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D7. Química redox y plegamiento de proteínas - Biología

D7. Química redox y plegamiento de proteínas - Biología



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En general, imaginamos que el interior de una celda se encuentra en un entorno reductor. Las células tienen concentraciones suficientes de moléculas similares al "b-mercaptoetanol" (utilizadas para reducir los enlaces disulfuro en proteínas in vitro) como el glutatión (g-Glu-Cys-Gly) y la tiorredoxina reducida (con un sitio activo Cys) para prevenir el enlace disulfuro formación en proteínas citoplasmáticas. La mayoría de las proteínas citoplasmáticas contienen Cys con pKa de cadena lateral> 8, lo que minimizaría la formación de enlaces disulfuro ya que las Cys están protonadas predominantemente a ese pH.

Los enlaces disulfuro en las proteínas se encuentran típicamente en proteínas extracelulares, donde sirven para mantener juntas las proteínas de múltiples subunidades a medida que se diluyen en el medio extracelular. Estas proteínas destinadas a la secreción se insertan cotranslacionalmente en el retículo endoplásmico (véase más adelante), que presenta un entorno oxidante para la proteína de plegado y donde los azúcares se unen covalentemente a la proteína de plegado y se forman enlaces disulfuro (véase Capítulo 3D: Glicoproteínas: biosíntesis y función. ). Las enzimas proteicas implicadas en la formación de enlaces disulfuro contienen Cys libres que forman disulfuros mixtos con sus proteínas de sustrato diana. Las enzimas (tiol-disulfuro oxidorreductasas, proteína disulfuro isomerasas) tienen un motivo Cys-XY-Cys y pueden promover la formación de enlaces disulfuro o su reducción a sulfhidrilos libres. Son especialmente sensibles a redox ya que sus cadenas laterales Cys deben alternar entre formas disulfuro libres y libres.

Los enlaces disulfuro intracelulares se encuentran en proteínas en el periplasma de procariotas y en el retículo endoplásmico (RE) y el espacio intermembrana mitocondrial (IMS) de eucariotas. Para estas proteínas, la etapa inicial de la síntesis de proteínas (en el citoplasma) se separa temporal y espacialmente del sitio de formación de enlaces disulfuro y plegamiento final. Los enlaces disulfuro se pueden generar en una proteína diana mediante la reducción concomitante de un disulfuro en un catalizador de proteína, dejando constante el número neto de disulfuros (a menos que la enzima se vuelva a oxidar mediante un proceso independiente). Alternativamente, se puede formar un disulfuro mediante la transferencia de electrones a agentes oxidantes tales como dioxígeno.

En el RE, la formación de enlaces disulfuro es catalizada por proteínas de la familia de la isomerasa disulfuro (PDI). Para funcionar como catalizadores en este proceso, los PDI deben estar en un estado oxidado capaz de aceptar electrones de la proteína diana para la formación de enlaces disulfuro. Una flavoproteína, Ero1, recicla el PDI de nuevo a un estado oxidado, y la Ero1 reducida se regenera al pasar electrones al dioxígeno para formar peróxido de hidrógeno. En resumen, en la formación de disulfuros en el RE, los electrones fluyen desde la proteína naciente a las PDI a la proteína flavina Ero1 al dioxgeno (es decir, a mejores y mejores aceptores de electrones). El primer paso es realmente una mezcla de disulfuro, que, cuando se acopla a los pasos siguientes, conduce a la formación de un enlace disulfuro de novo.

En la mitocondria, la formación de enlaces disulfuro ocurre en el espacio intermembrana (IMS) y es guiada por el “sistema de retransmisión disulfuro de mitocondrias”. Este sistema requiere dos proteínas importantes: Mia40 y Erv1. Mia40 contiene un enlace disulfuro activo redox cys-pro-cys y oxida los residuos de cys en cadenas polipeptídicas. Erv1 puede entonces reoxidar Mia40 que a su vez puede reoxidarse a sí mismo por el hemo en el citocromo c. El citocromo C reducido es oxidado por la citocromo C oxidasa del transporte de electrones a través del paso de electrones a dioxígeno para formar agua. La importancia de la oxidación de la proteína IMS es menos conocida, pero se cree que el estrés oxidativo causado por una disfunción podría conducir a enfermedades neurodegenerativas.

Una revisión reciente de Riemer et al compara el ER y los procesos mitocondriales para la formación de enlaces disulfuro:

  • Muchas más y diversas proteínas forman disulfuros en el RE en comparación con el IMS. La mayoría de los IMS tienen una masa molecular baja y dos enlaces disulfuro entre motivos de hélice-vuelta-hélice. Estos sustratos proteicos incluyen chaperonas que facilitan la localización de proteínas en la membrana interna y en proteínas involucradas en el transporte de electrones en la membrana interna.

  • Hay muchas PDI en el RE, probablemente reflejando la diversidad estructural de sustratos proteicos en el RE. Sin embargo, Mia40 parece ser el único PDI en el IMS.

  • La formación de enlaces disulfuro "de novo" es iniciada por Ero1 en el ER y Erv1 en el IMS. La evolución convergente condujo a estructuras similares para ambos: un paquete de 4 hélices que une FAD con dos Cys proximales.

  • La vía de las mitocondrias conduce a la formación de agua al reducir el dioxígeno, no el peróxido de hidrógeno, lo que minimiza la formación de especies reactivas de oxígeno en las mitocondrias. Es de suponer que el peróxido formado en el RE se convierte en una forma inerte.

  • El IMS está en contacto más íntimo con el citoplasma a través de proteínas de la membrana externa llamadas porinas que permitirían el acceso de glutatión. El IMS presenta un ambiente más oxidante que el citoplasma (con más glutatión). El ER, sin un análogo de la porina, sería más oxidante.

  • La formación reversible de disulfuros en el RE regula la actividad de las proteínas.

Regulación del enlace disulfuro en el espacio periplasmático de las bacterias

La sensibilidad redox de la cadena lateral Cys que se encuentra en los enlaces disulfuro es importante para regular la actividad de las proteínas. En particular, el grupo tiol del aminoácido Cys, un nucleófilo importante que se encuentra a menudo en el sitio activo, puede modificarse para controlar la actividad de la proteína. La formación de un enlace disulfuro o la oxidación de tioles libres a ácido sulfénico o además a ácido sulfínico o sulfónico pueden bloquear la actividad de las proteínas. Las proteínas periplásmicas de E. Coli DsbA (enlace disulfuro A) convierten los tioles libres adyacentes en cistina unida por disulfuro, reduciéndose en el proceso. DsbB volvió a oxidar DsbA a su forma catalíticamente activa. ¿Qué pasa con la proteína periplásmica como YbiS con un sitio activo Cys? Dado que el entorno del periplasma se está oxidando, la niebla YbiS debe protegerse de la conversión oxidativa de la Cys libre en ácidos sulfínicos o sulfónicos, lo que hace que la proteína se vuelva inactiva. El mecanismo involucra dos proteínas periplásmicas conocidas como DsbG y DsbC que son similares a la tiorredoxina. Estas dos proteínas son capaces de donar electrones al tiol desprotegido evitando que se oxide, lo que permite que YbiS permanezca activo en el periplasma. Para mantener la actividad, DsbG y DsbC se reducen mediante otra proteína periplásmica, DsbD.


Plegamiento de proteínas y formación de enlaces disulfuro en la célula eucariota: informe de la reunión basado en las presentaciones en el European Network Meeting on Protein Folding and Disulfide Bond Formation 2009 (Elsinore, Dinamarca)

El retículo endoplásmico (RE) desempeña un papel fundamental como compartimento para el plegamiento de proteínas en las células eucariotas. Los defectos en el plegamiento de proteínas contribuyen a una lista creciente de enfermedades, y los avances en nuestra comprensión de los detalles moleculares del plegamiento de proteínas están ayudando a proporcionar formas más eficientes de producir proteínas recombinantes para uso industrial y medicinal. Además, la investigación realizada en los últimos años ha demostrado la importancia del RE como un compartimento de señalización que contribuye a la homeostasis celular general. El castillo de Hamlet proporcionó un impresionante telón de fondo para la última reunión de la red europea para debatir este tema en Elsinore, Dinamarca, del 3 al 5 de junio de 2009. Organizada por investigadores del Departamento de Biología de la Universidad de Copenhague, la reunión contó con 20 charlas de ambos nombres y científicos más jóvenes, centrándose en temas como el plegamiento y la maduración oxidativa de proteínas (en particular en el RE, pero también en otros compartimentos), la regulación redox celular, la degradación asociada al RE y la respuesta de la proteína desplegada. Se presentaron nuevos y emocionantes avances, y el entorno íntimo con alrededor de 50 participantes brindó una excelente oportunidad para discutir cuestiones clave actuales en el campo.


Transiciones de tiol redox en la señalización celular, parte A: química y bioquímica de los tioles proteicos y de bajo peso molecular

Pierluigi Mauri,. Fulvio Ursini, en Métodos en enzimología, 2010

2 Identificación de MS / MS de interruptores redox en proteínas

En la química de las proteínas, los disulfuros estructurales se identifican comparando y volviendo a secuenciar los péptidos producidos por diferentes endoproteasas en condiciones reductoras y no reductoras. Estos enfoques (revisados ​​en Gorman et al., 2002) son largos y complejos y hoy en día se sustituyen progresivamente por tecnología moderna basada en MS / MS.

Cuando una proteína que contiene un interruptor redox está en su forma oxidada, la proteólisis produce un fragmento que contiene el disulfuro o fragmentos dobles unidos entre sí por el disulfuro. En ambos casos, la aparición de un nuevo péptido con una masa 2 a.m.u. menor que la masa del péptido reducido o la suma de dos péptidos sugiere una identificación que será validada por secuenciación MS / MS.

El principal inconveniente del enfoque es la necesidad de un pH alcalino para la actividad de la tripsina, la endoproteasa más específica y estandarizada utilizada en proteómica. De hecho, cuando las Cys se disocian, se produce una mezcla de tiol-disulfuro mediante un ataque nucleofílico del tiolato sobre el disulfuro, como ya señaló Sanger en 1953. Esta reorganización de artefactos debilita profundamente la validez de la asignación de disulfuro (Gorman et al., 2002 ).

Aunque este gran error a menudo se pasa por alto en los informes de identificación de disulfuro, incluida la glutatión, su aparición, cuando se usa tripsina y la proteína contiene cisteínas libres, es inevitable. El uso de agentes alquilantes para eliminar las Cys libres en nuestras manos no fue satisfactorio, ya que no se puede descartar por completo la posibilidad de que un tiolato todavía reaccione con un disulfuro en lugar de reaccionar con el agente alquilante.

El uso de la endoproteasa pepsina, que es activa a pH ácido, previene la mezcla de tiol-disulfuro, pero este enfoque adolece de la especificidad baja e impredecible de la proteólisis.

En nuestros estudios, este problema se resolvió asumiendo heurísticamente un patrón proteolítico constante en la proteína oxidada y reducida. Los péptidos dobles candidatos se identificaron según el patrón de fragmentación observado en condiciones reductoras. El análisis MS / MS de la serie doble b-y confirmó las identificaciones correctas.


La oxidasa DsbA pliega una proteína con un disulfuro no consecutivo

Uno de los últimos problemas sin resolver de la biología molecular es cómo la información secuencial de aminoácidos conduce a una proteína funcional. Por tanto, es esencial la formación correcta de disulfuro dentro de una proteína. Presentamos la ribonucleasa periplásmica I (RNasa I) de Escherichia coli como un nuevo sustrato endógeno para el estudio del plegamiento oxidativo de proteínas. Uno de sus cuatro disulfuros está entre cisteínas no consecutivas. En general, el plegamiento de proteínas con disulfuros no consecutivos requiere la proteína disulfuro isomerasa DsbC. Por el contrario, nuestro estudio con RNasa I muestra que DsbA es un catalizador suficiente para la correcta formación de disulfuro in vivo e in vitro. Por lo tanto, DsbA es más específico de lo que generalmente se supone. Además, mostramos que el potencial redox del periplasma depende de la presencia de glutatión y las proteínas Dsb para mantenerlo en -165 mV. Determinamos la influencia de este potencial redox en el plegamiento de la ARNasa I. En las condiciones más oxidantes de las cepas dsb (-), DsbC se vuelve necesario para corregir disulfuros no nativos, pero no puede sustituir a DsbA. En conjunto, DsbA pliega una proteína con un disulfuro no consecutivo siempre que no se formen disulfuros incorrectos.


Evidencia de detección redox por un canal de calcio cardíaco humano

Los canales de iones son fundamentales para la vida y responden rápidamente a los estímulos para evocar respuestas fisiológicas. La entrada de calcio al músculo cardíaco se produce a través de la subunidad α1C conductora de iones (Cav1.2) del canal de Ca (2+) de tipo L. La glutatilación de Cav1.2 da como resultado un aumento de la entrada de calcio y es evidente en el corazón humano isquémico. Sin embargo, existe controversia sobre si la modificación directa de Cav1.2 es responsable de la función alterada. Evaluamos directamente la función de Cav1.2 humano purificado en proteoliposomas. El truncamiento del terminal C y la mutación de las cisteínas en la región del terminal N y el enlazador del bucle citoplasmático III-IV no alteraron los efectos de los agentes modificadores de tiol sobre la probabilidad de apertura del canal. Sin embargo, la mutación de las cisteínas en el enlazador del bucle I-II citoplasmático alteró la probabilidad de apertura y el plegamiento de proteínas evaluados mediante un ensayo de desplazamiento térmico. Encontramos que C543 confiere sensibilidad de Cav1.2 al estrés oxidativo y es suficiente para modificar la función del canal y el plegamiento postraduccional. Nuestros datos proporcionan evidencia directa del canal de calcio como sensor redox que facilita respuestas fisiológicas rápidas.

Cifras

Figura 1. Caracterización del Ca v…

Figura 1. Caracterización del Ca v 1.2 corriente de la isoforma NT larga humana ...

Figura 2. La isoforma NT larga y ...

Figura 2. La isoforma NT larga y la isoforma NT corta responden de manera similar a la DTT y ...

Figura 3. Truncar el término C de…

Figura 3. Truncar el extremo C de la isoforma NT larga aumenta significativamente P o…

Figura 4. Mutación de cisteínas en…

Figura 4. La mutación de las cisteínas en el extremo N de la isoforma NT larga no ...

Figura 5. Mutación de cisteínas en…

Figura 5. Mutación de cisteínas en el enlazador citoplasmático del lazo III-IV de la NT larga ...

Figura 6. Mutación de cisteínas en…

Figura 6. Mutación de cisteínas en la región enlazadora del bucle I-II de la NT larga ...

Figura 7. Mutación de la cisteína 543 a…

Figura 7. La mutación de la cisteína 543 a serina altera la respuesta del canal a…


Relaciones estructura-función, roles fisiológicos y evolución de selenoproteínas residentes en ER de mamíferos

El selenio es un oligoelemento esencial en los mamíferos. La principal forma biológica de este micronutriente es el aminoácido selenocisteína, que está presente en los sitios activos de las selenoenzimas. Siete de las 25 selenoproteínas de mamíferos se han identificado como residentes del retículo endoplásmico, incluida la selenoproteína de 15 kDa, la yodotironina desyodasa tipo 2 y las selenoproteínas K, M, N, S y T. La mayoría de estas proteínas están mal caracterizadas. Sin embargo, estudios recientes implican a algunos de ellos en el control de calidad del plegamiento de proteínas en el RE, la retrotranslocación de proteínas mal plegadas del RE al citosol, el metabolismo de la hormona tiroidea y la regulación de la homeostasis del calcio. Además, algunas de estas proteínas participan en la regulación del metabolismo de la glucosa y la inflamación. Esta revisión analiza la evolución y las relaciones estructura-función de las selenoproteínas residentes en el RE y resume los hallazgos recientes sobre estas proteínas, que revelan el importante papel emergente del selenio y las selenoproteínas en la función del RE.


Introducción

Los enlazadores naturales actúan como espaciadores entre los dominios de proteínas multidominio. Se han identificado varios enlazadores entre dominios en los límites de dominios funcionalmente distintos. 1 Estos enlazadores adoptan una estructura en espiral y muestran preferencia por los aminoácidos Gln, Arg, Glu, Ser y Pro. 1 Un método automatizado para extraer enlazadores entre dominios de un conjunto de datos de proteínas con una estructura tridimensional conocida reveló que la mayoría de los conjuntos de enlazadores entre dominios constituyen residuos de Pro, Arg, Phe, Thr, Glu y Gln que actúan como espaciadores rígidos. 2 La prolina es común a muchos enlazadores entre dominios derivados de forma natural, y los estudios estructurales indican que las secuencias ricas en prolina forman estructuras extendidas relativamente rígidas para evitar interacciones desfavorables entre los dominios. 3 Un análisis independiente mostró que Thr, Ser, Gly y Ala también son residuos preferidos en enlazadores naturales. 4 Además, se han observado regiones ricas en Gly flexibles como enlazadores naturales en proteínas, generando bucles que conectan dominios en proteínas multidominio. 5, 6 El avance en la tecnología del ADN recombinante facilitó la fusión de proteínas o dominios utilizando estos enlazadores de aminoácidos sintéticos. Además de los estudios estructurales de las interacciones proteína-proteína, una amplia gama de aplicaciones en el campo de la biotecnología han empleado estas proteínas fusionadas para explorar la bioquímica basada en proteínas, como para crear enzimas bifuncionales artificiales, 7 para producir anticuerpos 8 y proteínas con especialidades funciones, 9 y como herramientas para el análisis FRET. 10

A menudo se requiere la caracterización de las interacciones proteína-proteína para comprender varios procesos biológicos. Sin embargo, el estudio de las interacciones proteína-proteína para muchos complejos se ve obstaculizado cuando uno o más socios del complejo se despliegan o son inestables. Tradicionalmente, este problema se ha abordado mediante la coexpresión y / o co-purificación de ambas proteínas. 11 Sin embargo, para complejos inestables o que interactúan débilmente, la coexpresión y / o co-purificación a menudo resulta en una sola proteína. 12 Las técnicas de ingeniería de proteínas fueron otra opción para abordar las proteínas desplegadas o inestables, utilizando una quimera de cadena polipeptídica única para unir los dos socios de unión a través de un enlazador de aminoácidos flexible 13. Con estas proteínas quiméricas, fue posible mantener las interacciones proteína-proteína intramoleculares e intermoleculares, 14 y las proteínas quiméricas se han utilizado para generar complejos binarios estables y solubles para estudios estructurales, así como dímeros funcionales. 15

La vinculación de los socios vinculantes mediante un vinculador artificial aumentará la proximidad entre los socios que interactúan y preservará la interacción natural. En los casos en los que los socios que interactúan no están vinculados, es posible que los socios de unión puedan disociarse debido a su baja afinidad y / o debido a las condiciones de cristalización. La mayoría de los enlazadores artificiales usados ​​para generar proteínas quiméricas para estudios estructurales son ricos en residuos Gly (Tabla I). Curiosamente, los enlazadores flexibles de origen natural que se encuentran en muchas proteínas también son ricos en residuos de Gly. En la siguiente sección, discutimos algunos de estos enlazadores ricos en Gly que ocurren naturalmente.

