1490), proporciona una técnica rápida y sencilla para la preparación de ADN genómico a partir de tejido fijado con formalina e incluido en parafina. Después de una digestión con proteinasa K durante la noche, el ADN genómico se puede purificar manualmente a partir de secciones delgadas de tejido FFPE en menos de una hora. El ADN genómico amplificable se puede aislar a partir de secciones de 10 μm sin centrifugar el lisado antes de la purificación. Se pueden procesar hasta 12 muestras en formato manual utilizando un soporte de separación magnética con tecnología MagneSphere® (n.º de cat. Z5332, Z5342).

Figura 11. Análisis de ADN purificado a partir de secciones delgadas de 10 µm fijadas con formalina y embebidas en parafina utilizando MagneSil® Genomic, Fixed Tissue System. Se amplificó el ADN purificado y los productos de amplificación se analizaron en un analizador genético ABI PRISM® 310 o 3100. Panel A. Amplificación con un conjunto de 16 cebadores marcados con fluorescencia. Los productos de amplificación varían en tamaño de 104 a 420 bases. Panel B. Un fragmento de 972 bases amplificado usando un conjunto de cebadores de amelogenina. Panel C. Un fragmento de 1,8 kb amplificado a partir del Adenomatosis poliposis coli (APC) gene. Aumentar el tiempo de extensión durante la amplificación puede ayudar a equilibrar los rendimientos entre los productos de amplificación pequeños y grandes y aumentar los rendimientos de los productos de amplificación grandes. Los resultados variarán según el grado de reticulación debida a la fijación con formalina.

Una ventaja que tiene este sistema sobre otros métodos de purificación, como la extracción con fenol: cloroformo, es su capacidad para eliminar la mayoría de los inhibidores de la amplificación, incluidos los fragmentos muy pequeños de ADN. El tejido que se ha almacenado en formalina durante períodos prolongados de tiempo puede estar demasiado reticulado o demasiado degradado para funcionar bien como plantilla para la amplificación. La Figura 11 muestra una amplificación de 16 loci de repetición corta en tándem (STR) y demuestra qué tan bien puede funcionar el ADN aislado en PCR multiplex usando el sistema PowerPlex® 16 HS (Cat. # DC2101, DC2100).

El Maxwell® RSC FFPE Plus DNA Kit (Cat. # AS1720) es un método automatizado para purificar hasta 48 muestras de una a diez secciones de 5 μm de muestras de tejido FFPE en el Maxwell® RSC Instrument (Cat. # AS4500 1-16 cartuchos por ejecución) o Maxwell® RSC 48 Instrument (Cat. # AS8500 1-48 muestras por ejecución). La química FFPE Plus está diseñada para proporcionar un alto rendimiento de ADN de FFPE cuando se mide mediante espectroscopía que es adecuada para aplicaciones de amplificación que incluyen qPCR, PCR multiplex y NGS. El protocolo proporciona flexibilidad con una desparafinización rápida de 1 hora o un protocolo nocturno de 24 horas para adaptarse a sus necesidades de flujo de trabajo.

La química Maxwell® RSC DNA FFPE es la última tecnología FFPE de Promega y ha sido diseñada para proporcionar ADN altamente amplificable. Ahorre tiempo y mano de obra utilizando la química FFPE con los instrumentos Maxwell® y evite la exposición al xileno peligroso utilizado en otros productos de purificación FFPE. Nuestras pruebas de calidad también han demostrado que prácticamente no hay inhibidores de PCR en muestras de ADN purificado, lo que hace que su PCR y otras aplicaciones posteriores sean muy sencillas.

Utilizando la misma química que Maxwell® RSC FFPE DNA, el Maxwell® HT DNA FFPE Isolation System (Cat. # A6372) proporciona un método simple y confiable para el aislamiento rápido y de alto rendimiento de ADN genómico de muestras de tejido FFPE. El sistema no requiere un solvente orgánico, lo que lo hace seguro y conveniente de usar, y el ADN purificado se puede usar directamente en una variedad de aplicaciones posteriores, incluidas PCR y NGS.

El sistema de aislamiento Maxwell® HT DNA FFPE purifica el ácido nucleico utilizando partículas paramagnéticas, que proporcionan una fase sólida móvil para optimizar la unión, el lavado y la purificación del gDNA. El uso de partículas paramagnéticas para el aislamiento de ADN elimina la necesidad de centrifugación o colectores de vacío, lo que hace que el sistema sea adecuado para la automatización completa.

