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¿Qué implicaciones tiene el 2'-OH faltante en la capacidad del ADN para formar estructuras 3D?

¿Qué implicaciones tiene el 2'-OH faltante en la capacidad del ADN para formar estructuras 3D?



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La diferencia química entre el ARN y el ADN es el grupo 2'-hidroxilo que falta en los nucleótidos que forman el ADN. El principal efecto de ese cambio que conozco es la mayor estabilidad del ADN en comparación con el ARN. Pero me pregunto si esta diferencia tiene implicaciones significativas para la capacidad del ADN para formar estructuras tridimensionales complejas.

Se sabe que el ARN puede partir de estructuras terciarias complejas y funcionar como ribozimas. Claramente tiene la capacidad de formar una amplia gama de estructuras y puede catalizar una variedad de reacciones químicas.

Hasta donde yo sé, no se conocen ADN catalíticos de origen natural. Pero en el laboratorio se han creado varias enzimas de ADN sintético, por lo que generalmente es posible que el ADN forme estructuras catalíticas (consulte Breaker y Joyce 1994 para conocer la primera enzima de ADN creada).

Me pregunto si el 2'-OH que falta significa que el ADN tiene menos potencial para formar estructuras complejas en comparación con el ARN. Imagino que cambia la capacidad de crear enlaces de hidrógeno, pero no sé si disminuiría significativamente las estructuras potenciales que podría adoptar el ADN.


Rompedor RR, Joyce GF; (Diciembre de 1994). "Una enzima de ADN que escinde el ARN". Chem Biol. 1 (4): 223-9


Para asegurarme de que no estoy comparando manzanas y peras, mi (intento de) responder la pregunta se dividirá en dos partes: comparación de ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios.

ADN y ARN monocatenario

Tanto el ADN como el ARN pueden formar estructuras terciarias complejas monocatenarias en las que los elementos de la estructura secundaria están asociados a través de contactos de van der Waals y enlaces de hidrógeno. La presencia de un grupo 2'-hidroxilo hace que el anillo de ribosa prefiera diferentes conformaciones que la desoxirribosa en el ADN. Además, dado que el resto 2'-OH es tanto donador como aceptor de hidrógeno, proporciona al ARN mayor flexibilidad para formar estructuras complejas en 3D y estabilidad permanecer en una de estas conformaciones. Como observa Aleadam, este artículo muestra que el tRNA y su ADN análogo forman estructuras terciarias similares, aunque el tDNA no es tan estable como el tRNA:

Por lo tanto, sostenemos que la conformación global de los ácidos nucleicos está dictada principalmente por la interacción de las bases de purina y pirimidina con átomos y grupos funcionales comunes tanto al ARN como al ADN. Desde este punto de vista, el grupo 2-hidroxilo, al menos en el ARNt, es una característica estructural auxiliar cuyo papel se limita a fomentar interacciones locales, que aumentan la estabilidad de una determinada conformación.

Estos autores también muestran que al menos un bucle en el análogo de tDNA es más susceptible a la escisión por una endonucleasa de restricción. En esta región, el ARNt tiene una molécula de agua unida por hidrógeno al grupo 2 'hidroxilo.

No pude encontrar más comparaciones tan interesantes en la literatura.

ADN y ARN de doble hebra

Tanto el ADN como el ARN pueden formar estructuras bicatenarias. Una vez más, la conformación del azúcar determina la forma de la hélice: para la hélice de ADN suele ser la forma B, mientras que el ARN helicoidal forma la geometría A en casi todas las condiciones. En la hélice de ARN encontramos la ribosa predominantemente en la conformación C3'-endo, ya que 2'-OH estéricamente desfavorece la conformación C2'-endo, necesaria para la geometría de la forma B.