1FTK, 1FTL, 1FTO, 1FW0, 1FTJ, 1FTM

Enlazadores ricos en gly en la naturaleza

En muchas proteínas existen enlazadores ricos en Gly de origen natural y, además de los dominios de enlace, se sabe que tienen un papel funcional en la proteína.El factor de transcripción PAX6 consta de dos dominios de unión al ADN, un dominio emparejado (PD) y un homeodominio (HD), unidos por un enlazador rico en Gly. 16 El análisis de la estructura cristalina del complejo de ADN-PD PAX6 humano reveló que el enlazador extendido hace contactos de surcos menores con el ADN. En las glicoproteínas transmembrana (TM) de retrovirus, los enlazadores también desempeñan importantes funciones funcionales, que median la fusión de la membrana a través de un péptido de fusión N-terminal. El péptido de fusión está unido al núcleo central en espiral a través de enlazadores ricos en Gly. La longitud y la composición de aminoácidos de los enlazadores se conservan en muchos retrovirus y en HA2 de los virus de la influenza. 18 Los experimentos de mutagénesis de exploración con alanina y prolina mostraron que el enlazador rico en Gly del virus de la leucemia de células T humanas Tipo 1 (HTLV-1) TM, gp21, está involucrado en la función de fusión de membranas. 18 El extremo N de la proteína SR (factores de unión a ARN específicos de secuencia), SRSF1, contiene dos motivos de reconocimiento de ARN (RRM) conectados a través de un enlazador rico en Gly, que es esencial para la unión de potenciadores de empalme exónico (ESE) . 19 En otros casos, el papel del enlazador rico en Gly aún se desconoce. En los bacteriófagos filamentosos Ff (M13, fd y f1), la proteína del gen de cubierta menor 3 (g3p) consta de tres dominios (N1, N2 y CT) conectados por un enlazador flexible rico en Gly 6, existe una región rica en Gly más larga en el g3p del fago filamentoso IKe, pero esto parece no conferir una ventaja selectiva. 20 enlazadores ricos en Gly también están implicados en enfermedades. TDP-43 (proteína de unión a ADN TAR) consta de dos dominios de unión a ARN (RBD) y un extremo C-terminal rico en Gly. Las mutaciones en el dominio rico en Gly de TDP-43 se han relacionado con la esclerosis lateral amiotrófica. 21 También se emplean enlazadores ricos en Gly para estudios de bioimagen. Las nuevas proteínas activadoras de fluorógeno (FAP) consisten en fragmentos variables de cadena única (scFv), que están hechos de dominios pesados ​​variables (VH) y ligeros variables (VL) de inmunoglobulina humana unidos covalentemente mediante un enlazador rico en Gly y Ser. 22 Estos FAP producen fluorescencia al unirse a un colorante o fluorógeno específico y se utilizan en estudios de bioimagen para rastrear la dinámica de las proteínas.

Los roles de los enlazadores

Los enlazadores Poly-Gly y ricos en Gly pueden considerarse como unidades independientes y no afectan la función de las proteínas individuales a las que se unen. Las proteínas fusionadas se comportan de forma independiente, de modo que las proteínas de cadena única pueden realizar la función combinada de parejas fusionadas. 23, 24 Por ejemplo, el bucle de giro beta nativo de Tipo I 'en la nucleasa estafilocócica se reemplazó con una secuencia de giro de cinco residuos de concanavalina A, sin alterar la actividad de la nucleasa. La estructura cristalina reveló que la proteína híbrida estaba bien plegada y la secuencia de giro introducida conservaba la conformación de la estructura de la concanavalina A parental. 25 En otros sistemas, sin embargo, las regiones enlazadoras pueden afectar la estabilidad, solubilidad, estado oligomérico y resistencia proteolítica de las proteínas fusionadas. 24 La proteína represora, Arc, es un dímero con subunidades idénticas. Se probó una proteína fusionada, Arc-linker-Arc, para determinar su estabilidad, cinética de plegamiento de proteínas y actividad biológica variando la longitud y composición del conector. Si bien los enlazadores poli-Gly proporcionaron la máxima libertad conformacional, no pudieron garantizar una estabilidad óptima. Por el contrario, la estabilidad máxima se obtuvo con un enlazador que contenía 11 residuos Ala y 5 residuos Gly o 7 residuos Ser y 9 residuos Gly, respectivamente, en la región aleatorizada del enlazador. 26 Se han utilizado enlazadores Gly flexibles para mejorar el plegamiento y la función de las proteínas etiquetadas con epítopos. Se han colocado engarces polipeptídicos flexibles de 5, 8 o 10 residuos Gly entre un epítopo y una proteína marcada para aumentar la sensibilidad y accesibilidad del epítopo sin interferir en el plegamiento y la función de la proteína. 27, 28 Por tanto, es importante que la longitud y la composición de aminoácidos de un enlazador potencial se optimicen para preservar la actividad biológica de las proteínas individuales en el complejo fusionado.

La longitud del bucle creada por el enlazador puede tener un efecto profundo en la acción del enlazador en el complejo fusionado. Se llevó a cabo un estudio sistemático para investigar el papel de la longitud del bucle en el plegamiento y la estabilidad de proteínas utilizando la proteína Rop como sistema modelo. 24 Rop es un homodímero de monómeros de hélice-bucle-hélice y, para este experimento, el enlazador de bucle de dos residuos entre la hélice 1 y la hélice 2 se reemplazó por una serie de monómeros no naturales (Gly)1–10 enlazadores, con 1 a 10 residuos Gly. Al igual que con la proteína Rop de tipo salvaje, los 10 mutantes mantuvieron una estructura de dímero altamente helicoidal y retuvieron el mismo nivel de actividad de unión al ARN de tipo salvaje. Curiosamente, sin embargo, la estabilidad de la proteína Rop hacia la desnaturalización térmica y química se correlacionó inversamente con la longitud del bucle, es decir, una longitud del bucle más larga dio como resultado una estabilidad progresivamente disminuida. 24 En los casos en que la solubilidad y / o la estabilidad de las proteínas son los problemas clave para los estudios de interacción proteína-proteína, unirlas entre sí puede mejorar la solubilidad y estabilidad del complejo. 30, 31 En algunos casos, la estabilidad se puede mejorar alterando la longitud del enlazador y la composición de aminoácidos. 26 Por lo tanto, los enlazadores ricos en Gly se utilizan entre dos proteínas que interactúan, ya sea para mejorar la estabilidad de uno de los socios de unión o, cuando la interacción es transitoria, para generar un complejo proteína-proteína estable. A continuación, presentamos nuestro análisis en varios casos en los que se han utilizado enlazadores artificiales ricos en Gly para fusionar dos proteínas para estudios estructurales. La Tabla I proporciona detalles sobre las proteínas que se fusionaron y también sobre la longitud y composición del enlazador utilizado para la fusión.

Enlazadores para proteínas inestables y sus compañeros de unión

Algunas proteínas existen en complejo con su (s) pareja (s) de unión para permanecer estables en las células. 23 No pueden existir como una sola proteína y requieren coexpresión con su compañero de unión cuando se expresan en un sistema heterólogo. La sobreexpresión de proteínas individuales daría como resultado moléculas de proteína inestables o agregados de mayor peso molecular, lo que dificulta la cristalización. En varios casos, esto se soluciona mediante el uso de enlazadores ricos en Gly flexibles. En las siguientes secciones, discutimos brevemente la utilización de esta estrategia para generar moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) estable, dominios LIM (Lin-11 / Islet-1 / Mec-3) y moléculas receptoras Pregnane X para estudios estructurales.

Complejos de péptidos-MHC de clase II

Los enlazadores utilizados en las moléculas del MHC son ventajosos para dos escenarios diferentes: estabilizar proteínas y atrapar interacciones transitorias proteína-proteína. Inicialmente, se demostró que el enlace covalente de un péptido a una molécula de MHC de clase II podría estabilizar la molécula de MHC. 13 Posteriormente, esta estrategia se aplicó para obtener el complejo ternario MHC / péptido / TCR (receptor de células T), 75 que se reveló como un complejo de disociación rápida (ver la sección Enlazadores para atrapar interacciones transitorias proteína-proteína).

Las moléculas de MHC de clase II son proteínas heterodiméricas que comprenden cadenas α y β que interactúan de forma no covalente. La porción extracelular consta de dos regiones: un sitio de unión del péptido, que consta de un dominio α1 o β1, y un dominio similar a Ig, que consta de un dominio α2 o β2. Cuando se expresan como dos cadenas diferentes (α y β) y se mezclan para formar un heterodímero αβ, las moléculas del MHC de clase II dan como resultado agregados de alto peso molecular, lo que sugiere la posible heterogeneidad de los heterodímeros αβ en presencia de cadenas α y β libres. Sin embargo, se produjeron heterodímeros αβ estables cuando un péptido antigénico, reconocido por una molécula de MHC de clase II particular, se unió covalentemente al extremo N de la cadena β1 de MHC de clase II mediante un enlazador rico en Gly de 16 aminoácidos (GGGGSLVPRGSGGGGS). La presencia de enlazador no tuvo efecto sobre el reconocimiento del complejo péptido-MHC Clase II por los hibridomas de células T específicos. 13 Este enlazador particular tiene un sitio de escisión de trombina flanqueado por residuos ricos en Gly, de modo que el enlazador entre las proteínas fusionadas se puede escindir. Sin embargo, la estructura cristalina de la proteína MHC de clase II humana, HLA-DR1, complejada con un péptido del virus de la influenza no ligado (PDB: 1DLH) reveló que un ligador de seis aminoácidos es suficiente para conectar el extremo C-terminal del péptido al N-terminal de la molécula MHC de clase II 76. Además, atar un péptido de ovoalbúmina (OVA) al extremo N-terminal de la cadena β1 de la molécula IA d MHC Clase II usando un enlazador de seis aminoácidos (Tabla I), fue suficiente para mejorar la estabilidad de los heterodímeros αβ (Fig. 1). 78 Otros ensayos de cristalización encontraron que muchas condiciones podrían producir cristales con calidad de difracción. Este enfoque experimental condujo a la cristalización con éxito de otros complejos de péptido-MHC de clase II utilizando un enlazador polipeptídico. 31-44

Estructura cristalina del complejo MHC de clase II-péptido. Representación de cinta del complejo MHC Clase II IA d (verde) y péptido de ovoalbúmina (magenta) (código PDB: 2IAD), donde el extremo C-terminal del péptido de ovoalbúmina está unido al extremo N-terminal de la cadena β del MHC Clase II IA d molécula usando un enlazador GSGSGS (6aa). No se observó la densidad electrónica del enlazador y la posible posición se indicó mediante líneas de puntos azules. Todas las figuras relacionadas con la estructura de esta revisión se prepararon utilizando el programa PyMol. 77

Dominio LIM y proteínas relacionadas

Los dominios LIM (Lin-11 / Islet-1 / Mec-3) son una clase de dominios de unión al zinc que median las interacciones proteína-proteína para regular el destino celular. 23 Las proteínas que contienen el dominio LIM se dividen en tres grupos: proteínas LIM solo (LMO), proteínas del homeodominio LIM (LIM-HD) y familias de quinasas LIM. Generalmente, las proteínas LMO se localizan en el núcleo, pero carecen de una secuencia de localización nuclear. Por lo tanto, para mantener estas proteínas en el núcleo, deben unirse a la proteína de unión al dominio LIM-1 (ldb1). LMO1, 2 y 4 juegan un papel importante en el desarrollo normal y leucémico de las células T, y los complejos LMO-ldb1 pueden modular la expresión génica. 79 Las proteínas de OVM son insolubles e inestables cuando se expresan por bacterias, pero esto puede rectificarse cuando se fusionan con ldb1 utilizando un conector GGSGGHMGSGG o GGSGGSGGSGG en el extremo C-terminal. 80 El dominio de interacción LIM (LID) de ldb1 (300–340) no está estructurado en solución. 29 Al unirse a los dominios LIM N-terminales de LMO2 y LMO4, el LID de ldb1 adopta una conformación extendida, estirada a lo largo de la cara del dominio LIM [Fig. 2 (A)] para facilitar la encuadernación.

Detalles estructurales de los dominios LIM y sus complejos asociados de enlace. (A) Representación de cinta de la estructura cristalina del complejo LMO4 (verde) -ldb1 (magenta) (código PDB: 1RUT), donde el terminal C de LMO4 está vinculado al terminal N de Ldb1 mediante un enlazador GGSGGSGGSGG (11aa) . La línea de puntos azul representa la posible posición de los aminoácidos faltantes del enlazador. (B) Estructura de RMN del complejo Lhx3 (verde) -ldb1 (magenta) (código PDB: 2JTN), donde el terminal C de ldb1 está vinculado al terminal N de Lhx3 usando un enlazador GGSGGHMGSGG (11aa) (azul oscuro). Los iones Zn 2+ se muestran como esferas naranjas.

Asimismo, las proteínas LIM-HD tienden a ser insolubles e inestables. Hay 12 proteínas de homeodominio LIM de mamíferos que constan de seis pares de parálogos, que a menudo tienen patrones de expresión y funciones superpuestos. Dos de estos pares parálogos son la proteína homeobox LIM 3 y 4 (Lhx3 y Lhx4) y los islotes-1 y -2 (Isl1 e Isl2). Cuando se expresan en bacterias, los dominios LIM de Lhx3 y Lhx4 tienden a agregarse y son en gran parte insolubles. La vinculación de un compañero de interacción, como Isl1 o ldb1, a los dominios LIM puede prevenir esta agregación y permitir la producción de complejos solubles unidos 81 [Fig. 2 (B)]. Desde entonces, se han resuelto varias estructuras de dominio LIM (Tabla I) explotando la misma técnica. 23, 29, 30, 45-50 La Figura 2 (A, B) muestra la interacción entre lbd1 y los diferentes dominios LIM. Estas estructuras se resolvieron mediante técnicas de rayos X y RMN. La asignación de la columna vertebral mediante experimentos de RMN para el enlazador rico en Gly reveló que el enlazador existe como una bobina aleatoria. 47

Complejo PXR-LBD y SRC-1

El receptor X de Pregnane (PXR) es un receptor xenobiótico y un factor de transcripción inducible por ligando que participa en la regulación de las enzimas y transportadores metabolizadores de fármacos. PXR contiene dos dominios: un dominio de unión a ADN (DBD) altamente conservado en el extremo N-terminal y un dominio de unión a ligando (LBD) más divergente en el extremo C-terminal. El LBD de PXR participa en el reconocimiento de ligandos y también interactúa con proteínas coactivadoras. PXR es una proteína inestable y existe como un complejo con su correpresor. La unión del ligando desplaza al correpresor por un coactivador, el activador del receptor de esteroides 1 (SRC-1). Estudiar la interacción entre PXR-LBD y SRC-1 es importante para comprender el mecanismo de los efectos transcripcionales mediados por ligandos. Inicialmente se utilizó un sistema de expresión dual para caracterizar esta unión, pero dio como resultado la producción de proteínas inestables y una estequiometría de SRC-1 a PXR de menos de 1: 1. Watkins et al. PXR purificado usando el dominio SRC-1 y luego combinado este PXR con un péptido que interactúa con SRC-1 para formar un complejo y determinar la estructura cristalina (PDB: 1NRL). 82 Encontraron que el C-terminal de PXR se encuentra cerca del N-terminal de SRC-1, a una distancia de 18 Å, lo que requeriría al menos cinco aminoácidos para unir estas proteínas. Por lo tanto, el péptido SRC-1 se fusionó al extremo C-terminal del PXR-LBD usando enlazadores de varias longitudes como S GGG SSHS, S GGSGG SSHS y S GGSGGSGG SSHS (las secuencias subrayadas son el enlazador añadido, las regiones flanqueantes son del proteínas que interactúan), con la mayoría de los cristales obtenidos con el enlazador 51 rico en Gly de 10 aminoácidos (Fig.3).

Estructura cristalina del dominio de unión al ligando del receptor Pregnane X (PXR-LBD) y el activador del receptor de esteroides 1 (SRC-1). Representación de cinta del complejo PXR-LBD (verde): péptido que interactúa con SRC-1 (magenta), donde el terminal C de PXR-LBD se une mediante un enlazador GGSGG (5aa) al extremo N del péptido que interactúa con SRC-1 (Código PDB: 3CTB). La línea de puntos azul muestra las posibles posiciones de los aminoácidos faltantes del enlazador.

Enlazadores para atrapar interacciones transitorias proteína-proteína

Varios eventos biológicos clave están dictados por interacciones proteína-proteína, la mayoría de las cuales son transitorias y débiles. Atrapar una interacción débil o transitoria para estudios estructurales siempre es un desafío, y los enlazadores flexibles ricos en Gly han demostrado ser útiles en estos casos, por ejemplo, atrapar reacciones de disociación rápida, como el reconocimiento de péptidos unidos a moléculas de MHC por TCR la interacción entre un fosfoproteína y una proteína de la nucleocápside del paramixovirus, además de atrapar interacciones de unión de baja afinidad, como en el caso de g3p-TolA e Histona H3-Asf1 (función anti-silenciamiento 1). Además, en el caso de la calmodulina (CaM) y el dominio de unión a calmodulina (CBD) de la calcineurina, esta estrategia se ha utilizado para atrapar una proteína no estructurada que adquiere una estructura secundaria al unirse con su pareja. Este amplio uso de enlazadores se analiza brevemente en las siguientes secciones.