Dado que las muestras de FFPE pueden tener una calidad muy variable debido a la naturaleza del proceso de fijación e inclusión de la muestra, el control de calidad de las muestras puede ser una parte importante del flujo de trabajo de FFPE.

Figura 12. Datos comparativos de la química FFPE de ADN de Maxwell & reg RSC versus la química de ADN de Maxwell & reg RSC FFPE Plus. Se ha observado que el método Maxwell & reg RSC FFPE Plus DNA produce más rendimiento por absorbancia y fluorescencia, mientras que el método Maxwell & reg RSC DNA FFPE produce más rendimiento por PCR.

Espectrofotometria es una forma común de evaluar la calidad del ADN y ARN extraídos. La mayoría de los laboratorios tienen un espectrofotómetro de microvolumen NanoDrop (o un dispositivo similar) y son increíblemente fáciles de usar. Pipetee 1-2 µl de muestra, seleccione "Analizar" y el instrumento proporciona una lectura de concentración y pureza a través de A260/A280 y A260/A230 proporciones en solo unos segundos. Estos dispositivos han revolucionado la cuantificación de muestras de rutina en el laboratorio, pero ¿es el mejor método para evaluar muestras de FFPE? Hay dos consideraciones principales al usar un NanoDrop: sensibilidad e integridad. Las muestras de FFPE pueden tener un rendimiento amplio de ADN o ARN, a menudo tan solo 10 ng o menos en un volumen que varía de 10 µl a 100 µl de una extracción. Esto puede resultar en concentraciones de muestra por debajo del rango lineal de NanoDrop. Además, como espectrofotómetro, no distingue entre ARN, ADN o nucleótidos libres, lo que puede resultar en inexactitudes dramáticas en las mediciones de concentración de ADN / ARN. Finalmente, no hay forma de determinar si una muestra es accesible para ensayos enzimáticos posteriores, ya que no puede detectar la presencia o ausencia de enlaces cruzados (u otros daños) dentro de una muestra.

Cuantificación basada en colorantes como el sistema Promega QuantiFluor® dsDNA (Cat. # E2670, E2671), proporciona un método rápido y significativamente más sensible para cuantificar el dsDNA o RNA en comparación con la espectroscopia de absorbancia. Este método proporciona una estimación de concentración muy útil. Al considerar muestras de FFPE, es importante tener en cuenta que la cuantificación basada en colorantes no estima la integridad del ADN / ARN o el grado de reticulación en la muestra, lo que podría afectar el éxito en los ensayos posteriores.

Ensayos de dimensionamiento (p. ej., gel de agarosa, estación de cinta, analizador de fragmentos, DV200) puede proporcionar una estimación de la concentración y, lo que es más importante, información sobre la distribución del tamaño de los fragmentos en la muestra. El ADN derivado de FFPE, debido al proceso de fijación, puede fragmentarse significativamente en comparación con el ADN de tejido recién congelado. A continuación se muestra una traza del analizador de fragmentos (Figura 13) y puntuaciones DV200 asociadas (Tabla 3) de ADN aislado de secciones FFPE utilizando cinco métodos de purificación diferentes. Si bien las trazas de tamaño evalúan la distribución del tamaño del ADN purificado, no miden el grado de entrecruzamiento dentro de la muestra o la presencia de inhibidores.

Figura 13. Traza del analizador de fragmentos de ADN aislado de secciones FFPE utilizando cinco métodos de purificación diferentes.

Tabla 3. Puntuaciones de DV200 de ADN aislado de secciones FFPE usando cinco métodos de purificación diferentes en trazas del analizador de fragmentos (Figura 13).

Método 1 (verde claro) 2 (azul) 3 (rojo) 4 (naranja) 5 (verde)
DV200 71.8 69.9 70.1 58.7 80.5

Por ejemplo, cuando se cuantificaron las mismas muestras mediante ensayos de qPCR de varios objetivos y tamaños de fragmentos, el rendimiento de qPCR no se correlaciona bien con las puntuaciones de DV200. De hecho, en este ejemplo, las muestras con las puntuaciones DV200 más bajas tuvieron el mayor rendimiento por qPCR (Figura 14).