Importancia fisiológica

El dsRNA y ssDNA a menudo proporcionan una señal a la célula de que algo anda mal. Por supuesto, el dsRNA se observa en procesos normales como la interferencia de RNA, pero también puede detener la síntesis de proteínas y señalar infecciones virales (cf. virus de RNA bicatenario). De manera similar, el ssDNA es mucho más propenso a degradarse que el dsDNA, a menudo indica daño del ADN o infecciones por virus de ADN monocatenario e induce la muerte celular. Por lo tanto, debido a sus funciones, en condiciones normales, la estructura 3D del ADN es principalmente una hélice bicatenaria, mientras que el ARN tiene una estructura 3D compleja, monocatenaria, "similar a una proteína".


Este no es mi campo, por lo que me arriesgo a una respuesta incorrecta / incompleta aquí, pero diría que la diferencia crítica es la aparición casi completa de ADN de doble hebra que impide la formación de las estructuras terciarias en el ARN de una sola hebra. en lugar de la diferencia de 2'OH. De hecho, y siguiendo el enlace que publicaste, los autores incluso comentan en la introducción que:

"Es bien sabido que el ADN monocatenario puede asumir interesantes estructuras terciarias. Un ARNt y su ADN análogo forman estructuras muy similares [9]".

No seguí la cita 9 [Paquette et al (1990), Eur. J. Biochem. 189,259-265], pero parecen responder a su pregunta con esa frase. En esencia, probablemente no tenga una implicación importante.


La respuesta radica completamente en la estabilidad termodinámica que se proporciona al tener un 2'-OH. Como lo mencionó Aleksandra, el ARN adoptará solo la conformación C3'-endo, mientras que el ADN adopta tanto C2'-endo como C3'-endo. Efectivamente, esto hace que la cadena de ADN sea más flexible, no el ARN. Al hacerlo, un oligómero de ADN monocatenario podrá adoptar más estados.

La formación de hélice de ADN / ARN es predominantemente entálpicamente impulsado. Cuando se forma una hélice, el ARN solo adoptará una hélice en forma de A, mientras que el ADN adoptará tanto una forma A como una forma B. Si bien hay más conformaciones posibles para el ADN, la reducción en la entrópico las contribuciones lo hacen significativamente más desfavorable. Curiosamente, esta es la razón por la que los análogos de ARN como el PNA y los morfolinos tienen buenas propiedades de unión, ya que formarán un emparejamiento de bases más estable entrópicamente con su secuencia diana.

Por estas razones, es mucho más común ver ribozimas estructuradas y ARN no codificantes en la naturaleza, aunque es físicamente posible producir ADNzimas. Una vez más, una de las muchas razones por las que la hipótesis del mundo del ARN tiene sentido.


el grupo OH en la posición dos actúa como un catalizador nucleófilo para la escisión del ARN o del ADN si tuviera tal grupo. Dado que el ADN debe permanecer intacto durante toda la vida de una célula, sería desastroso si se escindiera debido al grupo 2'OH. Por otro lado, el ARN se escinde rápidamente según lo necesite la célula sin consecuencias perjudiciales para el código genético de la célula, por lo que puede tener un grupo OH.


¿Qué implicaciones tiene el 2'-OH faltante en la capacidad del ADN para formar estructuras 3D? - biología

La nanotecnología de ADN estructural consiste en combinar motivos de ADN inusuales mediante interacciones cohesivas específicas estructuralmente bien definidas (principalmente extremos pegajosos) para producir materiales diana con estructuras 3D predecibles. Este esfuerzo ha generado catenanos poliédricos de ADN, dispositivos nanomecánicos robustos y una variedad de matrices periódicas en dos dimensiones. El sistema se ha utilizado para producir patrones específicos en la mesoescala mediante el diseño y la combinación de cadenas de ADN específicas, que luego se examinan mediante microscopía de fuerza atómica. Se espera que la combinación de estas construcciones con otros componentes químicos contribuya al desarrollo de nanoelectrónica, nanorobótica y materiales inteligentes. Las capacidades organizativas de la nanotecnología de ADN estructural apenas están comenzando a explorarse, y se espera que el campo finalmente sea capaz de organizar una variedad de especies que conducirán a materiales emocionantes y posiblemente revolucionarios.


MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis de secuencia de la subunidad accesoria de Drosophila pol & # x003b3.

Se buscó en la base de datos de secuencias de proteínas SwissProt utilizando el algoritmo blast (11) a través del servidor web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) en busca de homólogos de la secuencia de la subunidad accesoria de pol & # x003b3 (7). Las alineaciones de secuencia se obtuvieron con los programas gap y bestfit del paquete de software del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin (GCG) (12) utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (con peso del espacio = 5 y peso de la longitud = 4). Los residuos 254 & # x02013361 de la subunidad accesoria de pol & # x003b3 (pol & # x003b3 - & # x003b2) se alinearon usando un espacio para los residuos 288 & # x02013386 de la secuencia de la estructura cristalina del Thermus thermophilus prolil tRNA sintetasa (Pro-RS generosamente proporcionado por S. Cusack del Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Grenoble, Francia) (13), correspondiente a un dominio de plegamiento independiente en Escherichia coli pro-RS identificado por la búsqueda explosiva como similar a la secuencia pol & # x003b3 - & # x003b2. Se hicieron modificaciones menores de esta alineación para que las inserciones y deleciones cayeran en regiones entre estructuras secundarias.

Modelado estructural de la subunidad accesoria.

La predicción inicial del pliegue tridimensional (3D) de la subunidad accesoria se obtuvo del servidor Protein Fold Recognition (http://www.doe-mbi.ucla.edu/people/frsvr/preds.html) basado en el algoritmo de Fischer y Eisenberg (14). Este enfoque utiliza tanto la estructura secundaria asignada a la secuencia por phdsec (15) (http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html) como la matriz de sustitución de aminoácidos de Gonnet para evaluar la similitud entre la secuencia de la sonda. (por ejemplo, la subunidad accesoria) y secuencias del Protein Data Bank (PDB) (16, 17) de estructuras de proteínas 3D. El uso de estructuras primarias y secundarias pronosticadas en la búsqueda mejora su sensibilidad para identificar la proteína con el pliegue 3D más similar al de la sonda. Cuando se probó en un conjunto de 68 proteínas cuyas estructuras 3D eran conocidas pero ignoradas, el servidor de reconocimiento de pliegues puede reconocer con éxito el pliegue 3D de una nueva secuencia en el 71 & # x00025 de los casos (14).

El modelado 3D se llevó a cabo utilizando Molecular Simulations & # x02019 (Waltham, MA) insightII y software de biopolímero en una estación de trabajo de gráficos Indigo2 de Silicon Graphics (Mountain View, CA). Utilizando la alineación de secuencia entre la subunidad accesoria de Drosophila melanogaster pol & # x003b3 y la estructura cristalina 2.4 - & # x0212b de los residuos 288 & # x02013386 de T. thermophilus pro-RS, se utilizó la columna vertebral de pro-RS como plantilla estructural, y las cadenas laterales que difieren en pol & # x003b3 - & # x003b2 se sustituyeron individualmente. Para dos de los tres bucles cortos entre estructuras secundarias regulares que difieren entre pol & # x003b3 - & # x003b2 y pro-RS, se usó la función de bucle de búsqueda en biopolímero para identificar un bucle de estructura conocida con longitud, geometría y empaquetamiento apropiados para su uso como plantilla estructural para el tercer bucle, entre & # x003b2-strands 4 y 5, el bucle correspondiente en la estructura de T. thermophilus histidil-RS (entrada PDB 1adj) (18) se utilizó como plantilla, seguido de sustitución de la cadena lateral cuando fue necesario. Cuando las sustituciones de la cadena lateral dieron como resultado colisiones estéricas, se resolvieron mediante ajustes mínimos del ángulo de torsión en insightII, seguidos de la minimización de energía solo en las regiones del bucle, mediante 100 pasos de minimización de descensos más pronunciados con el campo de fuerza de valencia consistente CVFF mediante el uso del software Discover (Simulaciones moleculares, Waltham, MA). La estereoquímica del modelo estructural final del dominio C-terminal de pol & # x003b3 - & # x003b2 se validó mediante el uso de procheck (19, 20), y se evaluó la favorabilidad de los entornos de aminoácidos dentro de esta estructura mediante el método del perfil 3D. (21) a través del servidor verify3D (http://www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Verify3D.html). Se realizaron comparaciones estructurales en 3D entre el modelo de subunidad accesoria y las estructuras cristalográficas disponibles de tiorredoxina y la subunidad & # x003b4 & # x02032 de la ADN polimerasa III con el servidor dali (22) (http://www.embl-ebi.ac.uk / dali).