Receptor de células T, péptidos y complejos MHC de clase II

Los receptores de células T (TCR) se encuentran en la superficie de los linfocitos T y reconocen los antígenos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Cuando el TCR interactúa con un antígeno y MHC, se activa para mejorar la respuesta inmunitaria. Sin embargo, el estudio de estas interacciones ha resultado difícil en el pasado debido a una afinidad muy baja entre el TCR y la molécula de péptido / MHC. Los estudios cinéticos también indicaron una asociación lenta y una disociación rápida, lo que dificultó la captura de esta interacción transitoria para estudios posteriores. 75, 83 Por lo tanto, para estabilizar el complejo TCR / péptido / MHC para la cristalización, el péptido antigénico se unió covalentemente utilizando un enlazador rico en Gly en el extremo N-terminal de la cadena β de la molécula MHC (ver también la sección de complejos MHC clase II-péptido ) este enlazador ayudó a mediar en la formación de un complejo ternario estable de TCR-péptido-antígeno-molécula MHC. 52-54 Se mostró otra forma de estabilizar este complejo usando un polipéptido de ocho aminoácidos (GGSGGGGG) para unir el péptido antigénico y el extremo N de la cadena β variable de TCR. 55-58 La estructura general de las moléculas TCR-péptido-MHC y MHC-péptido-TCR no mostró ninguna diferencia en las regiones de unión de las moléculas MHC y TCR usando ambos métodos [Fig. 4 (A, B)] así, la estructura pudo resolverse como un complejo ternario. La Tabla I describe los diversos complejos ternarios TCR-péptido-MHC que se resolvieron usando estos métodos.

Estructuras cristalinas de diferentes complejos MHC molécula-péptido-receptor de células T (TCR). (A) Representación de cinta del complejo TCR D10 (verde) -hen huevo CA péptido (amarillo) -MHC Clase II IA k (magenta) (código PDB: 1D9K), donde el extremo C-terminal del péptido CA está unido al N -termino de la cadena β del MHC clase II IA k usando un enlazador GGGGSLVPRGSGGGGS (16aa). Una vista interactiva está disponible en la versión electrónica del artículo. (B) Representación de cinta de TCR HA 1.7 (verde) -Péptido de hemaglutinina (HA) (amarillo) -MHC molécula HLA-DR1 (magenta) complejo (código PDB: 1FYT), donde el extremo C-terminal del péptido HA está unido a el N-terminal de la cadena β variable del TCR HA 1.7 usando un enlazador GGSGGGGG (8aa). La línea de puntos azul muestra las posibles posiciones de los aminoácidos faltantes del enlazador. Una vista interactiva está disponible en la versión electrónica del artículo. PRO2206 Figura 4a PRO2206 Figura 4b

Complejo fosfoproteína-proteína nucleocápsida

Dentro del virión de la familia de virus paramixovirus, la proteína nucleocápside (N) empaqueta el ARN genómico en un complejo de proteína-ARN helicoidal conocido como nucleocápside. Se utiliza como plantilla para la transcripción de ARNm por una ARN polimerasa viral, que consta de dos componentes: la proteína grande y la fosfoproteína (P). Mientras que la proteína grande participa en las actividades catalíticas de la polimerasa, la fosfoproteína participa en la unión de la polimerasa a la nucleocápside a través de su región C-terminal (459-507). El sitio de unión de la fosfoproteína se ha cartografiado en el extremo C-terminal (486–505) de la proteína nucleocápside. 84 Los estudios cinéticos mostraron que se trata de una reacción de asociación rápida, con una afinidad de unión débil. Por tanto, para estabilizar este complejo, el extremo C de la proteína P se unió usando un enlazador rico en Gly y Ser (GSGSGSGS) al extremo N de la proteína N, y el complejo enlazado se cristalizó. Esta estructura mostró un empaquetamiento antiparalelo de la hélice de la proteína N [Fig. 5 (A)]. Sin embargo, el ángulo entre la hélice de la proteína N y la hélice final de la proteína P sugiere que podría ser una interacción intermolecular entre las proteínas P y N en lugar de una interacción intramolecular. 14

Detalles estructurales de interacciones transitorias proteína-proteína utilizando enlazadores ricos en Gly. (A) Representación en cinta de la estructura cristalina de la fosfoproteína (P457–507) de la polimerasa paramixoviral (verde) -proteína nucleocápsida (N486–505) (magenta), donde el C-terminal de P457–507 está enlazado usando un enlazador GSGSGSGS (8aa) al N-terminal de la proteína de la nucleocápsida (N486–505) (Código PDB: 1T6O).El péptido que interactúa (magenta) era de la molécula adyacente relacionada con la simetría (cian). (B) Representación de cinta del dominio N1 de g3p (magenta): dominio D3 del complejo TolA (verde), donde el extremo C-terminal de g3p se une mediante un enlazador GGGSEGGGSEGGGSEGGG (18aa) al extremo N-terminal de TolA (código PDB) : 1TOL). (C) Representación en forma de cinta de la función anti-silenciamiento 1 (Asf1 verde) - hélice α3 del complejo Histona H3 (magenta) (código PDB: 2IDC). Los aminoácidos enlazadores (AAGAATAA (8aa)) no estaban presentes en el pdb excepto por los dos primeros residuos Ala. La posición predicha del enlazador se muestra como una línea punteada azul en todos los paneles.

Complejo Ribosomes-SRP-FtsY

Escherichia coli La partícula de reconocimiento de señales (SRP) consta de una proteína (Ffh) y ARN 4.5S. Ffh y FtsY (receptor de SRP) constan de un dominio NG, un dominio GTPasa G y un dominio N. Se requiere una asociación entre SRP y FtsY a través del dominio NG para el suministro de complejos de cadena naciente de ribosoma a la membrana, y una activación de GTPasa recíproca coordina la transferencia de la secuencia señal al translocón. 59 Las asociaciones de SRP y FtsY implican una serie de pasos independientes y dependientes de GTP, y forman un complejo relativamente inestable que se visualiza mediante crio-EM. Sin embargo, la interacción entre Ffh y FtsY se estabiliza mediante la fusión del extremo C-terminal de FtsY con el extremo N-terminal de Ffh mediante un enlazador rico en Gly y Ser de 31 residuos, produciendo una construcción de cadena sencilla (scSRP). 59 El scSRP de cadena sencilla se comporta de manera similar a un SRP y FtsY no ligados, y se une a los ribosomas de manera eficiente, sin alterar la actividad de GTPasa. Se describió así la estructura crio-EM de scSRP unida al ribosoma. 59

Complejo g3p-TolA

Los fagos Ff se utilizan como herramienta de selección al mostrar proteínas y péptidos en la superficie del fago mediante fusión genética con proteínas menores del gen 3 de la cubierta (g3p). g3p consta de tres dominios (N1, N2 y CT) conectados entre sí mediante enlazadores naturales y flexibles ricos en Gly. Infección por fagos de E. coli progresa por la interacción entre el dominio N2 y la punta de un pilus F, con el pilus retraído por un mecanismo desconocido. 85 En esta coyuntura, el dominio N1 interactúa con el dominio C-terminal (D3) de la proteína de membrana integral TolA, una interacción que no se comprende claramente y conduce a la entrada del genoma del fago en el citoplasma bacteriano. Para comprender mejor el mecanismo de infección de la célula huésped por fagos, se requirió la interacción entre el dominio N1 de g3p y el dominio D3 de TolA. 6 Sin embargo, la afinidad entre estos dos dominios es débil. 86 Por lo tanto, un enlazador rico en Gly ((G3SE)3GRAMO3) se generó para fusionar el C-terminal del dominio N1 de g3p y el N-terminal del dominio D3 de TolA. Un enlazador largo y flexible estaba naturalmente presente entre los dominios N1 y N2 de g3p y, por lo tanto, el uso de un enlazador largo entre el dominio N1 de g3p y el dominio D3 de TolA no impuso ninguna restricción [Fig. 5 (B)].

Complejo de histona H3-Asf1

La estructura y organización de la cromatina es importante durante las diversas etapas del ciclo celular. Los pasos iniciales de la organización de la cromatina implican la deposición de un (H3 / H4)2 heterotetramer en el ADN. Asf1 (función anti-silenciamiento 1) es una de las varias histonas chaperonas involucradas en esta deposición. Los experimentos de RMN y de dos híbridos han demostrado que el extremo C de la hélice α3 de la histona de levadura H3 interactúa con Asf1, 87, 88, pero esta interacción es débil. 87 Por lo tanto, para obtener un complejo estable, la hélice α3 de la histona H3 se unió usando un enlazador rico en alanina (AAGAATAA) a Asf1 60 [Fig. 5 (C)]. Hasta donde sabemos, este es el único caso en el que se utilizó un enlazador rico en alanina.

Complejo de CaM-calcineurina CBD

Se adoptó un enfoque similar para estudiar la estructura compleja de la calmodulina (CaM) y el dominio de unión a la calmodulina (CBD) de la calcineurina. La calcineurina es una proteína fosfatasa de serina / treonina dependiente de CaM que participa en varias vías de señalización. 89 El CBD de la calcineurina se desordena en gran medida en ausencia de CaM y adquiere una estructura secundaria tras su interacción con CaM. 90 Para facilitar la cocristalización del complejo peptídico CaM-CBD, el extremo C-terminal de CaM se unió al extremo N-terminal del péptido CBD utilizando un enlazador Gly de cinco aminoácidos (GGGGG). 61 Posteriormente, el mismo grupo determinó la estructura cristalina del péptido CaM-CBD mediante co-cristalización en ausencia de un enlazador (PDB: 2R28) y encontró que las estructuras del péptido CaM-CBD con y sin enlazador eran las mismas (Fig. 6) este resultado demostró que la presencia del enlazador flexible rico en Gly no frenaba las interacciones entre CaM y el péptido CBD. 91

Similitudes estructurales entre complejos enlazados y no enlazados de Calmodulina y el dominio de unión de Calcineurina calmodulina (CBD). (A) Representación de cinta del complejo Calmodulin (verde) -CBD del complejo Calcineurin (magenta), donde el C-terminal de Calmodulin se une mediante un enlazador GGGGG (5aa) al N-terminal del Calcineurin CBD (código PDB: 2F2P) . La posición predicha del enlazador se muestra como una línea punteada azul. (B) Representación en cinta del complejo Calmodulina (verde) -CBD del complejo Calcineurina (cian), generado por co-cristalización (código PDB: 2R28). Se encontró que ambas estructuras eran similares. Los iones Ca 2+ se muestran como esferas naranjas.

Enlazadores para retener la dimerización

Los dímeros funcionales se generan fusionando dos monómeros a través de un enlazador rico en Gly y, a menudo, participan en diversas actividades enzimáticas. La proteasa del VIH-1 (VIH-PR) y otras proteasas retrovirales son moléculas diméricas que constan de dos subunidades idénticas. Las estructuras cristalinas de HIV-PR han demostrado que la interfaz dímera de la proteasa contiene las hebras amino- y carboxilo-terminales de cada subunidad monomérica. 92 Este dímero unido proporciona un medio para determinar el efecto de los cambios en una de las dos subunidades sobre la actividad de VIH-PR. 15 Por tanto, se construyó un dímero unido covalentemente de HIV-PR con un enlazador de 5 aminoácidos (GGSSG) que conectaba el extremo C-terminal de un monómero al N-terminal del otro. Este dímero unido covalentemente mostró propiedades enzimáticas muy similares a las del dímero natural y se encontró que era más estable que el dímero natural de VIH-PR a pH 7,0, donde el dímero natural se disocia. La Figura 7 (A) muestra un ejemplo de dímero PR de VIH-1 unido covalentemente. Se determinaron las estructuras posteriores usando varios mutantes del dímero unido a la PR del VIH y las estructuras del dímero unido a la PR del VIH en presencia de péptidos sustrato como se muestra en la Tabla I. 62-70

Estructura cristalina de dímeros unidos covalentemente. (A) Representación de cinta del dímero de proteasa (PR) del VIH-1 unido covalentemente (código PDB: 1HPX), donde el extremo C-terminal de un monómero (magenta) está vinculado al extremo N-terminal de otro (verde) usando un GGSSG ( 5aa) enlazador (mostrado como una línea de puntos azul) en presencia del compuesto inhibidor de proteasa, KNI-272 (representado como barras de color azul claro). (B) Representación de cinta del dímero de transtiretina unido covalentemente (código PDB: 1QWH), donde el extremo C-terminal de un monómero (magenta) está vinculado al extremo N-terminal de otro (verde) usando un enlazador GSGGGTGGGSG (11aa). Los aminoácidos faltantes del enlazador se muestran como una línea punteada azul.

De manera similar, se sabe que la transtiretina (TTR), un portador de la hormona tiroidea, tiroxina y la proteína de unión del holo-retinol, forma un tetrámero, con dos subunidades que constan cada una de un dímero. Las enfermedades por amiloide TTR se deben al plegamiento incorrecto, la agregación y la deposición de TTR de tipo salvaje en el tejido cardíaco y otras mutaciones desestabilizadoras que hacen que la deposición de TTR sea propensa en una variedad de tejidos. La disociación limitante de la velocidad del tetrámero en sus dos subunidades es necesaria para la formación de fibrillas amiloides. 93 Se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto de unir estas subunidades que interactúan estrechamente sobre la estabilización cinética del tetrámero. Una construcción anclada (TTR-GSGGGTGGGSG-TTR)2 se generó para estabilizar el tetrámero [Fig. 7 (B)]. El complejo enlazado era muy estable y también estructural y funcionalmente similar a la TTR de tipo salvaje. Además, se informó que la urea no pudo desnaturalizar el dímero ligado mientras que el tratamiento con clorhidrato de guanidina pudo desnaturalizar el dímero ligado. Los autores sugieren que el complejo ligado es cinéticamente, en lugar de termodinámicamente, estable. 71 Este estudio también mostró que unir dos subunidades puede reducir drásticamente la disociación del tetrámero.

Enlazador para fusionar dominios dentro de una proteína

En el sistema nervioso de los mamíferos, la transmisión sináptica rápida entre las células nerviosas se lleva a cabo principalmente por los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluR), una clase de proteínas transmembrana que forman canales iónicos activados por glutamato. Están compuestos de dominios de unión de ligandos y de formación de canales distintos, donde se sabe que se unen muchos agonistas y antagonistas sintéticos. 72-74 Los dominios S1 y S2 forman la región de unión del ligando central de estas proteínas. Aunque S1 y S2 forman un núcleo de unión a ligando, están separados por tres segmentos que atraviesan la membrana. Por tanto, para generar un núcleo de unión a ligando, S1 y S2 se unieron covalentemente (Fig. 8). Para los estudios estructurales del dominio de unión al ligando, un conector dipéptido Gly-Thr fue suficiente para unir covalentemente los dominios S1 y S2 del núcleo de unión al ligando de los receptores de glutamato e imitar su afinidad de unión por varios agonistas. 94

Detalles estructurales del núcleo de unión al ligando de los receptores de glutamato (GluR). (A) Representación de dibujos animados de la estructura del dominio de los canales iónicos del receptor de glutamato (GluR). Los dominios S1 y S2 se enlazan utilizando un péptido GT para generar un núcleo de unión de ligando para estudios estructurales. (B) Representación de cinta del núcleo de unión del ligando de GluR2, donde el C-terminal de S1 (verde) está vinculado a S2 (magenta) usando un di péptido GT (azul oscuro) en complejo con ácido glutámico (rojo) (código PDB : 1FTJ). El ion Zn 2+ se muestra como una esfera naranja.

Criterios de selección del vinculador

La selección de una secuencia y longitud del enlazador depende de la construcción de proteínas quiméricas funcionales y, por lo tanto, la longitud óptima del enlazador variará caso por caso. De novo El diseño del enlazador tendrá éxito si se conoce aproximadamente el sitio de interacción entre las dos proteínas. Más a menudo, el conocimiento existente de las estructuras complejas homólogas conocidas se utiliza para diseñar enlazadores de una longitud adecuada que imitarán la interacción natural. La distancia real entre el sitio de la interacción y el extremo N o C cercano al que se puede fusionar el socio de unión proporcionará pistas para la de novo diseño de un enlazador o una longitud adecuada. A menudo, las regiones de unión en la superficie de las proteínas pueden mapearse usando varios análisis biofísicos y / o mutacionales 95 y, basándose en estos detalles, pueden diseñarse la longitud y la composición del enlazador. En algunos casos, unir dos proteínas con un enlazador que se supone que promueve una interacción intramolecular de una proteína quimérica puede no ser suficiente. En cambio, puede formar una interacción intermolecular, similar al caso de la fosfoproteína (P459–507) y la proteína nucleocápside (N486–505). 84 Se observó una unión similar en nuestros estudios recientes con CaM y el péptido del motivo Neurogranin IQ, donde las parejas de unión están vinculadas. Notamos que el péptido y la proteína de las moléculas adyacentes interactuaban entre sí (datos no publicados). Nuestros resultados y los resultados de otros muestran claramente que si la longitud del enlazador no es óptima, el socio enlazado se conectará con una molécula adyacente para retener su especificidad e interacciones naturales (interacción intermolecular). Por tanto, los conectores deben tener una longitud óptima para promover interacciones intramoleculares o intermoleculares.

En general, las longitudes mínima y máxima de los enlazadores usados ​​en los estudios revisados ​​aquí fueron entre 2 y 31 aminoácidos (Tabla I), con longitudes de enlazador común de 5 a 11 aminoácidos para estudios estructurales. La longitud del enlazador depende principalmente del sistema en estudio y una comprensión previa de la región de unión puede ayudar a predecir la longitud aproximada del enlazador. Aparte de la longitud del enlazador, la composición también debería optimizarse. No todos los aminoácidos son una elección perfecta para los enlazadores, ya que un cierto grado de flexibilidad e hidrofilia del enlazador son importantes para retener las funciones de los dominios individuales y permitir que las proteínas fusionadas interactúen entre sí. 4 Gly tiene una baja preferencia para formar una hélice α, por lo tanto, la falta de una cadena lateral maximiza la libertad de la conformación de la columna vertebral. 96 Además, Ser y Thr son residuos polares que prefieren interactuar con el solvente que con las proteínas fusionadas. 4 Por tanto, los polipéptidos ricos en Gly, Ser y Thr ofrecen ventajas especiales: (i) libertad de rotación del esqueleto polipeptídico, de modo que los dominios adyacentes pueden moverse libremente entre sí, 44 (ii) solubilidad mejorada, 26 y ( iii) resistencia a la proteólisis. 97 Los ángulos diedros de la columna vertebral de los residuos en los enlazadores son muy variables, es decir, en los gráficos de Ramachandran, ocupan un área significativamente mayor que las hélices α o las láminas β.