Figura 14. Los rendimientos de qPCR de ADN aislado de secciones de FFPE. Las mismas muestras de ADN aisladas mediante cinco métodos de purificación diferentes en la traza del analizador de fragmentos y la tabla DV200 anteriores se cuantificaron mediante ensayos de qPCR de diversos tamaños de fragmentos y dianas.

Si bien existen tendencias generales, la puntuación DV200 no se correlaciona necesariamente con el éxito en ensayos posteriores como qPCR.

qPCR tiene varias ventajas para la cuantificación de muestras FFPE. Primero, qPCR puede ser muy sensible, requiriendo solo una pequeña cantidad de muestra y detectando cantidades pg / & microl de ADN. En términos de sensibilidad en la detección de ácidos nucleicos, solo es superada por ddPCR. La qPCR también puede proporcionar una medida de cuán degradada o reticulada puede estar una muestra de ADN, ya que el ácido nucleico debe ser un sustrato adecuado para una ADN polimerasa para que se genere una señal. Es posible que la absorbancia no represente la muestra adecuada para el análisis posterior porque detectará ADN, ADN fragmentado y nucleótidos. Por último, la mayoría de los ensayos de control de calidad de qPCR, como el ensayo de control de calidad de ADN ProNex & reg (n.º de cat. NG1004, NG1005) proporcionan controles internos que se utilizan para detectar la presencia de inhibidores en la muestra antes de intentar un ensayo más caro. Esto puede ayudarlo a evaluar no solo la integridad de los ácidos nucleicos, sino también la probabilidad de que un ensayo basado en amplificación tenga éxito.

NGS es otro ensayo utilizado por algunos laboratorios para controlar el control de calidad de sus muestras. Hay varias razones para esto. Algunos laboratorios están tratando de obtener la mayor cantidad de datos posible de muestras muy valiosas, en cuyo caso cualquier información de secuencia puede valer el gasto y el riesgo de ejecuciones de secuenciación fallidas. Como prueba de control de calidad, NGS puede proporcionar mucha información, pero es costosa y puede requerir grandes cantidades de muestra y tiempo. Algunos laboratorios ejecutan NGS de paso bajo, que utiliza muestras altamente multiplexadas para reducir el costo por muestra y determinar si vale la pena el tiempo y los recursos para secuenciar más profundamente. La mayoría de los proveedores de secuenciación y purificación recomiendan ensayos de qPCR para cuantificar el ADN de FFPE, ya que todos los flujos de trabajo de NGS dependen principalmente del éxito de los pasos de amplificación enzimática para obtener ADN listo para la secuenciación como parte de los pasos de preparación de la biblioteca.

Tabla 4. Pros y contras comparativos de varios ensayos de CC.

Método Velocidad Sensibilidad ¿Cuantitativo? ¿Medir la pureza? ¿Evaluar el tamaño de NA? ¿Detectar enlaces cruzados? Costo
Espectrofotometría (NanoDrop) +++ + Semicuantitativo + - - $
Cuantificación basada en colorantes +++ ++ Y - - - $
DV200 ++ + Semicuantitativo - +* - $$
Electroforesis en gel ++ +/- Semicuantitativo - +* - $
qPCR ++ +++ Y +* + + $
NGS + Y + ++ + $$$

Aislamiento de ADN genómico vegetal

El Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System (Cat. # FF3760, FF3761) está diseñado para la purificación manual o automatizada de 96 pocillos de ADN de hojas de plantas y tejido de semillas. El Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System ha sido validado con hojas de maíz y tomate, así como con semillas de canola y girasol. El ADN purificado de estas muestras se puede utilizar en PCR y otras aplicaciones más exigentes, como el análisis RAPD. Dado que los materiales vegetales pueden ser particularmente difíciles de lisar, especialmente cuando se trabaja con tejidos duros o leñosos, el equipo adicional requerido incluye no solo un imán (MagnaBot® FLEX 96 Magnetic Separation Device, Cat. # VA1920) sino también un dispositivo capaz de romper la semilla. o material de hoja (por ejemplo, Geno / Grinder® 2000 de SPEX CertiPrep, Inc.).