Nuestros análisis de la literatura muestran que se han utilizado diversas composiciones de enlazadores para estudios estructurales (Tabla I). En el caso del complejo MHC Clase II-péptido, se utilizaron dos tipos diferentes de enlazadores (con y sin sitio de escisión de trombina), mientras que en el caso del complejo ternario MHC-péptido-TCR, el enlace peptídico se logró mediante dos métodos diferentes (péptido unido a la molécula de MHC o TCR) (Tabla I). En otros estudios estructurales, se utilizaron enlazadores con una composición casi igual de Gly y Ser, como para el complejo de proteína fosfoproteína-nucleocápsida, el complejo ribosomas-SRP-FtsY y el dominio Fat de los complejos de cinasa de adhesión focal. En comparación, para los complejos enlazados del dominio LIM, PXR-LBD, péptido unido a TCR-MHC, g3p-TolA, HIV-1 PR y dímeros covalentes de TTR, se emplearon varias longitudes de enlazadores ricos en Gly y Ser, para los cuales más del 60% de los aminoácidos enlazadores eran Gly. Para los estudios estructurales del complejo CaM-CBD de calcineurina, el estudio integró un enlazador de 5 aminoácidos con todos los residuos de Gly. Por tanto, un enlazador adecuado podría comprender una combinación de aminoácidos de cadena lateral pequeña, tales como Gly y Ser, con un porcentaje global más alto de Gly.

Además de diseñar enlazadores (longitud y composición de aminoácidos), es importante optimizar las condiciones para retener las interacciones entre los socios enlazados. En general, los enlazadores flexibles ricos en Gly no alteran las propiedades de las proteínas a las que están unidos y permiten que se mantenga la interacción natural. Las condiciones optimizadas para la interacción entre los socios vinculados deben ser las mismas que sin el vinculador. Esto debe confirmarse utilizando socios interactivos no vinculados en varios in vitro métodos, tales como inmunoprecipitación o experimentos ITC / SPR.


D7. Química redox y plegamiento de proteínas - Biología

La producción de proteínas recombinantes que contienen disulfuro a menudo requiere plegamiento oxidativo in vitro. Aquí, mostramos que los diselenuros, como el selenoglutatión, catalizan el plegamiento de proteínas oxidativas por O2. En consecuencia, pueden usarse concentraciones sustancialmente más bajas de un tampón redox compuesto de selenoglutatión y la forma tiol del glutatión para lograr la misma velocidad y rendimiento de plegamiento que un tampón redox de glutatión estándar. Además, el bajo pKa de los selenoles extiende el rango de pH para el plegamiento por selenoglutatión a condiciones ácidas, donde el glutatión es inactivo. Aprovechar el poder catalítico de las diselenidas puede allanar el camino para un plegamiento de proteínas oxidativo más eficiente.

Partículas similares a virus como sondas cuantitativas de interacciones proteicas de membrana
  • Sharon Willis,
  • Candice Davidoff,
  • Justin Schilling,
  • Antony Wanless,
  • Benjamin J. Doranz y
  • Joseph Rucker*

Demostramos que las partículas similares a virus que llevan proteínas de membrana conformacionalmente complejas ("lipopartículas") pueden usarse como sondas solubles de interacciones de proteínas de membrana. Para demostrar la utilidad de este enfoque, utilizamos lipopartículas para diferenciar rápidamente la cinética relativa de las interacciones de las proteínas de membrana utilizando tecnología de biosensores ópticos. La técnica se aplica a diversas proteínas de membrana, incluidos los receptores acoplados a proteína G, y se utiliza para clasificar la cinética relativa de casi todos los anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente contra el receptor de quimiocinas CCR5. Estas partículas sirven como sondas versátiles para seleccionar preparaciones de anticuerpos purificados y crudos para determinar la especificidad del receptor, la reactividad del epítopo y la cinética de unión relativa.

Temas actuales
El ancla de glucosilfosfatidilinositol: una estructura compleja de anclaje de membrana para proteínas

Ubicado en el extremo C-terminal de muchas proteínas eucariotas, el anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) es una modificación postraduccional que ancla la proteína modificada en la valva exterior de la membrana celular. El anclaje GPI es una estructura compleja que comprende un enlazador de fosfoetanolamina, un núcleo de glucano y una cola de fosfolípidos. Las proteínas ancladas a GPI son estructural y funcionalmente diversas y desempeñan funciones vitales en numerosos procesos biológicos. Si bien se han caracterizado varias proteínas ancladas a GPI, las funciones biológicas del anclaje de GPI aún no se han dilucidado a nivel molecular. Esta revisión analiza la diversidad estructural del ancla de GPI y sus supuestas funciones celulares, incluida la participación en la partición de la balsa lipídica, la transducción de señales, la orientación a la membrana apical y la patogénesis de la enfermedad priónica. Destacamos específicamente los estudios en los que se han empleado anclas y análogos de GPI sintetizados químicamente para estudiar las funciones de esta modificación postraduccional única.

Diversidades estructurales y funcionales entre los miembros de las familias de acompañantes HSPB, HSPH, HSPA y DNAJ humanos
  • Michel J. Vos,
  • Jurre Hageman,
  • Serena Carra y
  • Harm H. Kampinga*

Las proteínas de choque térmico (HSP) se identificaron originalmente como proteínas sensibles al estrés necesarias para hacer frente a los estreses proteotóxicos. Además de proteger contra el estrés y posibles objetivos para retrasar la progresión de las enfermedades por plegamiento de proteínas, también se ha demostrado que las mutaciones en las chaperonas causan enfermedades (chaperonopatías). Está comenzando a emerger el mecanismo de acción de las HSP “clásicas”, inducibles por estrés, que sirven como chaperonas moleculares que evitan la agregación irreversible de proteínas mal plegadas relacionadas con enfermedades o con estrés desplegado. Sin embargo, el genoma humano codifica varios miembros para cada una de las diversas familias de HSP que no están relacionadas con el estrés pero que contienen dominios conservados. Aquí, hemos revisado la literatura existente sobre los diversos miembros de las familias humanas HSPB (HSP27), HSPH (HSP110), HSPA (HSP70) y DNAJ (HSP40). Además de las homologías estructurales y funcionales, se pueden encontrar varias diversidades entre miembros y familias que no solo apuntan a diferencias en la especificidad del cliente, sino que también parecen servir para el tratamiento y procesamiento diferencial del cliente. Está lejos de entenderse cómo se determina la especificidad del sustrato y el procesamiento del cliente.

Publicaciones aceleradas
La activación de la luz de la proteína LOV Vivid genera un dímero de intercambio rápido

El fotorreceptor fúngico Vivid (VVD) juega un papel importante en la adaptación de las respuestas a la luz azul en Neurospora crassa. VVD, una proteína LOV (luz, oxígeno, voltaje) de unión a FAD, acopla la formación de aductos de cisteinilo inducida por la luz en el anillo de flavina con cambios conformacionales en la tapa N-terminal (Ncap) del dominio PAS de VVD. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la ultracentrifugación en equilibrio y la dispersión de luz estática y dinámica muestran que estos cambios conformacionales generan un dímero VVD de intercambio rápido, con un radio hidrodinámico expandido. Un giro β N-terminal de tres residuos que asume dos conformaciones diferentes en una estructura cristalina de una variante de VVD C71V es esencial para la dimerización en estado de luz. Las sustituciones de residuos en una bisagra crítica entre el núcleo de Ncap y PAS pueden inhibir o mejorar la dimerización, mientras que una sustitución de Tyr por Trp en la interfaz Ncap-PAS estabiliza el dímero en estado de luz. La reticulación a través de disulfuros modificados indica que el dímero en estado claro difiere considerablemente del dímero en estado oscuro que se encuentra en las estructuras cristalinas de VVD. Estos resultados verifican el papel de los cambios conformacionales de Ncap en la activación de la respuesta fótica de N. crassa e indican que la homo- o heterodimerización de LOV-LOV puede ser un mecanismo para regular la expresión génica activada por luz.

Detección cuantitativa y en tiempo real de la secreción de mensajeros químicos de plaquetas individuales

En este estudio se utilizaron métodos microelectroquímicos de fibra de carbono para medir los eventos exocitóticos individuales de secreción de serotonina e histamina de plaquetas de conejo lavadas. La liberación cuántica de serotonina se caracterizó cuantitativamente con una concentración de serotonina de gránulos δ de 0,6 M y un tiempo de secreción de 7 ms. Además, la osmolaridad extracelular influye en el tamaño cuántico, provocando aumentos de tamaño cuántico en condiciones hipotónicas, presumiblemente debido al influjo de serotonina citosólica en la región halo de los gránulos δ.

Artículos
Regulación diversa de la remodelación de cromatina SNF2h por subunidades no catalíticas
  • Xi He,
  • Ventilador de Hua-Ying,
  • Joseph D. Garlick y
  • Robert E. Kingston*

Los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP basados ​​en SNF2h divergen en composición, localización nuclear y función biológica. Tales diferencias han llevado a la hipótesis de que los complejos SNF2h difieren mecánicamente. Una propuesta es que los complejos tienen diferentes interacciones funcionales con el ADN desnudo adyacente al nucleosoma. Hemos utilizado una serie de plantillas con una posición nucleosómica definida y diferentes cantidades y colocación de ADN adyacente para comparar las actividades relativas de los complejos SNF2h y SNF2h. Los complejos hACF, CHRAC, WICH y RSF mostraron diferencias en las interacciones funcionales con estas plantillas, que atribuimos a las diferencias en la subunidad no catalítica. Sugerimos que la capacidad de detectar el ADN adyacente es una propiedad general de los socios de unión de SNF2h y que cada socio proporciona una regulación distinta que contribuye a una función celular distinta.

Diversidad catalítica de ribozimas de cabeza de martillo extendidas

Se construyeron quimeras del tiburón martillo mínimo bien caracterizado 16 y nueve tiburones martillo extendidos derivados de viroides naturales y ARN satélite con el objetivo de evaluar si sus muy diferentes interacciones terciarias periféricas modulan sus propiedades catalíticas. Para cada quimera, se utilizaron tres ensayos diferentes para determinar la tasa de escisión y la fracción de cabeza de martillo de longitud completa en equilibrio y, por lo tanto, deducir las constantes de tasa de escisión elemental (k2) y ligadura (k-2). Las nueve quimeras eran todas más activas que los tiburones martillo mínimos y exhibían una gama muy amplia de propiedades catalíticas, con valores de k2 que variaban en 750 veces y k − 2 en 100 veces. Al menos dos de los tiburones martillo exhibieron una dependencia alterada de los kobs en la concentración de magnesio. Dado que se observa mucha menos diversidad catalítica entre los tiburones martillo mínimos que carecen de las interacciones terciarias, un posible papel de las diferentes interacciones terciarias es modular las propiedades de escisión del tiburón martillo en los viroides. Por ejemplo, las diferentes tasas de escisión y ligación de la cabeza de martillo podrían afectar las concentraciones en estado estacionario de los genomas lineales, circulares y poliméricos en las células infectadas.

Dinámica conformacional del ARN local revelada por la accesibilidad al disolvente 2-aminopurina
  • Jeff D. Ballin,
  • James P. Prevas,
  • Shashank Bharill,
  • Ignacy Gryczynski,
  • Zygmunt Gryczynski y
  • Gerald M. Wilson*

La extinción de acrilamida se usa ampliamente para monitorear la exposición al solvente de las sondas fluorescentes in vitro. Aquí, probamos la utilidad de esta técnica para discriminar estructuras secundarias de ARN local utilizando el análogo de adenina fluorescente 2-aminopurina (2-AP). En condiciones nativas, las accesibilidades a los solventes de la mayoría de los sustratos de ARN marcados con 2-AP se resolvieron mal mediante modelos clásicos de una sola población, en lugar de eso, se requirió un algoritmo de accesibilidad de extintor de dos estados para modelar los cambios dependientes de acrilamida en la fluorescencia de 2-AP en ARN estructurado contextos. La comparación de los parámetros de extinción de 2-AP entre sustratos de ARN estructurados y no estructurados permitió distinguir los efectos de la estructura del ARN local en la exposición al disolvente 2-AP de los efectos del vecino más cercano o de las influencias ambientales en la fotofísica intrínseca de 2-AP. Usando esta estrategia, se encontró que la accesibilidad fraccional de 2-AP para acrilamida (fa) era altamente sensible a la estructura del ARN local. El 2-AP de pares de bases exhibió una accesibilidad relativamente deficiente, lo que coincide con el blindaje extenso de las bases adyacentes. 2-AP en una protuberancia de base única era uniformemente accesible al disolvente, mientras que la accesibilidad fraccionada de 2-AP en un bucle de hexanucleótidos era indistinguible de la de un ARN no estructurado. Sin embargo, estos estudios también proporcionaron evidencia de que el parámetro fa refleja la dinámica conformacional local en el ARN de pares de bases. La dinámica de pares de bases mejorada a temperaturas elevadas se acompañó de valores de fa aumentados, mientras que la restricción de la respiración del ARN local al agregar una abrazadera de par de bases C-G o colocar 2-AP dentro de dúplex de ARN extendidos disminuyó significativamente este parámetro. Juntos, estos estudios muestran que los estudios de extinción de 2-AP pueden revelar características estructurales y dinámicas del ARN local más allá de las que pueden medirse mediante enfoques espectroscópicos convencionales.

La acetilación de H4 suprime los efectos represivos de los N-Termini de las histonas H3 / H4 y facilita la formación de ADN enrollado positivamente

Hemos estudiado el papel de los extremos N de las histonas H3 / H4 en la regulación de los cambios conformacionales que ocurren en H3 / H4 durante su deposición en el ADN por NAP1 (proteína de ensamblaje de nucleosomas 1). La eliminación de los extremos N aumentó considerablemente la conformación de la mano derecha de H3 / H4 según lo ensayado por el aumento de los niveles de espirales positivas que se formaron en el ADN. Los osmolitos, TMAO, betaína, sarcosina, alanina, glicina y prolina en diversos grados facilitaron la formación de espirales positivas. El desnaturalizante, urea (0,6 M), bloqueó los efectos de los osmolitos, provocando una preferencia de H3 / H4 para formar espirales negativas (la conformación zurda). El H3 / H4 acetilado también formó altos niveles de espirales positivas, y se propone que tanto los osmolitos como la acetilación promueven la formación de una hélice α en los extremos N-terminales. Este cambio estructural puede explicar en última instancia una característica única de la transcripción a través de nucleosomas, es decir, que H2A / H2B tiende a ser más móvil que H3 / H4. Mediante el uso de combinaciones de H3 y H4 que se acetilaron o se eliminaron los extremos N, también se determinó que el extremo N de H4 es el principal responsable de reprimir la formación de espirales positivas. Los análisis de gradiente adicionales indican que NAP1 establece un equilibrio con los complejos de ADN H3 / H4. Este equilibrio facilita una saturación de histonas del ADN, un estado único que promueve la conformación de la mano derecha. NAP1 persiste en la unión de los complejos a través de la interacción con el N-terminal de H3, que puede ser un mecanismo para la remodelación posterior del nucleosoma durante la transcripción y replicación.

La estructura de RMN y la dinámica del inhibidor de carboxipeptidasa de garrapatas de dos dominios revelan flexibilidad en su forma libre y rigidez al unirse a la carboxipeptidasa B humana
  • David Pantoja-Uceda,
  • Joan L. Arolas,
  • Pascal García,
  • Eva López-Hernández,
  • Daniel Padró,
  • Francesc X. Avilés* , y
  • Francisco J. Blanco*

La estructura del inhibidor de la carboxipeptidasa de garrapatas (TCI) y su dinámica de la columna vertebral, libre y en complejo con la carboxipeptidasa B humana, se han determinado mediante espectroscopía de RMN. Aunque el TCI libre tiene el mismo pliegue general que el observado en las estructuras cristalinas de sus complejos con los tipos A y B de metalocarboxipeptidasa, existen diferencias estructurales en el enlazador entre los dos dominios. Los residuos de enlazador tienen mayor flexibilidad que los dominios globulares y los residuos C-terminales son muy flexibles en TCI libre. Tras la formación de un complejo con carboxipeptidasa B, el TCI se vuelve más rígido, especialmente a nivel del enlazador y en el extremo C-terminal, que se inserta en el surco del sitio activo de la carboxipeptidasa. Los tipos de cambio de disolvente de los protones de amida de la columna vertebral también muestran una fuerte reducción de la dinámica local de TCI y una estabilización de su estructura tras la formación del complejo. Los hallazgos son consistentes con un mecanismo de reconocimiento que involucra principalmente el dominio C-terminal, que ajusta su conformación y la del enlazador, facilitando así la estabilización compleja mediante interacciones adicionales entre el dominio N-terminal y un exosito de la carboxipeptidasa. Esta adaptabilidad permite a TCI ajustar su conformación global para una interacción adecuada con distintos tipos de carboxipeptidasas mediante un mecanismo de ajuste inducido. Nuestros resultados proporcionan nueva información sobre la relación estructura-función y la estabilidad de una molécula con posibles aplicaciones biomédicas en la terapia trombolítica. Además, la plasticidad del TCI lo convierte en un soporte ideal para desarrollar inhibidores más fuertes y / o más específicos dirigidos a modular la actividad de las metalocarboxipeptidasas.

Reversibilidad microscópica del plegamiento de proteínas en simulaciones de dinámica molecular del homeodominio grabado

El principio de reversibilidad microscópica establece que, en equilibrio, el número de moléculas que entran en un estado por una ruta determinada debe ser igual a las que salen del estado por la misma ruta en condiciones idénticas o, en términos estructurales, que las conformaciones a lo largo de las dos rutas son las mismas. Ha habido alguna evidencia indirecta que indica que el plegamiento de proteínas es un proceso de este tipo, pero ha habido pocos hallazgos concluyentes. En este estudio, realizamos simulaciones de dinámica molecular de una proteína de plegamiento y despliegue ultrarrápidos a su temperatura de fusión para observar, átomo por átomo, las rutas que siguió la proteína a medida que se desplegaba y plegaba dentro de una trayectoria continua. En un total de 0,67 µs de simulación en agua, encontramos seis eventos de desnaturalización transitorios cerca de la temperatura de fusión (323 y 330 K) y un evento de replegamiento adicional después de un evento de despliegue identificado previamente a una temperatura alta (373 K). En cada caso, se identificaron conjuntos de estados de transición de despliegue y replegamiento, y coincidieron bien con el experimento sobre la base de una comparación de los valores S y Φ. Sobre la base de varias propiedades estructurales, estos 13 conjuntos de estados de transición coincidieron muy bien entre sí y con cuatro estados de transición previamente identificados a partir de simulaciones de desnaturalización a alta temperatura. Por lo tanto, no solo los estados de transición de despliegue y replegamiento eran parte del mismo conjunto, sino que en cinco de los siete casos, la ruta que tomó la proteína a medida que se desplegaba era casi idéntica a la ruta de replegamiento posterior. Estos eventos proporcionan evidencia convincente de que el plegamiento de proteínas es un proceso microscópicamente reversible. En los otros dos casos, los estados de transición de plegado y desplegado fueron notablemente similares entre sí, pero los caminos se desviaron.