El rendimiento depende del material de origen y de qué tan bien se pulverizan las semillas o los discos de las hojas antes del aislamiento del ADN genómico. El rendimiento puede oscilar entre 10 y 100 ng con un solo punzón de hoja de 8 mm. Para aumentar el rendimiento del Wizard® Magnetic 96 DNA Plant System, se puede utilizar un aumento de volumen con hasta 5 perforaciones de hojas [como se demuestra en Notas de Promega 79]. El aumento de escala potencial está limitado por el volumen en una placa de 96 pocillos de pozos profundos.

Otra opción automatizada que tenemos para satisfacer sus necesidades de extracción de ADN de plantas es el kit Maxwell® RSC Plant DNA (Cat. # AS1490). El kit Maxwell® RSC Plant DNA se utiliza con los instrumentos Maxwell® RSC y RSC 48 para proporcionar un método sencillo para la purificación eficiente y automatizada de ADN genómico (gDNA) de una variedad de muestras de tejido vegetal, que incluyen maíz, soja y Arabidopsis. Los instrumentos se suministran con métodos de purificación preprogramados y utilizan cartuchos de reactivos predispensados, lo que maximiza la simplicidad y la conveniencia.

Con este sistema, el ADN se puede purificar a partir de muestras de plantas en menos de 60 minutos con un preprocesamiento mínimo y sin extracciones orgánicas. La purificación automatizada da como resultado una purificación constante, con menos variabilidad que los métodos tradicionales de extracción de ADN, como CTAB y columnas de centrifugación. El ADN purificado resultante está listo para usar en aplicaciones posteriores, incluidos los ensayos de amplificación.

Aislamiento de ADN genómico suero-plasma

Para obtener ADN libre de células purificado de alta calidad a partir de muestras de plasma, ofrecemos el kit de plasma Maxwell® RSC ccfDNA (n.º de cat. AS1480). Utilizando el protocolo simple de tres pasos, Maxwell® RSC Instrument puede procesar de 1 a 16 muestras, y Maxwell® RSC 48 Instrument puede procesar de 1 a 48 muestras. Simplemente agregue de 0,2 a 1,0 ml de plasma a los cartuchos preparados y seleccione Iniciar, sin necesidad de preprocesar las muestras. En aproximadamente 70 minutos, tendrá altos rendimientos de ADN amplificable que está listo para usarse en ensayos posteriores, incluidos qPCR, NGS y PCR digital.

Como motor de partículas magnéticas, no como manipulador de líquidos, el Maxwell® RSC ofrece además varias ventajas sobre otros sistemas automatizados. Dado que no se manipulan líquidos ni se producen salpicaduras durante el procesamiento de la muestra, existe un riesgo mínimo de contaminación cruzada de la muestra. También elimina la preocupación de posibles obstrucciones y averías inevitables del sistema que siguen, lo que garantiza un flujo de trabajo fluido con menos interrupciones.

Aislamiento de ADN genómico bacteriano

Si necesita tomar decisiones rápidas sobre la posible contaminación y deterioro de los alimentos, el kit de patógenos Maxwell® RSC PureFood Pathogen (Cat. # AS1660) ofrece un protocolo automatizado simple con pasos prácticos mínimos. El kit elimina eficazmente los laboriosos pasos de preprocesamiento de muestras, como el pretratamiento enzimático, ya que funciona con tipos de muestras inhibidores y también tiene la capacidad de lisar bacterias Gram + o Gram–.

Al acoplar las químicas Maxwell® de alto rendimiento con los confiables instrumentos Maxwell® RSC de sobremesa, podrá purificar eficazmente el ADN bacteriano de hasta 48 muestras de alimentos en tan solo 40 minutos. Una vez extraído, el ADN resultante está listo para análisis moleculares avanzados posteriores, incluida la serotipificación, NGS y la identificación de organismos de descomposición.

Este método se puede utilizar tanto para alimentos crudos como procesados ​​y se ha utilizado con éxito para aislar el ADN de patógenos de una amplia variedad de muestras de alimentos, que incluyen E. coli 0157: H7 de carne de vacuno sin cocer, Salmonella enterica de pollo crudo y Listeria monocytogenes de leche entera. La Figura 15 a continuación destaca una comparación de ADN total versus E. coli 0157: ADN H7 extraído de muestras de cilantro que fueron enriquecidas con el E. coli 0157: Bacterias H7.