Se encuentra que el colesterol reside en el centro de una membrana lipídica poliinsaturada

Anteriormente, informamos estudios de difracción de neutrones sobre la profundidad del colesterol en bicapas de fosfatidilcolina (PC) con cantidades variables de insaturación de la cadena de acilo [Harroun, T. A., et al. (2006) Biochemistry 45, 1227-1233]. Se encontró que el centro de masa de los sitios deuterados 2,2,3,4,4,6-D6 en la etiqueta del esterol residía a 16 Å del centro de la bicapa en 1-palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina (16: 0- 18: 1PC), 1,2-dioleoilfosfatidilcolina (18: 1-18: 1PC) y 1-estearoil-2-araquidonilfosfatidilcolina (18: 0-20: 4PC). Esta ubicación coloca el grupo hidroxilo del colesterol cerca de la superficie de la membrana, indicativo de la molécula en su orientación "vertical" comúnmente entendida. Sin embargo, para membranas dipoliinsaturadas 20: 4-20: 4PC, el marcador, por tanto el grupo hidroxilo, se encontró secuestrado en el centro de la bicapa. Atribuimos el cambio de ubicación al alto nivel de desorden de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) que es incompatible con la proximidad al radical esteroide rígido en su orientación vertical habitual. De ese estudio, la pregunta sin resolver era si la molécula estaba invertida o acostada con respecto al plano de la membrana, en el medio de la bicapa. Hemos seguido esos resultados con experimentos de neutrones adicionales que emplean [25,26,26,26,27,27-D7] colesterol, un análogo deuterado marcado en la cola. Estas mediciones de difracción muestran inequívocamente que el colesterol se encuentra plano en el medio de las bicapas 20: 4-20: 4PC.

Caracterización de una citolisina dependiente del colesterol estreptocócico con un dominio de lectina específico de Lewis y y b
  • Stephen Farrand,
  • Eileen Hotze,
  • Paul Friese,
  • Susan K. Hollingshead,
  • David F. Smith,
  • Richard D. Cummings,
  • George L. Dale y
  • Rodney K. Tweten*

Las citolisinas dependientes del colesterol (CDC) son una gran familia de toxinas formadoras de poros que a menudo exhiben distintos cambios estructurales que modifican su actividad formadora de poros. Se caracterizó un factor de agregación plaquetaria soluble de Streptococcus mitis (Sm-hPAF) y se demostró que era un CDC funcional con un dominio de lectina de unión a fucosa amino-terminal. Sm-hPAF, o lectinolisina (LLY) como se renombra en este documento, está más estrechamente relacionada con los CDC de Streptococcus intermedius (ILY) y Streptococcus pneumoniae (neumolisina o PLY). El gen LLY se identificó en cepas de S. mitis, S. pneumoniae y Streptococcus pseudopneumoniae. LLY induce cambios dependientes de los poros en las propiedades de dispersión de la luz de las plaquetas que imitan los inducidos por la agregación plaquetaria, pero no induce la agregación plaquetaria. Los monómeros LLY forman el complejo de poros de membrana homooligomérico grande típico observado para los CDC. La actividad formadora de poros de LLY en plaquetas está modulada por el dominio de lectina amino-terminal, una estructura que no está presente en otros CDC. El análisis de microarrays de glicanos mostró que el dominio de lectina es específico para glicanos difucosilados dentro de los antígenos Lewis b (Leb) y Lewis y (Ley). El sitio de unión a glucanos está ocluido en el monómero soluble de LLY pero aparentemente está expuesto después de la unión celular, ya que aumenta significativamente la actividad formadora de poros de LLY de una manera dependiente de glucanos. Por tanto, LLY representa una nueva clase de CDC cuyo mecanismo de formación de poros está modulado por un dominio de unión a glucanos.

Actividad monooxigenasa de Pulpo vulgaris Hemocianina
  • Kenji Suzuki,
  • Chizu Shimokawa,
  • Chiyuki Morioka y
  • Shinobu Itoh*

Se han purificado la hemocianina de Octopus vulgaris (Ov-Hc) y una de sus unidades funcionales mínimas (Ov-g), y se han examinado en detalle sus características espectroscópicas y su actividad monooxigenasa (fenolasa). Las formas oxi de Ov-Hc y Ov-g son estables en tampón borato 0,5 M (pH 9,0) incluso en presencia de una alta concentración de urea a 25 ° C ∼90 y ∼75% de (μ-η2: Las especies de η2-peroxo) dicopper (II) de Ov-Hc y Ov-g, respectivamente, permanecieron sin cambios después del lavado con gas argón (Ar) de las soluciones de muestra durante 1 h. La actividad catalítica de Ov-g en la reacción de oxigenación (reacción multivuelco) de 4-metilfenol (p-cresol) a 4-metil-1,2-dihidroxibenceno (4-metilcatecol) fue mayor que la de Ov-Hc, y su La actividad catalítica se aceleró aún más mediante la adición de urea. El análisis cinético del efecto isotópico del deuterio y el análisis de Hammett utilizando una serie de derivados de fenol en condiciones anaeróbicas (reacción de recambio único) han indicado que la reacción de monooxigenación de fenoles a catetoles por la especie peroxo de oxihemocianina procede a través de un mecanismo de sustitución aromática electrófila como en el caso de tirosinasa. El efecto de la urea sobre las funciones redox de la oxihemocianina se discute sobre la base del análisis espectroscópico y los estudios de reactividad.

El análisis termodinámico del desplegamiento inducido por desnaturalizantes de la proteína HodC69S apoya un mecanismo de tres estados
  • Kristian Boehm,
  • Jessica Guddorf,
  • Alexander Albers,
  • Tadashi Kamiyama,
  • Susanne Fetzner y
  • H.-J. Hinz*

Parámetros de estabilidad termodinámica y mecanismo de despliegue de equilibrio de His6HodC69S, un mutante de 1H-3-hidroxi-4-oxoquinaldina 2,4-dioxigenasa (Hod) que tiene un intercambio de Cys a Ser en la posición 69 y una etiqueta de hexahistidina N-terminal (His6HodC69S) , se han derivado de estudios de desplegamiento isotérmico utilizando clorhidrato de guanidina (GdnHCl) o urea como desnaturalizantes. Los cambios conformacionales se controlaron siguiendo los cambios en el dicroísmo circular (CD), la fluorescencia y la dispersión dinámica de la luz (DLS), y las curvas de transición resultantes se analizaron sobre la base de un modelo secuencial de tres estados N = I = D. los cambios se han correlacionado con la actividad catalítica y se ha establecido la contribución a la estabilidad del enlace disulfuro entre los residuos C37 y C184 en la proteína nativa. Un resultado destacado del presente estudio es el hallazgo de que, independientemente del método utilizado para desnaturalizar la proteína, el mecanismo de despliegue siempre comprende tres estados que pueden caracterizarse por, dentro de los límites de error, conjuntos idénticos de parámetros termodinámicos. Las desviaciones aparentes del despliegue de tres estados pueden ser racionalizadas por la incapacidad de una sonda espectroscópica para discriminar claramente entre conjuntos nativos, intermedios y desplegados. Este fue el caso de la curva de despliegue de urea controlada por CD.

Identificación de un enlazador funcional mínimo en la topoisomerasa I humana mediante intercambio de dominio con Cre Recombinase
  • Rikke de Frøhlich,
  • Sissel Juul,
  • Maria Bjerre Nielsen,
  • María Vinther,
  • Christopher Veigaard,
  • Marianne Smedegaard Hede y
  • Félicie Faucon Andersen*

Las formas celulares de las topoisomerasas de tipo IB se distinguen de sus contrapartes virales y de las tirosina recombinasas con las que están estrechamente relacionadas por tener dominios N-terminales y enlazadores bastante extensos. Las funciones y la necesidad de estos dominios aún no se han descifrado por completo.En este estudio, reemplazamos 86 aminoácidos, incluido el dominio enlazador de la topoisomerasa de tipo celular IB, topoisomerasa I humana, con cuatro, seis u ocho aminoácidos de la región de bucle corto correspondiente en la recombinasa Cre. La caracterización in vitro de las quimeras resultantes, denominadas Cropos, revela que seis aminoácidos del bucle del enlazador Cre constituyen la longitud mínima de un enlazador funcional en la topoisomerasa I humana.

Eliminación superior de lesiones de hidantoína en relación con otras bases oxidadas por la ADN glicosilasa humana hNEIL1
  • Nirmala Krishnamurthy,
  • Xiaobei Zhao,
  • Cynthia J. Burrows y
  • Sheila S. David*

La ADN glicosilasa hNEIL1 inicia la reparación por escisión de bases (BER) de una serie diversa de lesiones, incluidas purinas de anillo abierto y pirimidinas saturadas. De estos, las lesiones de hidantoína, guanidinohidantoína (Gh) y los dos diastereómeros de espiroiminodiidantoína (Sp1 y Sp2), han recibido mucha atención recientemente debido a sus estructuras inusuales, alto potencial mutagénico y detección en células. Con el fin de proporcionar información sobre el papel de la reparación, se determinó la eficacia de la escisión por hNEIL1 de estas lesiones de hidantoína en relación con otros sustratos conocidos. Más notablemente, el examen cuantitativo de la especificidad del sustrato con hNEIL1 reveló que las lesiones de hidantoína se extirpan mucho más eficientemente (& gt100 veces más rápido) que los sustratos estándar informados timina glicol (Tg) y 5-hidroxicitosina (5-OHC). Es importante destacar que las reacciones de glicosilasa y β, δ-liasa están estrechamente acopladas de modo que la velocidad de la actividad liasa no influye en la especificidad del sustrato observada. La actividad de hNEIL1 también está influenciada por el socio del par de bases de la lesión, y la eliminación de Gh y Sp es más eficiente cuando se combina con T, G o C que cuando se combina con A. En particular, la eliminación más eficiente se observa con la Gh o Sp emparejados en el contexto fisiológico improbable con T de hecho, esto puede ser una consecuencia de la naturaleza inestable de los pares de bases con T. Sin embargo, la eliminación fácil a través de BER en pares de bases promutagénicos que se forman razonablemente después de la replicación (como Gh · G) puede ser un factor que modula el perfil mutagénico de estas lesiones. Además, hNEIL1 escinde Sp1 más rápido que Sp2, lo que indica que la enzima puede discriminar entre los dos diastereómeros. Esta es la primera vez que se ha demostrado que una BER glicosilasa es capaz de escindir preferentemente un diastereoisómero de Sp. Esto puede ser una consecuencia de la arquitectura del sitio activo de hNEIL1 y la singularidad estructural de la lesión de Sp. Estos resultados indican que las lesiones de hidantoína son los mejores sustratos identificados hasta ahora para hNEIL1 y sugieren que la reparación de estas lesiones puede ser una función crítica de la enzima hNEIL1 in vivo.

Un puente de agua ancla la amina 5- (3-aminopropil) -2′-desoxiuridina atada en el surco principal del ADN próximo al par de bases N + 2 C · G: implicaciones para la formación de la intersección 5′-GNC-3 ′ entre cadenas Enlaces por mostazas de nitrógeno,
  • Feng Wang,
  • Feng Li,
  • Manjori Ganguly,
  • Luis A. Marky,
  • Barry Gold,
  • Martin Egli y
  • Michael P. Stone*

Inserción específica de sitio de 5- (3-aminopropil) -2′-desoxiuridina (Z3dU) y 7-deaza-dG en los dodecámeros 5′-d de Dickerson-Drew (C1G2C3G4A5A6T7T8C9Z10C11G12) -3 ′-d (C13G2014C18G19C16) -3 ′ (llamado DDDZ10) y 5′-d (C1G2C3G4A5A6T7X8C9Z10C11G12) -3 ′ · 5′-d (C13G14C15G16A17A18T19X20C21Z22C23G24) -3 ′ (llamado DDD2 + Z10) (X = 7) -aza mecanismo sugiere subyacente a la formación de enlaces cruzados de ADN entre cadenas N + 2 por mostazas de nitrógeno, por ejemplo, melfalán y mecloretamina. El análisis del dúplex DDD2 + Z10 revela que los cationes anclados en los pares de bases A5 · X20 y X8 · A17 se extienden dentro del surco principal en la dirección 3 ', hacia los sitios de unión de Mg2 + conservados ubicados adyacentes a los pares de bases N + 2 C3 · Z22 y Z10 · C15. Las aguas de puente ubicadas entre las aminas atadas y Z10 o Z22 O6 estabilizan los cationes atados y permiten interacciones con los pares de bases N + 2 sin flexión del ADN. La incorporación de 7-deaza-dG en el dúplex DDD2 + Z10 debilita pero no elimina las interacciones electrostáticas entre las aminas atadas y Z10 O6 y Z22 O6. Los resultados sugieren un mecanismo por el cual los iones de aziridinio N7-dG unidos, las especies activas involucradas en la formación de enlaces cruzados 5′-GNC-3 ′ entre cadenas por mostazas de nitrógeno, modifican la electrostática del surco principal y colocan los iones de aziridinio cerca de el borde de la ranura principal del par de bases N + 2 C · G, lo que facilita la reticulación entre cadenas.

La dispersión de rayos X en solución revela una estructura novedosa de calcodulina complejada con un péptido de dominio de unión de la proteína de la matriz del VIH-1 p17
  • Yoshinobu Izumi* ,
  • Hiroki Watanabe,
  • Noriko Watanabe,
  • Aki Aoyama,
  • Yuji Jinbo y
  • Nobuhiro Hayashi

Las estructuras en solución de los complejos entre la calmodulina saturada de calcio (Ca2 + / CaM) y un dominio de unión a CaM de la proteína de la matriz del VIH-1 p17 se han determinado mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño con el uso de radiación de sincrotrón como una sustancia intensa y estable. Fuente de rayos X. Usamos tres péptidos sintéticos de los residuos 11-28, 26-47 y 11-47 de p17 para demostrar la diversidad de la conformación de unión a CaM. Ca2 + / CaM complejado con los residuos 11-28 de p17 adopta una estructura similar a una mancuerna en una relación molar de 1: 2, lo que sugiere que los dos péptidos se unen a cada lóbulo de CaM, respectivamente. Ca2 + / CaM complejado con los residuos 26-47 de p17 en una relación molar de 1: 1 adopta una estructura globular similar a la estructura de RMN de Ca2 + / CaM unido a M13, que adoptó una estructura globular compacta. En contraste con estos complejos, Ca2 + / CaM se une directamente con ambos sitios de unión a CaM de los residuos 11-47 de p17 en una relación molar de 1: 1, lo que induce una estructura novedosa diferente de las estructuras conocidas previamente reportadas entre Ca2 + / CaM y péptido. . Se construyó un modelo estructural terciario de la nueva estructura utilizando el módulo de biopolímero de Insight II 2000 sobre la base de los datos de dispersión. Los dos dominios de CaM permanecen esencialmente sin cambios tras la complejación. Los movimientos de bisagra, sin embargo, ocurren en un enlazador altamente flexible de CaM, en el que los residuos electrostáticos 74Arg, 78Asp y 82Glu interactúan con residuos electrostáticos N-terminales del péptido (residuos 12Glu, 15Arg y 18Lys). Los residuos ácidos en el dominio N-terminal de CaM interactúan con residuos básicos en una parte central del péptido, permitiendo así que la parte central cambie las conformaciones, mientras que un residuo ácido en el dominio C-terminal interactúa con dos residuos básicos en el dos sitios helicoidales del péptido. La estructura general del complejo adopta una estructura extendida con un radio de giro de 20,5 Å y una distancia entre dominios de 34,2 Å. Por tanto, el complejo se estabiliza principalmente mediante interacciones electrostáticas. Los parches hidrofóbicos de Ca2 + / CaM no son responsables de la unión con los residuos hidrofóbicos en el péptido, lo que sugiere que CaM desempeña un papel para secuestrar el resto de ácido mirístico de p17.

Los trans-Las proteínas de Golgi SCLIP y SCG10 interactúan con la cromogranina A para regular la secreción neuroendocrina
  • Nitish R. Mahapatra ,
  • Laurent Taupenot* ,
  • Maite Courel,
  • Sushil K. Mahata* , y
  • Daniel T. O'Connor*

La secreción de proteínas y péptidos de las células eucariotas tiene lugar por vías tanto constitutivas como reguladas. La secreción regulada puede implicar la interacción de proteínas que actualmente se desconocen. Estudios recientes sugieren un papel importante de la cromogranina A (CHGA) en la vía secretora regulada en las células neuroendocrinas, pero el mecanismo por el cual CHGA entra en la vía regulada, o incluso desencadena la formación de la vía, sigue sin estar claro. En este estudio, utilizamos un enfoque de todo el transcriptoma / proteoma, para descubrir socios de unión para CHGA, mediante el empleo de un método de biblioteca de ADNc de presentación de fagos. Varias proteínas dentro o adyacentes a la vía secretora se detectaron inicialmente como compañeros de unión de CHGA humano recombinante. A continuación, nos centramos en la proteína trans-Golgi SCLIP (STMN3) y su parálogo de estatmina SCG10 (STMN2) para el estudio funcional. Los experimentos de co-inmunoprecipitación confirmaron la interacción de cada una de estas dos proteínas con CHGA in vitro. SCLIP y SCG10 se colocaron en el aparato de Golgi de células cromafines in vivo y compartieron la localización con CHGA mientras transitaba por el Golgi. La regulación a la baja de SCLIP o SCG10 por ARNip sintéticos virtualmente abolió la secreción de células cromafines de una quimera CHGA-EAP transfectada (que expresa CHGA fusionada a un informador enzimático, y traficada a la vía regulada). El ARNip de SCLIP también disminuyó el nivel de secreción de CHGA y SCG2 endógenos, así como la hormona del crecimiento humana transfectada, mientras que el ARNip de SCG10 disminuyó el nivel de secreción regulada de CHGB endógeno. Además, un mutante negativo dominante de SCG10 (Cys22, Cys24 → Ala22, Ala24) bloqueó significativamente la secreción de la quimera CHGA-EAP transfectada. Se observó una disminución en la densidad flotante de los gránulos de cromafina después de la regulación a la baja de SCG10 por ARNip, lo que sugiere la participación de estas estatminas en la formación o maduración de los gránulos. Llegamos a la conclusión de que SCLIP y SCG10 interactúan con CHGA, comparten colocalización parcial en el aparato de Golgi y pueden ser necesarios para el almacenamiento y la liberación de transmisores típicos de las células cromafines.