Figura 15. Comparación de ADN total y E. coli 0157: ADN H7 extraído de muestras de cilantro enriquecidas con las cantidades indicadas de E. coli 0157: Bacterias H7. La concentración total de ADN se evaluó utilizando el sistema QuantiFluor® ONE dsDNA.

Aislamiento de ADN genómico de capa leucocitaria

El kit Maxwell® RSC Buffy Coat DNA (Cat. # AS1540) proporciona un método simple y automatizado de extracción de ADN genómico utilizando el conveniente formato de cartucho precargado del Maxwell® RSC Instrument. El kit contiene todos los reactivos necesarios para una extracción de ADN óptima y es compatible con sangre almacenada en anticoagulantes EDTA, heparina y citrato. Evite la tediosa y lenta molestia de preprocesar las muestras, simplemente agregue 50–250μl de su muestra directamente en el pozo # 1 de los cartuchos. Su ADN purificado está listo para el análisis en aproximadamente 50 minutos y se puede usar directamente en varias aplicaciones posteriores, como la electroforesis en gel de agarosa.

Aislamiento de ADN genómico de alimentos

Los alimentos y los materiales vegetales a menudo representan el mayor desafío para la lisis celular y la extracción de ADN intacto, debido a las condiciones de lisis requeridas para liberar el ácido nucleico y el procesamiento de los materiales vegetales en comestibles.

Otro sistema de aislamiento de ADN genómico especializado es el Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food (Cat. # FF3750, FF3751). Este conveniente protocolo está diseñado para la purificación manual de ADN de una variedad de muestras de alimentos que incluyen semillas de maíz, harina de maíz, soja, harina de soja y leche de soja, generando resultados en un tercio del tiempo de los métodos tradicionales. Además, el ADN se puede purificar a partir de alimentos procesados ​​como chips de maíz, chocolate y alimentos que contienen chocolate, lecitina y aceites vegetales si se utilizan con los protocolos optimizados adecuados.

El ADN purificado de muchas de estas muestras se puede utilizar en pruebas basadas en PCR para secuencias de ADN de organismos modificados genéticamente (OGM), como por ejemplo mediante análisis cuantitativo con ensayos TaqMan®. Al igual que con todos los sistemas de aislamiento que utilizan MagneSil® PMP, se necesita un soporte de separación magnética que permite el procesamiento de hasta 12 muestras por lote. Con muestras que contienen alimentos altamente procesados, el ADN genómico aislado se fragmentará y será más adecuado para el análisis mediante amplificación en lugar de una transferencia Southern. El rendimiento de ADN de este sistema variará según el tipo de fuente y la extensión del procesamiento de alimentos.

El Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit (Cat. # AS1600) proporciona un método sencillo y automatizado para la purificación eficiente de ADN para la autenticación de alimentos e ingredientes basada en PCR. El kit se utiliza con los instrumentos Maxwell® RSC y RSC 48 y puede purificar el ADN de muestras de alimentos crudos y procesados, incluidos maíz, soja, canola, carne molida de res y cerdo molida.

El protocolo de 100 minutos requiere solo 30 minutos de tiempo práctico, logrando de manera efectiva no solo resultados más rápidos con la automatización inmediata, sino también liberando recursos de laboratorio para actividades de mayor valor. El ADN purificado extraído con el kit PureFood está listo para usarse en varias aplicaciones, incluida la PCR en tiempo real, la electroforesis en gel, la secuenciación y los microarrays de Sanger y de próxima generación.

Protocolos de purificación de ácidos nucleicos para tipos de muestras de plantas y alimentos

Explore nuestra colección de protocolos para la extracción manual y automatizada de ADN o ARN de una variedad de muestras de alimentos y plantas.


Nueva especificación AQA-estructura de ADN y síntesis de proteínas-B13.5

Los recursos de Paperfriendlyresourcesuk PFR se han diseñado para garantizar que la enseñanza de buena calidad no se vea comprometida por restricciones de impresión o almacenamiento en búfer de videos. Se han creado lecciones que incluyen hojas de trabajo para que los maestros impriman al menos dos copias en una hoja A4.

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Lecciones sobre estructura de ADN y síntesis de proteínas creadas de acuerdo con la NUEVA Especificación AQA (9-1). NB: SOLO BIOLOGÍA. Enseñé este tema en dos lecciones, ya que es un tema que es un concepto difícil y se puede enseñar de manera efectiva en lugar de apresurarse. Este recurso está diseñado para una clase de habilidad superior, aunque el contenido se puede ajustar para adaptarse a cualquier habilidad. Incluye: videos y temporizadores integrados, animaciones de diapositivas, preguntas de práctica con respuestas en diapositivas, hojas de trabajo y un cuestionario interactivo.

Enlace de especificaciones de AQA: 6.1.5
Capítulo relevante: B13 Genética y reproducción. Libro de texto de la tercera edición de AQA Biology, páginas 204-205.

Los estudiantes deben poder describir el ADN como un polímero hecho de cuatro nucleótidos diferentes. Cada nucleótido consta de un azúcar común y un grupo fosfato con una de cuatro bases diferentes unidas al azúcar. El ADN contiene cuatro bases, A, C, G y T. Una secuencia de tres bases es el código para un aminoácido en particular. El orden de las bases controla el orden en el que se ensamblan los aminoácidos para
producir una proteína particular.
Las largas hebras de ADN consisten en secciones alternas de azúcar y fosfato. Adjunta a cada azúcar hay una de las cuatro bases. El polímero de ADN está formado por unidades de nucleótidos repetidas.

(Solo HT) Los estudiantes deben ser capaces de: •• recordar una descripción simple de la síntesis de proteínas •• explicar simplemente cómo la estructura del ADN afecta la proteína producida •• describir cómo las variantes genéticas pueden influir en el fenotipo: a) en la codificación del ADN alterando el actividad de una proteína: yb) en el ADN no codificante por
alterando cómo se expresan los genes.
(Solo HT) En las hebras complementarias, una C siempre está vinculada a una G en la hebra opuesta y una T a una A.
(Solo HT) No se espera que los estudiantes conozcan o comprendan la estructura del ARNm, ARNt o la estructura detallada de aminoácidos o proteínas.
(Solo HT) Los estudiantes deben poder explicar cómo un cambio en la estructura del ADN puede resultar en un cambio en la proteína sintetizada por un gen.
(Solo HT) Las proteínas se sintetizan en los ribosomas, según una plantilla. Las moléculas portadoras aportan aminoácidos específicos para agregar a la cadena de proteínas en crecimiento en el orden correcto.
(Solo HT) Cuando la cadena de proteínas está completa, se pliega para formar una forma única. Esta forma única permite que las proteínas hagan su trabajo como enzimas, hormonas o estructuras formadoras en el cuerpo como el colágeno.

Obtenga este recurso como parte de un paquete y ahorre hasta un 42%

Un paquete es un paquete de recursos agrupados para enseñar un tema en particular, o una serie de lecciones, en un solo lugar.

AQA Biología-Temas SEPARADOS SOLAMENTE PAPEL 2

Ciencias separadas B10.4, B10.5 y amp B10.6 B11.9 y amp B11.10 B12.1, B12.2, B12.3, B12.4. B12.5 B13.4, B13.5 y amp B13.6 B14.5 y amp B14.6 B15.1, B15,2, B15.3 y amp B15.4

Nueva especificación AQA-B13 Paquete de reproducción-Biología / ciencia separada

Debido a la demanda popular, he subido un paquete B13. Este paquete contiene el contenido para estudiantes de BIOLOGÍA / ciencias SEPARADAS. Incluye todos los recursos que necesita para enseñar el tema Reproducción de B13. Si está enseñando este tema (B12) a estudiantes de ciencias combinados, he subido un paquete separado para él. Las lecciones se han realizado de acuerdo con los requisitos de la especificación. Vídeos incrustados para facilitar su uso, recursos en papel adjuntos. Busque las lecciones individuales para obtener más información sobre el contenido de la lección. Ahorre 42% comprando este paquete. Temas superiores incluidos. Total de 11 lecciones + Paquete de preguntas en papel anterior sobre mitosis y meiosis. L1 = tipos de reproducción L2 = división celular y reproducción sexual L3 = lo mejor de ambos mundos L4 = ADN y el genoma L5a = estructura del ADN L5b = síntesis de proteínas L6 = expresión génica y mutación L7 = herencia en acción L8 = más sobre genética L9 = trastornos hereditarios L10 = detección de trastornos genéticos