Base molecular de las interacciones entre los correceptores de la toxina tetánica

La toxina tetánica (TeNT) provoca parálisis espástica a través de la escisión de la proteína 2 de membrana asociada a vesículas (VAMP-2) en neuronas en la unión interneuronal del sistema nervioso central. Mientras que TeNT retrógrado transita desde las terminaciones nerviosas periféricas hasta la unión interneuronal, existe un conocimiento limitado de los receptores neuronales utilizados por la toxina del tétanos para la entrada inicial en las células nerviosas. Estudios anteriores implicaron un correceptor para la entrada de la toxina del tétanos en las neuronas: un bolsillo de unión de gangliósidos y un bolsillo de unión de ácido siálico y que GT1b se unió a cada bolsillo. En este estudio, un ensayo en fase sólida caracterizó la especificidad de unión a gangliósidos y las propiedades funcionales de ambas bolsas de unión a carbohidratos de TeNT. El bolsillo de unión del gangliósido reconoció la estructura del azúcar del gangliósido, Gal-GalNAc, independiente del ácido siálico- (5) y del ácido siálico- (7) y GM1a era un sustrato óptimo para este bolsillo, mientras que el bolsillo de unión del ácido siálico reconoció el ácido siálico- ( 5) y ácido siálico- (7) con la serie "b" de gangliósidos preferidos con respecto a los gangliósidos de la serie "a". La unión de alta afinidad de los gangliósidos a TeNT HCR requirió bolsas de unión de gangliósido y ácido siálico funcionales, lo que respalda la unión sinérgica a los correceptores. Este análisis proporciona un modelo de cómo la toxina del tétanos utiliza correceptores para la unión de alta afinidad a las neuronas.

Información sobre el mecanismo de desaminación oxidativa catalizada por DOPA descarboxilasa
  • Mariarita Bertoldi* ,
  • Barbara Cellini,
  • Riccardo Montioli y
  • Carla Borri Voltattorni

Aquí se investigó la inusual reacción de desaminación oxidativa que consume oxígeno catalizada por la enzima piridoxal 5'-fosfato (PLP) DOPA descarboxilasa (DDC). La variante de DDC de tipo salvaje o Y332F es capaz de realizar dicha oxidación hacia aminas aromáticas o l-aminoácidos aromáticos, respectivamente, sin la ayuda de ningún cofactor relacionado con la química del oxígeno. La desaminación oxidativa produce, en cantidades equivalentes, un compuesto carbonílico y amoniaco, acompañado de un consumo de dioxígeno en una relación molar 1: 2 con respecto a los productos. Los estudios cinéticos tanto en el estado preestablecido como en el estacionario, junto con los análisis de HPLC de las mezclas de reacción en diversas condiciones experimentales, revelaron que una cetimina se acumula durante la fase lineal de formación del producto. Esta especie es reactiva ya que se convierte nuevamente en PLP cuando se consume el sustrato. Los estudios de extinción química de mezcla rápida proporcionan evidencia de que la cetimina es de hecho un intermedio formado durante el primer ciclo catalítico. Además, tanto el anión superóxido como el peróxido de hidrógeno se generan durante los ciclos catalíticos. Sobre esta base, se propone un mecanismo de desaminación oxidativa consistente con los datos presentes. Además, las propiedades catalíticas del mutante T246A DDC junto con las obtenidas previamente con el mutante H192Q nos permiten proponer que la díada Thr246-His192 podría actuar como base general para promover el primer paso de la desaminación oxidativa de aminas aromáticas.

Termodinámica de la transición dímero-decamero de peroxiredoxina 2-Cys humana y vegetal reducida
  • Sergio Barranco-Medina,
  • Sergej Kakorin,
  • Juan José Lázaro, y
  • Karl-Josef Dietz*

La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica poderosa para investigar los procesos de autoasociación de complejos de proteínas y se esperaba que revelara datos cuantitativos sobre la oligomerización de peroxiredoxina midiendo directamente los parámetros termodinámicos de la interacción dímero-dímero. Las peroxoredoxinas de 2-cisteína clásicas recombinantes de Homo sapiens, Arabidopsis thaliana y Pisum sativum, así como una variante truncada en el extremo carboxi, se sometieron a análisis ITC mediante inyección escalonada en el recipiente de reacción en diversas condiciones redox. La medición directa del equilibrio decamero-dímero de peroxiredoxina reducida reveló una concentración crítica en el rango micromolar muy bajo. Los datos sugieren un ensamblaje cooperativo por encima de esta concentración de transición crítica donde un núcleo facilita el ensamblaje. La transición bastante abrupta indica que los procesos de ensamblaje no ocurren por debajo de la concentración de transición crítica, mientras que la oligomerización se desencadena de manera eficiente por encima de ella. La magnitud de la entalpía medida confirmó la naturaleza endotérmica de la oligomerización de peroxiredoxina. No se formaron heterocomplejos entre polipéptidos de peroxiredoxina de diferentes especies. Concluimos que una restricción funcional conservó la transición de dímero-decamero con concentraciones de transición críticas muy similares a pesar de la variación de secuencia emergente durante la evolución.

Sondando el dominio de unión a esteroides como I (SBDLI) del sitio de unión del receptor Sigma-1 usando etiquetas de fotoafinidad N-sustituidas
  • Dominique Fontanilla,
  • Abdol R. Hajipour,
  • Arindam Pal,
  • Uyen B. Chu,
  • Marty Arbabian y
  • Arnold E. Ruoho*

Las fotosensas fotoactivables con yodo radiactivo pueden proporcionar información valiosa sobre la estructura de las proteínas. Trabajos previos en nuestro laboratorio demostraron que el derivado de la cocaína y la fotosonda 3- [125I] yodo-4-azidococaína ([125I] IACoc) se unen al receptor sigma-1 con una afinidad 2-3 órdenes de magnitud mayor que la cocaína [Kahoun, JR (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1393-1397]. Con esta fotonda, demostramos que el sitio de inserción para [125I] IACoc es Asp188 [Chen, Y. (2007) Biochemistry 46, 3532-3542], que reside en la región propuesta de dominio de unión a esteroides II (SBDLII) (amino ácidos 176-194) [Pal, A. (2007) Mol. Pharmacol. 72, 921-933]. Se descubrió que una fotonda adicional basada en el ligando del receptor sigma-1 fenpropimorph, 1-N- (2-3- [125I] yodofenil) propano ([125I] IAF), marcaba un péptido tanto en el SBDLII como en el dominio de unión a esteroides. como I (SBDLI) (aminoácidos 91-109) [Pal, A. (2007) Mol. Pharmacol. 72, 921-933]. En este informe, describimos dos nuevos marcadores de fotoafinidad radioyodados, sin portadores, estratégicamente posicionados, diseñados específicamente para sondear la supuesta "región de interacción con nitrógeno" de los ligandos del receptor sigma-1. Estas dos nuevas fotosondas son (-) - metil 3- (benzoiloxi) -8-2- (4-azido-3- [125I] yodobenceno) -1-etil-8-azabiciclo [3.2.1] octano-2-carboxilato ([125I] -N-IACoc) y N-propil-N- (4-azido-3-yodofeniletil) -3- (4-fluorofenil) propilamina ([125I] IAC44). Además de informar sus afinidades de unión a los receptores sigma-1 y sigma-2, mostramos que ambos marcadores de fotoafinidad derivatizaron específica y covalentemente el receptor sigma-1 puro de cobaya (26,1 kDa) [Ramachandran, S. (2007) Protein Expression Purif. 51, 283-292]. La escisión del receptor sigma-1 fotoetiquetado usando Endo Lys C y bromuro de cianógeno (CNBr) reveló que el marcador [125I] -N-IACoc estaba ubicado principalmente en el extremo N-terminal y péptidos que contienen SBDLI del receptor sigma-1, mientras que Se encontró [125I] IAC44 en fragmentos de péptidos compatibles con el marcaje de SBDLI y SBDLII.

Papel de los aspartatos conservados en la ATPasa ArsA
  • Hiranmoy Bhattacharjee* ,
  • Ranginee Choudhury y
  • Barry P. Rosen

La ArsA ATPasa es la subunidad catalítica de la bomba ArsAB de translocación de arsenito que es responsable de la resistencia a los arsenicales y antimoniales en Escherichia coli. La actividad de la ATPasa es activada por arsenito o antimonita. ArsA se compone de dos mitades homólogas A1 y A2, cada una de las cuales contiene un dominio de unión a nucleótidos, y un solo dominio de unión o activación de metaloides se encuentra en la interfaz de las dos mitades de la proteína. El dominio de unión de metaloides está conectado a los dos dominios de unión de nucleótidos a través de dos secuencias de DTAPTGH, una en A1 y la otra en A2. Se propone que las secuencias de DTAPTGH estén implicadas en la comunicación de información entre el metal y los sitios catalíticos. Se investigaron las funciones de Asp142 en la secuencia A1 D142TAPTGH y Asp447 en la secuencia A2 D447TAPTGH después de alterar los aspartatos individualmente a alanina, asparagina y glutamato mediante mutagénesis dirigida al sitio. Los mutantes Asp142 fueron sensibles a As (III) en diversos grados, mientras que los mutantes Asp447 mostraron el mismo fenotipo de resistencia que el tipo salvaje. Cada proteína alterada exhibió niveles variables de actividad tanto basal como estimulada por metaloides, lo que indica que ni Asp142 ni Asp447 son esenciales para la catálisis. La caracterización bioquímica de las proteínas alteradas implica que Asp142 está involucrado en la unión de Mg2 + y también juega un papel en la transducción de señales entre los dominios catalítico y de activación. En contraste, Asp447 no es tan crítico para la unión de Mg2 + como Asp142 pero parece estar en comunicación entre el metal y los sitios catalíticos. Tomados en conjunto, los resultados indican que Asp142 y Asp447, ubicados en las mitades A1 y A2 de la proteína, tienen roles diferentes en la catálisis de ArsA, de acuerdo con nuestra propuesta de que estas dos mitades no son funcionalmente equivalentes.

La subunidad reguladora β de la fosforilasa quinasa interactúa con la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
  • Igor G. Boulatnikov,
  • Owen W. Nadeau,
  • Patrick J. Daniels,
  • Jessica M. Sage,
  • Marina D. Jeyasingham,
  • María T. Villar,
  • Antonio Artigues, y
  • Gerald M. Carlson*

La fosforilasa quinasa del músculo esquelético (PhK) es un complejo enzimático heterooligomérico (αβγδ) 4 que fosforila y activa la glucógeno fosforilasa b (GPb) en una reacción dependiente de Ca2 + que acopla la contracción muscular con la degradación del glucógeno. GPb es el único sustrato in vivo conocido de PhK; sin embargo, dado el gran tamaño y las múltiples subunidades del complejo PhK, examinamos extractos de músculo en busca de otros objetivos potenciales. Se incubaron extractos de ratones P / J (control) e I / lnJ (deficientes en PhK) con [γ-32P] ATP con o sin Ca2 + y se compararon para identificar sustratos potenciales.Los objetivos candidatos se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional, y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa fosforilada (GAPDH) se identificó mediante espectroscopía de masas de ionización por desorción asistida por matriz. Los estudios in vitro mostraron que GAPDH es un sustrato de PhK dependiente de Ca2 +, aunque la tasa de fosforilación es muy lenta. Sin embargo, GAPDH se une estrechamente a PhK, inhibiendo a bajas concentraciones (IC50 ∼ 0,45 μM) la conversión de PhK de GPb. Cuando se sustituyó GPb por un sustrato peptídico sintético corto, la inhibición fue insignificante, lo que sugiere que GAPDH puede inhibir predominantemente uniéndose al complejo PhK en un locus distinto de su sitio activo en la subunidad γ. Para probar esta noción, se incubó el complejo PhK-GAPDH con un reticulante químico y se formó un dímero entre la subunidad β reguladora de PhK y GAPDH. Esta interacción fue confirmada por el hecho de que un subcomplejo de PhK al que le faltaba la subunidad β, específicamente un subcomplejo αγδ, no pudo fosforilar GAPDH, a pesar de que es catalíticamente activo hacia GPb. Además, GAPDH no tuvo ningún efecto sobre la conversión de GPb por el subcomplejo αγδ. Las interacciones descritas en el presente documento entre la subunidad β de PhK y GAPDH proporcionan un posible mecanismo para el enlace directo de la glucogenólisis y la glucólisis en el músculo esquelético.

Explorando el panorama energético de los complejos anticuerpo-antígeno: dinámica de proteínas, flexibilidad y reconocimiento molecular
  • Megan C. Thielges,
  • Jörg Zimmermann,
  • Wayne Yu,
  • Masayuki Oda y
  • Floyd E. Romesberg*

La producción de anticuerpos que se unen selectivamente a prácticamente cualquier compuesto extraño es el sello distintivo del sistema inmunológico. Si bien se sabe mucho sobre cómo la diversidad de secuencias contribuye a esta notable hazaña de reconocimiento molecular, se sabe poco sobre cómo la diversidad de secuencias afecta la dinámica de los anticuerpos, lo que también se espera que contribuya al reconocimiento molecular. Con este objetivo, examinamos un panel de anticuerpos provocados contra el antígeno cromofórico fluoresceína. Sobre la base de la calorimetría de titulación isotérmica, seleccionamos seis anticuerpos que se unen a la fluoresceína con diversas entropías de unión, lo que sugiere diferentes contribuciones de la dinámica al reconocimiento molecular. La secuenciación reveló que dos pares de anticuerpos emplean cadenas pesadas homólogas que se derivan de genes de línea germinal comunes, mientras que las otras dos cadenas pesadas y las seis cadenas ligeras se derivan de genes de línea germinal diferentes y no son homólogas. Curiosamente, más de la mitad de todas las mutaciones somáticas adquiridas durante la maduración de la afinidad entre los seis anticuerpos se encuentran en posiciones que es poco probable que contacten directamente con la fluoresceína. Para cuantificar y comparar la dinámica de los complejos anticuerpo-fluoresceína, se empleó el desplazamiento de pico de eco de fotón de tres pulsos y la espectroscopía de rejilla transitoria. Todos los anticuerpos exhibieron movimientos en tres escalas de tiempo distintas, movimientos ultrarrápidos en la escala de tiempo & lt100 fs, movimientos de difusión en la escala de tiempo de picosegundos y movimientos que ocurren en escalas de tiempo superiores a nanosegundos y, por lo tanto, parecen estáticos. Sin embargo, la frecuencia exacta del movimiento de escala de tiempo de picosegundos y la contribución relativa de los diferentes movimientos varían significativamente entre los complejos anticuerpo-cromóforo, revelando un alto nivel de diversidad dinámica. Utilizando un modelo jerárquico, relacionamos los datos con las características de los paisajes energéticos de los anticuerpos, así como con su flexibilidad en términos de elasticidad y plasticidad. En total, los datos proporcionan una imagen consistente de la flexibilidad de los anticuerpos, que curiosamente parece estar correlacionada con la entropía de unión, así como con el uso de genes de la línea germinal y las mutaciones introducidas durante la maduración de la afinidad. Los datos también proporcionan una medida de la diversidad dinámica del repertorio de anticuerpos y sugieren que esta diversidad podría contribuir al reconocimiento molecular al facilitar el reconocimiento de la gama más amplia de moléculas extrañas.

Fosforilación de la proteína fosfatasa 2Cζ por c-Jun NH2-La quinasa terminal en Ser 92 atenúa su actividad fosfatasa
  • Kenjiro Awano,
  • Kazutaka Amano,
  • Yuko Nagaura,
  • Shin-ichiro Kanno,
  • Seishi Echigo,
  • Shinri Tamura* , y
  • Takayasu Kobayashi*

La familia de la proteína fosfatasa 2C (PP2C) representa una de las cuatro principales actividades de la proteína Ser / Thr fosfatasa en células de mamífero y contiene al menos 13 productos génicos distintos. Aunque los miembros de la familia PP2C regulan una variedad de funciones celulares, los mecanismos de regulación de sus actividades son en gran parte desconocidos. Aquí, mostramos que PP2Cζ, un miembro de la familia PP2C que está enriquecido en células germinales testiculares, es fosforilado por c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) pero no por p38 in vitro. La espectrometría de masas y los análisis mutacionales demostraron que la fosforilación se produce en Ser92, Thr202 y Thr205 de PP2Cζ. La fosforilación de estos residuos de Ser y Thr de PP2Cζ expresados ​​ectópicamente en células 293 fue mejorada por estrés osmótico y fue atenuada por un inhibidor de JNK pero no por inhibidores de p38 o MEK. La fosforilación de PP2Cζ por JNK activada por TAK1 reprimió su actividad fosfatasa en las células, y la mutación de alanina en Ser92 pero no en Thr202 o Thr205 suprimió esta inhibición. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la fosforilación específica de PP2Cζ en Ser92 por JNK activada por estrés atenúa su actividad fosfatasa en las células.

Regulación del superóxido derivado de eNOS por metilargininas endógenas
  • Lawrence J. Druhan,
  • Scott P. Forbes,
  • Arthur J. Pope,
  • Chun-An Chen,
  • Jay L. Zweier y
  • Arturo J. Cardounel*

Las metilargininas endógenas, dimetilarginina asimétrica (ADMA) y NG-monometil-1-arginina (L-NMMA) regulan la producción de óxido nítrico (NO) a partir de la NO sintasa endotelial (eNOS). En condiciones de depleción de tetrahidrobiopterina (BH4), la eNOS también genera • O2−; sin embargo, los efectos de las metilargininas sobre la generación de • O2− derivada de la eNOS son poco conocidos. Por lo tanto, utilizando técnicas de captura de espín por resonancia paramagnética de electrones, medimos los efectos dependientes de la dosis de ADMA y L-NMMA en la producción de • O2− a partir de eNOS en condiciones de agotamiento de BH4. En ausencia de BH4, ADMA aumentó de manera dependiente de la dosis la generación de • O2− derivada de NOS, con un aumento máximo del 151% a 100 µM de ADMA. La L-NMMA también aumentó de manera dependiente de la dosis el • O2− derivado de la NOS, pero en menor grado, lo que demuestra un aumento del 102% a 100 µM de L-NMMA. Además, el sustrato nativo l-arginina también aumentó el • O2− derivado de eNOS, exhibiendo un grado de mejora similar al observado con ADMA. Las mediciones del consumo de NADPH de eNOS demostraron que la unión de l-arginina o metilargininas aumentaba la tasa de oxidación de NADPH. Los estudios espectrofotométricos sugieren, al igual que para la l-arginina y L-NMMA, la unión de ADMA desplaza el hemo eNOS al estado de alto espín, indicativo de un potencial redox del hemo más positivo, lo que permite una mayor transferencia de electrones desde la reductasa al sitio de la oxigenasa. . Estos resultados demuestran que las metilargininas pueden cambiar profundamente el equilibrio de la generación de NO y • O2− a partir de eNOS. Estas observaciones tienen importantes implicaciones con respecto al uso terapéutico de l-arginina y los inhibidores de metilarginina-NOS en el tratamiento de enfermedades.

El reconocimiento de proteínas de unión a TATA y la flexión de un promotor de consenso dependen de la especie de proteína
  • JoDell E. Whittington,
  • Roberto F. Delgadillo,
  • Torrissa J. Attebury,
  • Laura K. Parkhurst,
  • Margaret A. Daugherty y
  • Lawrence J. Parkhurst*

La estructura y el comportamiento de la TBP humana de longitud completa que se une al promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) se han caracterizado usando métodos biofísicos. La proteína humana induce una curva de 97 ° en DNAAdMLP. Los datos funcionales de alta resolución proporcionan una descripción energética y cinética cuantitativa de la secuencia de reacción parcial, ya que la TBP humana nativa se une rápidamente a un promotor de consenso con alta afinidad. La reacción prosigue con la formación sucesiva de tres especies unidas, todas con ADN fuertemente doblado, con la concurrencia de unión y flexión demostrada por la fluorescencia y la anisotropía detenida en el flujo. Estos resultados establecen la dependencia de las especies de proteínas de la estructura y el mecanismo de reconocimiento de TBP-DNAAdMLP. Además, se muestra que la fuerte correlación entre el ángulo de curvatura del ADN y la eficiencia de transcripción demostrada previamente para la TBP de levadura se extiende a la TBP humana. Los dominios heterólogos NH2-terminales son la fuente aparente de las diferencias específicas de especie. Junto con estudios previos, el presente trabajo establece que la función y estructura de TBPwt − DNATATA dependen tanto de la secuencia de la caja TATA como de las especies de TBP.

Sre1, una proteína de unión a ADN GATA modulada con hierro de genes de absorción de hierro en el patógeno fúngico Histoplasma capsulatum
  • Lily Y. Chao,
  • Michael A. Marletta* , y
  • Jasper Rine*

El hongo patógeno Histoplasma capsulatum requiere hierro para sobrevivir durante la infección por macrófagos. Debido a que el hierro es tóxico en niveles altos, la adquisición de hierro en organismos patógenos, incluido H. capsulatum, es un proceso altamente regulado. En respuesta al exceso de hierro, H. capsulatum reprime la transcripción de genes implicados en la captación de hierro. Divulgamos aquí que SRE1, un gen que codifica una proteína de tipo GATA, unido a secuencias promotoras de genes implicados en la biosíntesis de sideróforos. Sre1 tenía similitud de secuencia con los reguladores negativos de hongos de la biosíntesis de sideróforos. La expresión de SRE1 se redujo en condiciones de escasez de hierro, lo que subraya su papel como regulador negativo de los genes implicados en la absorción de hierro. Sre1p se unió específicamente al ADN que contenía la secuencia 5 '- (G / A) ATC (T / A) GATAA-3', y esa unión dependía tanto del hierro como del zinc. El análisis de metales indicó que una cantidad subestequiométrica de hierro, predominantemente Fe3 +, estaba unida a la proteína purificada. Aproximadamente 0,5-1 equiv. De Fe3 + por monómero fueron necesarios para la actividad de unión completa al ADN. Las mutaciones en los residuos de cisteína conservados en la región rica en cisteína condujeron a una disminución del hierro unido. La pérdida de hierro condujo a una disminución de aproximadamente 2,5 veces en la afinidad de unión al ADN, lo que indica que el hierro estaba directamente involucrado en la regulación de SRE1 de los genes de absorción de hierro.

Especificidad de unión al ARN de Drosophila Muscleblind
  • Emily S. Goers,
  • Rodger B. Voelker,
  • Devika P. Gates y
  • J. Andrew Berglund*

Los miembros de la familia muscleblind de proteínas de unión a ARN que se encuentran en Drosophila y en mamíferos son actores clave tanto en la distrofia miotónica de la enfermedad humana como en la regulación del empalme alternativo. Recientemente, se ha demostrado que la proteína similar a la ceguera muscular de mamíferos, MBNL1, tiene interesantes propiedades de unión al ARN con objetivos de ARN tanto endógenos como relacionados con enfermedades. Aquí presentamos la caracterización de las propiedades de unión de ARN de la proteína Mblind muscleblind de Drosophila. La mutagénesis de las repeticiones de CUG bicatenarias demostró que Mbl requiere emparejamientos erróneos de pirimidina-pirimidina para la unión y que la identidad y ubicación de los pares de bases C-G y G-C dentro de las repeticiones son esenciales para la unión de Mbl. Se utilizó la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) para identificar secuencias de ARN que se unen a Mbl con una afinidad mucho mayor que las repeticiones de CUG. Las secuencias de ARN identificadas por SELEX están estructuradas y contienen una secuencia consenso de cinco nucleótidos de 5'-AGUCU-3 '. La huella de ARNasa de una de las secuencias de ARN de SELEX con Mbl mostró que Mbl se une tanto a las regiones bicatenarias como a las monocatenarias del ARN. Tres guanosinas muestran la huella más fuerte en presencia de la mutación Mbl de cualquiera de estas tres guanosinas que elimina la unión de Mbl. También se encontró que Mbl se unía específicamente a una diana de ARN de MBNL1 humana, lo que demuestra la conservación de las proteínas muscleblind en el reconocimiento de las dianas de ARN. Nuestros resultados revelan que Mbl reconoce estructuras secundarias complejas de ARN.

Ramificación sensible a isótopos y efectos de isótopos cinéticos en la reacción de ácidos araquidónicos deuterados con 12 y 15 lipoxigenasas humanas
  • Cyril Jacquot,
  • Aaron T. Wecksler,
  • Chris M. McGinley,
  • Erika N. Segraves,
  • Theodore R. Holman* , y
  • Wilfred A. van der Donk*

Las lipoxigenasas (LO) catalizan la peroxidación de lípidos y se han relacionado con una serie de enfermedades humanas relacionadas con el estrés oxidativo y la inflamación. Estas enzimas también han atraído una atención considerable debido a los grandes efectos isotópicos cinéticos (30-80) para la etapa de abstracción de hidrógeno que limita la velocidad con ácido linoleico (LA) como sustrato. En este documento, informamos efectos isotópicos cinéticos (KIE) en las reacciones de tres LO humanos (plaquetas 12-hLO, reticulocitos 15-hLO-1 y epitelial 15-hLO-2) con ácido araquidónico (AA). Sorprendentemente, los KIE observados con AA fueron mucho más pequeños que los valores previamente informados con LA. La investigación sobre los orígenes de los KIE más pequeños condujo al descubrimiento de ramificaciones sensibles a los isótopos de las vías de reacción. El análisis de distribución del producto demostró una inversión en la regioselectividad de 15-hLO-1, siendo la abstracción de hidrógeno de C13 la vía principal con AA sin marcar, pero la abstracción de C10 predominando cuando el grupo metileno en la posición 13 estaba deuterado. También se observaron cambios más pequeños pero claros en la regioselectividad para 12-hLO y 15-hLO-2.

Se requiere una segunda cisteína de dominio GAF conservada para la fotoreversibilidad azul / verde del cianobacteriocromo Tlr0924 de Thermosynechococcus elongatus
  • Nathan C. Rockwell,
  • Stephanie Lane Njuguna,
  • Laurel Roberts,
  • Elenor Castillo,
  • Victoria L. Parson,
  • Sol Dwojak,
  • J. Clark Lagarias* , y
  • Susan C. Spiller*

Los fitocromos son fotorreceptores rojo / rojo lejano que se encuentran ampliamente y que utilizan un cromóforo de tetrapirrol lineal (bilina) unido covalentemente dentro de un par de dominios PAS-GAF anudados. Las cianobacterias también contienen parientes más lejanos de fitocromos que carecen de este nudo, como los cianobacteriocromos relacionados con fitocromos implicados para funcionar como fotorreceptores conmutables azul / verde. En este estudio, caracterizamos el cianobacteriocromo Tlr0924 de la cianobacteria termófila Thermosynechococcus elongatus. El Tlr0924 de longitud completa exhibe fotoconversión azul / verde en un amplio rango de temperaturas, incluidas las temperaturas fisiológicamente relevantes para este organismo. La caracterización espectroscópica de Tlr0924 demuestra que su estado de absorción de verde está en equilibrio con una especie de absorción de azul lábil y espectralmente distinta. El estado de absorción de azul generado fotoquímicamente está en equilibrio con otra especie que absorbe a longitudes de onda más largas, lo que da un total de 4 estados. Cys499 es esencial para este comportamiento, porque la mutagénesis de este residuo da como resultado biliproteínas mutantes que absorben rojo. La caracterización de la proteína mutante C499D por absorbancia y espectroscopía de CD respalda la conclusión de que su cromóforo de bilina adopta una conformación similar a la forma de fitocromo Pr que absorbe la luz roja. Proponemos un fotociclo modelo en el que la fotoisomerización Z / E del enlace 15/16 modula la formación de un enlace tioéter reversible entre Cys499 y C10 del cromóforo, proporcionando la base para el cambio azul / verde de cianobacteriocromos.


Coordinación de metales interfaciales en ensamblajes de proteínas y péptidos diseñados

Andamios de péptidos diseñados que se ensamblan en respuesta a la coordinación de metales.

Diseño de conjuntos de proteínas mediadas por metales con nuevas propiedades estructurales / químicas.

Aplicaciones de la química de coordinación para controlar el ensamblaje de proteínas supramoleculares.

Los iones metálicos se encuentran con frecuencia en interfaces naturales proteína-proteína, donde estabilizan estructuras proteicas cuaternarias o supramoleculares, median interacciones transitorias proteína-proteína y sirven como centros catalíticos. Paralelamente a estos roles naturales, la química de coordinación de los iones metálicos se utiliza cada vez más de formas creativas para diseñar y controlar el ensamblaje de arquitecturas de proteínas y péptidos supramoleculares funcionales. Aquí proporcionamos una breve descripción de esta rama emergente de la ingeniería de metaloproteínas / péptidos y destacamos algunos ejemplos seleccionados de la literatura reciente que capturan mejor la diversidad y el potencial futuro de los enfoques que se están desarrollando.


D7. Química redox y plegamiento de proteínas - Biología

Las 4'-fosfopanteteinil transferasas (PPTasa) modifican postraduccionalmente las proteínas transportadoras con un resto de fosfopanteteína, una reacción esencial en los tres dominios de la vida. En el género bacteriano Mycobacteria, la PPTasa de tipo Sfp activa las vías necesarias para la biosíntesis de los componentes de la pared celular y los factores de virulencia de moléculas pequeñas. Resolvimos las estructuras cristalinas de rayos X y caracterizamos bioquímicamente las PPTasas de tipo Sfp de dos de los patógenos micobacterianos más prevalentes, PptT de M. tuberculosis y MuPPT de M. ulcerans. Los análisis estructurales revelan diferencias significativas en la unión del cofactor y la composición del sitio activo en comparación con las PPTasas de tipo Sfp previamente caracterizadas. Los análisis funcionales que incluyen la eficacia de los inhibidores específicos de PPTasa de tipo Sfp también sugieren que las PPTasas de tipo Sfp micobacterianas pueden servir como dianas terapéuticas contra infecciones por micobacterias.

El programa transcripcional de respuesta al choque térmico permite la producción de proteínas recombinantes de alta calidad y rendimiento en Escherichia coli
  • Xin Zhang,
  • Yu Liu,
  • Joseph C. Genereux,
  • Chandler Nolan,
  • Meha Singh y
  • Jeffery W. Kelly*

La biosíntesis de proteínas recombinantes solubles debidamente plegadas en grandes cantidades de Escherichia coli es deseable para la investigación académica y la producción de proteínas industriales. La capacidad de la red de homeostasis (proteostasis) de la proteína basal de E. coli a menudo es insuficiente para plegar de manera eficiente las proteínas sobreexpresadas. Aquí demostramos que una red de proteostasis de E. coli reprogramada transcripcionalmente es generalmente superior para producir proteínas recombinantes solubles, plegadas y funcionales. La reprogramación se logra sobreexpresando un factor de transcripción de respuesta de choque térmico deficiente en retroalimentación negativa antes y durante la sobreexpresión de la proteína de interés. La ventaja de la reprogramación transcripcional versus simplemente sobreexpresar componentes selectos de la red de proteostasis (p. Ej., Chaperonas y co-chaperonas, que se han explorado anteriormente) es que una gran cantidad de componentes de la red de proteostasis están regulados al alza en su estequiometría evolucionada, manteniendo así las capacidades del sistema de la red de proteostasis que actualmente se comprenden de forma incompleta. La reprogramación de la red de proteostasis transcripcional mediada por la señalización que responde al estrés en ausencia de estrés también debería ser útil para la producción de proteínas en otras células.

Caracterización funcional y estructural de inhibidores de 2-amino-4-feniltiazol de la proteína nucleocápsida del VIH-1 con actividad antiviral
  • Mattia Mori,
  • Alessandro Nucci,
  • Maria Chiara Dasso Lang,
  • Nicolás Humbert,
  • Christian Boudier,
  • Francois Debaene,
  • Sarah Sanglier-Cianferani,
  • Marjorie Catala,
  • Patricia Schult-Dietrich,
  • Ursula Dietrich,
  • Carine Tisné,
  • Yves Mely* , y
  • Maurizio Botta*

La proteína de la nucleocápside (NC) es una proteína altamente conservada en diversos subtipos de VIH-1 que juega un papel central en la replicación del virus, principalmente al interactuar con secuencias de ácido nucleico conservadas. NC se considera un objetivo farmacológico altamente rentable para inhibir múltiples pasos en el ciclo de vida del VIH-1 con un solo compuesto, una propiedad única que no muestra ninguna de las otras clases de antirretrovirales. Sin embargo, la mayoría de los inhibidores de NC desarrollados hasta ahora actúan a través de un mecanismo inespecífico y potencialmente tóxico (eyección de zinc) y se están investigando principalmente como microbicidas tópicos. En un esfuerzo por proporcionar inhibidores de NC específicos que compitan por la unión de ácidos nucleicos a NC, aquí combinamos modelado molecular, síntesis orgánica, estudios biofísicos, espectroscopia de RMN y ensayos antivirales para diseñar, sintetizar y caracterizar un inhibidor de NC eficiente dotado de actividad antiviral in vitro, una propiedad deseable para el desarrollo de compuestos antirretrovirales de plomo eficientes.

Codificación genética de un aminoácido electrofílico para el engrapado de proteínas y la unión covalente a receptores nativos
  • Xiao-Hua Chen,
  • Zheng Xiang,
  • Ying S. Hu,
  • Vanessa K. Lacey,
  • Hu Cang y
  • Lei Wang*

Los enlaces covalentes se pueden generar dentro y entre las proteínas mediante un aminoácido no natural (Uaa) que reacciona con un residuo natural a través de la biorreactividad habilitada por la proximidad. Hasta ahora, los Uaas se han desarrollado para reaccionar principalmente con la cisteína en las proteínas. Aquí codificamos genéticamente un Uaa electrofílico capaz de reaccionar con histidina y lisina, expandiendo así la diversidad de proteínas diana y el alcance de la tecnología de entrecruzamiento de proteínas habilitado por proximidad. Además de la reticulación eficaz de proteínas inter e intramolecularmente, este Uaa permite el grapado directo de una hélice α de proteína de una manera recombinante y la unión covalente de receptores de membrana nativos en células vivas. La diversidad de objetivos, el engrapado recombinante y el direccionamiento covalente de proteínas endógenas habilitadas por este Uaa versátil deberían resultar valiosas en el desarrollo de herramientas de investigación novedosas, diagnósticos biológicos y terapéuticos mediante la explotación de los enlaces de proteínas covalentes para obtener especificidad, irreversibilidad y estabilidad.

Péptidos BH3 diseñados con alta afinidad y especificidad para dirigirse a Mcl-1 en células
  • Glenna Wink Foight,
  • Jeremy A. Ryan,
  • Stefano V. Gullá,
  • Anthony Letai y
  • Amy E. Keating*

Mcl-1 se sobreexpresa en muchos cánceres y puede conferir resistencia a la señalización de muerte celular en enfermedades refractarias. Las moléculas que inhiben específicamente Mcl-1 tienen potencial para diagnosticar y alterar la supervivencia celular dependiente de Mcl-1. Seleccionamos tres péptidos de una biblioteca de presentación de la superficie de la levadura que mostró una especificidad y afinidad moderadas para unirse a Mcl-1 sobre Bfl-1, Bcl-xL, Bcl-2 y Bcl-w. La especificidad para Mcl-1 se mejoró mediante la introducción de treonina en la posición 2e del péptido. El péptido más específico, MS1, se unió a Mcl-1 con una especificidad de 40 veces o más que otros cuatro parálogos de Bcl-2 humanos. En los ensayos de perfil de BH3, MS1 causó despolarización en varias líneas celulares humanas dependientes de Mcl-1 con valores de CE50 de ~ 3 μM, en contraste con valores de CE50 de & gt100 μM para Bcl-2-, Bcl-xL- o Bfl-1 dependientes líneas celulares. MS1 es al menos 30 veces más potente en este ensayo que el reactivo de direccionamiento Mcl-1 utilizado anteriormente NoxaA BH3. Estos péptidos se pueden usar para detectar la dependencia de Mcl-1 en las células y proporcionar pistas para desarrollar agentes terapéuticos dirigidos a Mcl-1.