Conclusión

Se necesitan esfuerzos de secuenciación ambiental específicos que aborden más específicamente los picoeucariotas, con menos énfasis en los procariotas. Esto permitiría una mejor cobertura y, por tanto, conjuntos más grandes de genomas eucariotas. El objetivo de la secuenciación ambiental del Mar de los Sargazos fue claramente obtener secuencias procarióticas y esto se hizo utilizando un filtro de porosidad muy pequeña, tamizando organismos de entre 0,22 y 0,8 μm. La forma más sencilla de mejorar la representación de picoeukaryotes en un metagenoma sería cambiar el rango de filtración entre 0,5 y 2 μm y aumentar el esfuerzo de secuenciación a un mínimo de un millón de lecturas. Esto eliminaría una gran fracción de los procariotas y aumentaría la proporción de picoeucariotas presentes en la muestra de agua.


La Instalación de ADN de la Oficina de Biotecnología de la Universidad Estatal de Iowa brinda servicios de apoyo a la investigación para investigadores dentro del mundo académico, la industria y el gobierno. La instalación de ADN de la Universidad Estatal de Iowa está comprometida a brindar un servicio de calidad de manera rápida, confiable y económica.

El sistema de seguimiento y pedidos en línea OnCore de la instalación de ADN de la Universidad Estatal de Iowa permite a los clientes realizar pedidos, realizar un seguimiento del progreso de los pedidos y recibir los resultados del servidor de la instalación las 24 horas del día. Una vez que haya realizado su pedido, simplemente imprima una copia de su número de seguimiento y envíelo por correo con sus muestras a nuestras instalaciones. Cuando sus muestras hayan sido procesadas, recibirá un correo electrónico notificándole que sus datos están listos para descargar. El tiempo de entrega típico para la mayoría de nuestros servicios es de dos días hábiles.

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Depuración de SynXII

Se superaron varios obstáculos durante el montaje de synXII. El primer synXII creció inicialmente más lento que el tipo salvaje, en parte como resultado de la eliminación completa de todos los genes de ARNt en el cromosoma y, en particular, de la eliminación de dos de tres tL (UAG) L genes (Fig. 2 y Fig. S8). Se observó un fenómeno similar durante la síntesis de synX, en el que la deleción de tR (CCU) J, el único ARNt de arginina con el anticodón CCU, provocó un defecto de crecimiento severo en el medio YPGE (10) (fig. S17). En segundo lugar, la ubicación de los marcadores selectivos en cada megachunk se diseñó para interrumpir un gen no esencial, pero en muchos casos esto condujo a una función mitocondrial gravemente deteriorada o resistencia al estrés. Teóricamente, el defecto debería haberse restaurado una vez que se integró el siguiente megachunk (fig. S18). Sin embargo, los defectos mitocondriales comúnmente daban como resultado una tasa de crecimiento sustancialmente más lenta, prolongando en gran medida el ciclo de reemplazo (fig. S16A). En tercer lugar, la recodificación también dentro de un marco de lectura abierto es generalmente bien tolerada. Encontramos al menos un caso durante el proceso de reemplazo del megachunk E, en el que la función de MMM1 se vio afectado como resultado de la recodificación para generar un PCRTag (YLL006W.1F) (9, 10). En cuarto lugar, la eliminación de un intrón hipotético dentro de la UTR 5 ′ de COQ9 condujo a un bloqueo transcripcional (fig. S16). Debido a que prestamos mucha atención al crecimiento celular en el medio YPGE durante todo el proceso de ensamblaje, la mayoría de los defectos detectados están relacionados con la función mitocondrial. Podría haber otros defectos menores en el genoma sintético, que pasaron desapercibidos en esas condiciones. Sin embargo, dado que las cepas finales muestran una aptitud casi de tipo salvaje una vez que se suministra un ARNt, synXII es el cromosoma lineal sintético más grande sintetizado y es completamente funcional.

SynXII tiene un locus de ADNr altamente plástico que no solo se puede mover a otros loci cromosómicos, sino que también se puede alterar en su región ITS para hacerse pasar por una especie distinta según lo definido por el "código de barras de ADN" utilizado ampliamente en taxonomía. La capacidad de realizar "especies morphing" que se informa aquí presumiblemente refleja el grado de flexibilidad evolutiva por el cual estas regiones ITS cambian. Sin embargo, esta región de código de barras claramente no es infinitamente flexible, ya que solo se toleraron cambios de base intragénero relativamente modestos. Las diferencias intergénero más graves en la secuencia de ITS no dieron como resultado rDNA funcionales, probablemente debido a un defecto en el procesamiento del rRNA. La capacidad de diseñar, construir y depurar un cromosoma del tamaño de una megabase junto con la flexibilidad en la posición del locus del ADNr, habla de la notable flexibilidad general del genoma de la levadura.


Bioproducción de ADN monocatenario puro a escala kilobase

La producción escalable de ADN monocatenario de kilobase (ssDNA) con control de secuencia tiene aplicaciones en terapéutica, síntesis y secuenciación de genes, origami de ADN andamiado y almacenamiento de memoria de ADN de archivo. La producción biológica de ssDNA circular (cssDNA) utilizando M13 aborda estas necesidades a bajo costo. Sin embargo, un objetivo no alcanzado es minimizar las regiones codificantes de proteínas esenciales del ADN exportado mientras se mantiene su infectividad y pureza de producción para producir secuencias de menos de 3000 nt de longitud, relevantes para aplicaciones terapéuticas y de ciencia de materiales. Con este fin, el minifago sintético con inserciones de secuencia y tamaño personalizados ofrece síntesis escalable y de bajo costo de cssDNA en miligramos y escalas más altas. Aquí, optimizamos las condiciones de crecimiento usando una cepa auxiliar de E. coli combinada con un genoma de minifago que lleva solo un origen f1 y un gen de resistencia a antibióticos que codifica la β-lactamasa (bla), lo que permite el aislamiento de cssDNA puro con una longitud genómica de secuencia mínima de 1.676 nt, sin requerir una purificación adicional del ADN contaminante. Se demuestra la escalabilidad de bajo costo del cssDNA isogénico de longitud personalizada para una secuencia de 2.520 nt utilizando un biorreactor, purificado con niveles bajos de endotoxinas (& lt5 U.E./ml). Aplicamos estos cssDNAs resistentes a exonucleasas al autoensamblaje de objetos de origami de ADN de estructura metálica y para codificar información digital sobre el genoma del minifago para la amplificación biológica.

Declaracion de conflicto de interes

T.R.S., R.R.D. y M.B. son coinventores de una patente pendiente (62 / 584,664) para algunos de los métodos descritos en este documento.

Cifras

Producción escalable de bacteriófagos de isogénicos…

Producción escalable de bacteriófagos de cssDNA isogénico. ( a ) Miniphage phPB52 fue ensamblado ...

Matraz agitador producción de puro…

Producción de cssDNA puro en matraz agitador. ( a ) Crecimiento en matraz agitador de…

Producción de fermentadores por lotes de…

Producción de fermentadores por lotes de ADNcss puro. ( a ) Producción escalable en ...

Aplicaciones de minifago isogénico escalable ...

Aplicaciones de la producción de minifágicos isogénicos y escalables. ( a ) Bipirámides pentagonales de 52 pb…


Financiamiento interno de NEB y Ginkgo Bioworks. Financiamiento del cargo de acceso abierto: New England Biolabs.

Declaracion de conflicto de interes. Vladimir Potapov, Jennifer L.Ong, Bradley W. Langhorst, Katharina Bilotti, Thomas C. Evans, Jr, Gregory J.S. Lohman son empleados de New England Biolabs, un fabricante y vendedor de reactivos de biología molecular, incluidas las ligasas de ADN. Esta afiliación no afecta la imparcialidad de los autores, el cumplimiento de los estándares y políticas de la revista o la disponibilidad de datos.

Dan Cahoon, Barry Canton y Thomas F. Knight son empleados de Ginkgo Bioworks, Inc., una corporación que utiliza enzimas y reactivos para la síntesis de genes en el curso del desarrollo de microbios diseñados. Esta afiliación no afecta la imparcialidad de los autores, el cumplimiento de los estándares y políticas de la revista o la disponibilidad de datos.


Ver el vídeo: 6- Tema 1 Teórico Desnaturalización y Renaturalización del ADN Genética 2030 (Mayo 2022).


Comentarios:

  1. Fegor

    Es - no tiene sentido.

  2. Vudor

    Pido disculpas, pero, en mi opinión, no tienes razón. Estoy seguro. Discutamos.

  3. Dagonet

    En algún lugar ya he leído algo igual, y prácticamente palabra por palabra ... :)

  4. Morven

    Mensajes exactos



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