Control ortogonal de la actividad antibacteriana con luz
  • Willem A. Velema,
  • Jan Pieter van der Berg,
  • Wiktor Szymanski,
  • Arnold J. M. Driessen y
  • Ben L. Feringa*

La selección de una única cepa bacteriana a partir de una mezcla de microorganismos es de crucial importancia en la investigación de la salud y la microbiología. Los enfoques novedosos que pueden controlar externamente la selección bacteriana son una valiosa adición a la caja de herramientas de microbiología. En esta prueba de concepto, dos antibióticos complementarios están protegidos con grupos fotoescindibles que se pueden abordar ortogonalmente con diferentes longitudes de onda de luz. Esto permite la selección activada por luz de una única cepa bacteriana de una mezcla de múltiples cepas, eligiendo la longitud de onda correcta. Una mejora adicional hacia antibióticos adicionales direccionables ortogonalmente podría conducir en última instancia a una nueva metodología para la selección bacteriana en poblaciones complejas.

Efectos diferenciales sobre el silenciamiento selectivo de alelos de la huntingtina mutante por dos estereoisómeros de ácido nucleico restringido α, β
  • Michael E. Østergaard,
  • Béatrice Gerland,
  • Jean-Marc Escudier,
  • Eric E. Swayze y
  • Punit P. Seth*

Describimos los efectos de la introducción de dos epímeros de ácido nucleico restringido (CNA) α, β de cadena principal neutral (CNA) sobre la actividad y el perfil de selectividad alélica de los oligonucleótidos antisentido activos (ASO) de RNasa H dirigidos a un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) para el tratamiento de la enfermedad de Huntington. enfermedad (EH). Los ASO modificados con ambos isómeros de α, β-CNA en la región gap mostraron una buena actividad frente al alelo mutante, pero un isómero mostró una selectividad mejorada frente al alelo de tipo salvaje. El análisis de los patrones de escisión de la ARNasa H humana de los ASO modificados con α, β-CNA frente al ARN emparejado y no emparejado reveló que ambos isómeros apoyan la escisión de la RNasa H en la hebra de ARN frente al sitio de incorporación en el ASO, una observación inusual para un enlace neutro modificación de oligonucleótidos. Curiosamente, los ASO modificados con (R) - y (S) -5′-hidroxietil ADN (RHE y SHE respectivamente) formados por hidrólisis parcial del sistema de anillo dioxafosforinano en α, β-CNA también mostraron una buena actividad frente al alelo mutante pero una Se observó un perfil de selectividad mejorado para el ASO modificado con RHE. Nuestras observaciones respaldan aún más la elaboración de perfiles de análogos de ácidos nucleicos modificados en 5 'y neutros como herramientas para aplicaciones de silenciamiento de genes.

Síntesis enzimática de dioxinas polibromadas del medio marino

Las dibenzo-p-dioxinas polihalogenadas se encuentran posiblemente entre las moléculas más tóxicas conocidas por el hombre. Además de las fuentes antropogénicas, los invertebrados marinos también albergan dibenzo-p-dioxinas polibromadas de origen biogénico aún desconocido. Aquí, informamos que el locus del gen bmp en bacterias marinas, una fuente caracterizada recientemente de éteres de difenilo polibromados, también puede sintetizar dibenzo-p-dioxinas mediante el empleo de diferentes moléculas iniciadoras fenólicas. Nuestros hallazgos también diversifican las clases estructurales de difenil éteres a los que se accede por la vía biosintética de bmp. Este informe sienta las bases bioquímicas de un probable origen biogenético de las dibenzo-p-dioxinas presentes en el metaboloma marino y amplía enormemente el potencial de toxicidad de los productos naturales polihaloganados derivados del mar.

Oligonucleótidos de morfolino activables por nitrorreductasa para en vivo Silenciamiento genético

Los oligonucleótidos de fosforodiamidato morfolino se utilizan ampliamente para interrogar la función génica en organismos completos, y los derivados activables por luz pueden revelar diferencias espaciales y temporales en la actividad génica. Aquí describimos una nueva clase de oligonucleótidos morfolino enjaulados que pueden ser activados por la nitroreductasa bacteriana NfsB. Caracterizamos la cinética de activación de estos reactivos in vitro y demostramos su eficacia en embriones de pez cebra que expresan NfsB de forma ubicua o en poblaciones celulares definidas. En combinación con organismos transgénicos, tales herramientas antisentido activadas por enzimas permitirán el silenciamiento génico en tipos de células específicos, incluidos los tejidos que no son susceptibles de direccionamiento óptico.

Reportero químico para visualizar el cruce metabólico entre el metabolismo de carbohidratos y la modificación de proteínas

Los reporteros químicos metabólicos se han utilizado ampliamente para estudiar modificaciones postraduccionales. Generalmente, se asumió que estos informadores entraron en una vía biosintética, lo que resultó en el etiquetado de un tipo de modificación. Sin embargo, debido a que son metabolizados por las células antes de su adición a las proteínas, los indicadores químicos metabólicos brindan potencialmente una oportunidad única para leer tanto las modificaciones de interés como el metabolismo celular. Divulgamos aquí el desarrollo de un reportero químico metabólico 1-desoxi-N-pentinil glucosamina (1-desoxi-GlcNAlk). Esta pequeña molécula no se puede incorporar a los glucanos; sin embargo, el tratamiento de células de mamíferos da como resultado el marcaje de una variedad de proteínas y permite su visualización e identificación. La competencia de este marcaje con el acetato de sodio y un inhibidor de la acetiltransferasa sugiere que la 1-desoxi-GlcNAlk puede entrar en la vía de acetilación de proteínas. Estos resultados demuestran que los reporteros químicos metabólicos tienen el potencial de aislar y potencialmente descubrir interferencias entre las vías metabólicas en las células vivas.

Transformación de catelicidina humana LL-37 en compuestos antimicrobianos selectivos, estables y potentes
  • Guangshun Wang* ,
  • Mark L. Hanke,
  • Biswajit Mishra,
  • Tamara Lushnikova,
  • Cortney E. Heim,
  • Vinai Chittezham Thomas,
  • Kenneth W. Bayles y
  • Tammy Kielian

Esta carta informa sobre una familia de compuestos antimicrobianos novedosos obtenidos al combinar la selección de bibliotecas de péptidos con un diseño basado en estructuras. El cribado de la biblioteca condujo a la identificación de un péptido LL-37 humano resistente a la quimotripsina. Esta plantilla peptídica que contiene d-aminoácidos fue activa contra Escherichia coli pero no contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA). Posee una estructura anfipática no clásica única con defectos hidrofóbicos. Al reparar los defectos hidrofóbicos, el péptido (17BIPHE2) ganó actividad contra los patógenos ESKAPE, incluidos Enterococcus faecium, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter. In vitro, 17BIPHE2 podría alterar las membranas bacterianas y unirse al ADN. In vivo, el péptido previno la formación de biopelículas estafilocócicas en un modelo de ratón de infección asociada a catéter. Mientras tanto, impulsó la respuesta inmune innata para combatir aún más la infección. Debido a que estos péptidos son potentes, selectivos de células y estables a varias proteasas, pueden utilizarse para combatir uno o más patógenos ESKAPE.

¿Cuántas moléculas de péptidos antimicrobianos matan a una bacteria? El caso del PMAP-23
  • Daniela Roversi,
  • Vincenzo Luca,
  • Simone Aureli,
  • Parque Yoonkyung,
  • Maria Luisa Mangoni, y
  • Lorenzo Stella*

Los péptidos antimicrobianos (AMP) matan a las bacterias principalmente a través de la perturbación de sus membranas y son compuestos prometedores para combatir la resistencia a los medicamentos. Los modelos del mecanismo de perturbación de la membrana inducida por AMP se desarrollaron sobre la base de experimentos en liposomas, pero se debate su relevancia para la destrucción de bacterias. Determinamos la asociación de un análogo del AMP PMAP-23 a células de Escherichia coli, en las mismas condiciones experimentales utilizadas para medir la actividad bactericida. La muerte tuvo lugar solo cuando los péptidos unidos saturaron completamente las membranas bacterianas (106-107 péptidos unidos por célula), lo que indica que el modelo de "alfombra" para la perturbación de las bicapas artificiales es representativo de lo que sucede en las bacterias reales. Este hallazgo apoya la opinión de que, al menos para este péptido, es posible un mecanismo microbicida in vivo solo a concentraciones micromolares de péptido total. También demostramos que, a pesar de su simplicidad, los liposomas representan un modelo confiable para caracterizar la partición de AMP en las membranas bacterianas.

Estrategia bioinspirada para la síntesis ribosómica de péptidos macrocíclicos con puentes de tioéter en bacterias

Inspirada por la lógica biosintética de los productos naturales de lantipéptidos, se desarrolló una nueva metodología para dirigir la síntesis ribosómica de péptidos macrocíclicos restringidos por un enlace tioéter intramolecular. Como primer paso, se implementó una estrategia robusta y versátil para permitir la ciclación de secuencias peptídicas derivadas de ribosomas mediante una reacción quimioselectiva entre una cisteína codificada genéticamente y un aminoácido no natural reactivo con cisteína (O- (2-bromoetil) -tirosina). La combinación de este enfoque con el empalme de proteínas catalizado por inteína proporcionó una ruta eficaz para lograr la formación postraduccional espontánea de péptidos macrocíclicos estructuralmente diversos en células bacterianas. También se encontró que la presente estrategia de ciclación de péptidos era susceptible de integración con ligación circular mediada por inteína dividida, lo que da como resultado la síntesis intracelular de péptidos constreñidos conformacionalmente que presentan una arquitectura bicíclica.

Artículos
Adiciones 1,4 nucleofílicas para el descubrimiento de productos naturales
  • Courtney L. Cox,
  • Jonathan I. Tietz,
  • Karol Sokolowski,
  • Joel O. Melby,
  • James R. Doroghazi y
  • Douglas A. Mitchell*

Los productos naturales siguen siendo una fuente importante de candidatos a fármacos, pero las dificultades inherentes al aislamiento tradicional, junto con tasas inaceptablemente altas de redescubrimiento de compuestos, limitan el ritmo de detección de productos naturales. Aquí describimos un método de detección basado en reactividad para identificar rápidamente metabolitos bacterianos exportados que contienen aminoácidos deshidratados (es decir, alquenos activados por carbonilo o imina), un motivo común en varias clases de productos naturales. Nuestra estrategia implica el uso de un tiol disponible comercialmente, ditiotreitol, para el marcaje covalente de alquenos activados por adición de 1,4 nucleófilos. La modificación se discierne fácilmente comparando los espectros de masas de los extractos de la superficie celular que reaccionaron y los que no reaccionaron. Cuando se combina con el análisis bioinformático de grupos de genes de productos naturales putativos, la detección y el aislamiento específicos se pueden realizar en una lista priorizada de cepas. Además, los compuestos conocidos se eliminan fácilmente, eliminando eficazmente el aislamiento y la caracterización superfluos. Como prueba de principio, este método de etiquetado se utilizó para identificar productos naturales conocidos pertenecientes a las clases de tiopéptidos, lantipéptidos y linaridinas. Además, al seleccionar un panel de solo 23 actinomicetos, descubrimos y caracterizamos un nuevo antibiótico tiopéptido, la ciclotiazomicina C.

Estructuras de kibdelomicina unidas a Staphylococcus aureus GyrB y ParE mostraron un nuevo modo de encuadernación en forma de U
  • Jun Lu* ,
  • Sangita Patel,
  • Nandini Sharma,
  • Stephen M. Soisson,
  • Ryuta Kishii,
  • Masaya Takei,
  • Yasumichi Fukuda,
  • Kevin J. Lumb y
  • Sheo B. Singh*

La resistencia bacteriana a los antibióticos sigue planteando serios desafíos a medida que se desvanece la tasa de descubrimiento de nuevos antibióticos. La kibdelomicina es uno de los antibióticos de productos naturales novedosos y poco comunes que se han descubierto recientemente y que inhiben las enzimas girasas y topoisomerasas IV de síntesis de ADN bacteriano. Es un antibiótico Gram positivo de amplio espectro sin resistencia cruzada a los inhibidores de girasa conocidos, incluidas las quinolonas clínicamente eficaces. Para comprender su mecanismo de acción, modo de unión y falta de resistencia cruzada, hemos cocristalizado kibdelomicina y novobiocina con los dominios N-terminales de Staphylococcus aureus girasa B (24 kDa) y topo IV (ParE, 24 y 43 kDa ). La kibdelomicina muestra un modo de unión en forma de U de "brazo doble" único en ambas estructuras cristalinas. El resto de pirrolamida en la parte inferior de la kibdelomicina penetra profundamente en el bolsillo del sitio de unión de ATP, mientras que el resto de ácido isopropil-tetrámico y azúcar de la parte superior se involucran completamente en interacciones polares con un parche de superficie de la proteína. El ácido isoproramico (1,3-dioxopirrolidina) y un grupo acetato de tetrahidropirano (Azúcar A) hacen contacto polar con un área superficial que consta de la hélice α4 y el bucle flexible que conecta las hélices α3 y α4. Los dos brazos están conectados entre sí por un enlazador rígido de decalina que hace que van del Waals contacte con la columna vertebral de la proteína. Este modo de unión multicontacto en forma de U de "brazo doble" de kibdelomicina es único y distintivamente diferente de los modos de unión de otros inhibidores de girasa conocidos (p. Ej., Cumarinas y quinolonas), lo que explica su falta de resistencia cruzada y baja frecuencia de resistencia. . Las estructuras cristalinas descritas en este artículo deberían permitir el diseño y descubrimiento de análogos con mejores propiedades y espectro antibacteriano.

Alteraciones en el metabolismo energético / redox inducidas por toxinas mitocondriales y ambientales: un papel específico de la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa y la vía de las pentosas fosfato en la toxicidad del paraquat
  • Shulei Lei,
  • Laura Zavala-Flores,
  • Aracely García-García,
  • Renu Nandakumar,
  • Yuting Huang,
  • Nandakumar Madayiputhiya,
  • Robert C. Stanton,
  • Eric D. Dodds,
  • Robert Powers* , y
  • Rodrigo Franco*

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno multifactorial con una etiología compleja que incluye factores de riesgo genéticos, exposiciones ambientales y envejecimiento. Si bien la insuficiencia energética y el estrés oxidativo se han asociado en gran medida con la pérdida de células dopaminérgicas en la EP y la toxicidad inducida por toxinas mitocondriales / ambientales, se sabe muy poco sobre las alteraciones en el metabolismo energético asociadas con la disfunción mitocondrial y su papel causal en la progresión de la muerte celular. . En este estudio, investigamos las alteraciones en el metaboloma energético / redox en células dopaminérgicas expuestas a toxinas ambientales / mitocondriales (paraquat, rotenona, 1-metil-4-fenilpiridinio [MPP +] y 6-hidroxidopamina [6-OHDA]) para identificar mecanismos de toxicidad comunes y / o diferentes. Se utilizó un enfoque de metabolómica combinada que utiliza resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrometría de masas de ionización por electrospray de infusión directa (DI-ESI-MS) para identificar cambios únicos en el perfil metabólico en respuesta a estas neurotoxinas. La exposición al paraquat indujo las alteraciones más profundas en el metaboloma de la vía de las pentosas fosfato (PPP). El análisis del flujo de 13C-glucosa corroboró que los metabolitos de PPP como glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato, glucono-1,5-lactona y eritrosa-4-fosfato aumentaron con el tratamiento con paraquat, que fue paralelo a la inhibición de la glucólisis. y el ciclo de TCA. El análisis proteómico también encontró un aumento en la expresión de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), que suministra equivalentes reductores mediante la regeneración de los niveles de fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADPH). La sobreexpresión de G6PD aumentó selectivamente la toxicidad del paraquat, mientras que su inhibición con 6-aminonicotinamida inhibió el estrés oxidativo inducido por el paraquat y la muerte celular. Estos resultados sugieren que el paraquat “secuestra” el PPP para aumentar los equivalentes reductores de NADPH y estimular el ciclo redox del paraquat, el estrés oxidativo y la muerte celular. Nuestro estudio demuestra claramente que las alteraciones en el metabolismo energético, que son específicas para distintas toxinas mitocondriales / ambientales, no son testigos de la falla energética, sino que también contribuyen de manera significativa a la progresión de la muerte celular.

Mia40 está optimizado para su función en el plegado e importación de proteínas oxidativas mitocondriales

Mia40 cataliza el plegamiento de proteínas oxidativas en las mitocondrias. Contiene un ditiol de CPC catalítico único flanqueado por un surco hidrófobo y, a diferencia de otras oxidorreductasas, forma disulfuros mixtos de larga duración con sustratos. Mostramos que esta propiedad distintiva no se origina ni de propiedades particulares de sustratos mitocondriales ni del motivo CPC de Mia40. Las cisteínas catalíticas de Mia40 muestran una reactividad química inusualmente baja, expresada en valores de pK convencionales y potenciales de reducción.La estabilidad del intermedio disulfuro mixto se acopla enérgicamente con interacciones hidrófobas entre Mia40 y el sustrato. Basándonos en estas propiedades, sugerimos un mecanismo para Mia40, donde se emplea el sitio de unión hidrofóbico para seleccionar un sustrato tiol para formar el disulfuro mixto inicial. Su larga vida útil se utiliza para retener proteínas parcialmente plegadas en las mitocondrias y dirigir el plegado hacia la formación de enlaces disulfuro nativos.


Abstracto

El uso de cadenas laterales como cofactores catalíticos para la química redox mediada por proteínas plantea problemas mecanicistas importantes en cuanto a cómo estos aminoácidos se activan hacia la química de radicales de una manera controlada. De novo El diseño de proteínas se ha utilizado para examinar la base estructural para la creación y el mantenimiento de un radical triptofanilo en una maqueta de proteína de haz de tres hélices. Aquí presentamos el análisis estructural detallado de la proteína mediante métodos de RMN multidimensionales. Una característica interesante de la estructura es una aparente interacción π-catión que involucra al triptófano único y una cadena lateral de lisina. Los cálculos funcionales de densidad híbrida apoyan la noción de que esta interacción aumenta el potencial de reducción del par redox W ° / WH y ayuda a explicar las características redox de la proteína. Por lo tanto, este sistema de proteínas modelo proporciona un modelo poderoso para explorar la base estructural de la química radical controlada en las proteínas.


Ver el vídeo: 8. Protein Folding 1 (Agosto 2022).