Resultados

Plegado del subdominio RED

Anteriormente hemos demostrado que el dominio de unión al ADN de la transposasa SB no forma una estructura estable en condiciones fisiológicas.17 Sin embargo, la reacción de transposición ocurre en el núcleo celular, en un ambiente extremadamente concurrido. Por lo tanto, primero investigamos si el hacinamiento induce el plegamiento del subdominio RED. Se han utilizado dos agentes para imitar el efecto del apiñamiento, polietilenglicol (PEG 6000) y Ficoll & # x0201070. Se espera que estos agentes de apiñamiento aumenten la compacidad de una proteína debido a los efectos de volumen excluidos. subdominio en presencia de concentraciones crecientes de PEG 6000 (panel A) o Ficoll & # x0201070 (panel B). Los espectros de CD demuestran que el subdominio RED por sí solo no tiene una estructura secundaria significativa. Además, la presencia de PEG 6000 o Ficoll & # x0201070 no aumenta notablemente la estructura secundaria en el subdominio RED en las concentraciones utilizadas en este estudio. La Figura & # x200B La Figura 1 (C, D) 1 (C, D) muestra espectros 2D [1 H, 15N] & # x02010HSQC del subdominio RED. La distribución estrecha de picos cruzados en la dimensión del protón indica que el subdominio RED solo está desordenado (panel C). Los picos se ensanchan, lo que podría deberse al intercambio conformacional entre diferentes estados desordenados o por asociación. En presencia de Ficoll & # x0201070, los picos en el espectro [1 H, 15N] & # x02010HSQC del subdominio RED se vuelven significativamente más nítidos. Tal cambio espectral sugiere que el espacio conformacional muestreado por el subdominio RED (entre diferentes estados desordenados u oligoméricos) se reduce en presencia de apiñamiento. Sin embargo, la mayoría de los picos cruzados permanecen en sus posiciones originales y la distribución del desplazamiento químico sigue siendo estrecha. Juntos, los datos de CD y RMN indican que el subdominio RED permanece desordenado en condiciones de hacinamiento.

Plegado del subdominio RED en presencia de hacinamiento. Los espectros de CD de UV lejano y [1 H, 15N] & # x02010HSQC RMN del subdominio RED en presencia de PEG 6000 (A, B) y Ficoll & # x0201070 (C, D) se recogieron en tampón MES acuoso 20 mM a pH 5,0 . El aumento de la concentración de amontonamientos no induce una cantidad significativa de estructura helicoidal alfa. Las flechas indican concentraciones crecientes de multitudes.

A continuación, se ha investigado el efecto de las sales sobre el plegamiento del subdominio RED. Se sabe que los iones kosmotrópicos tienden a precipitar proteínas y estabilizar su estructura, mientras que los caotrópicos tienden a mejorar la solubilidad de las proteínas y favorecer la desnaturalización.20 Este comportamiento es más pronunciado para los aniones que para los cationes, y el orden típico de la serie de aniones de Hofmeister es el CO 3 2 & # x02212 & # x02009 & # x0003e & # x02009SO4 2 & # x02013 & # x02009 & # x0003e & # x02009H2correos4 2 & # x02013 & # x02009 & # x0003e & # x02009F & # x02212 & # x02009 & # x0003e & # x02009Cl & # x02212 & # x02009 & # x0003e & # x02009 NO 3 & # x02212 & # x02009 & x # x030003e & # x02009 ClO 4 & # x02212 y para la serie de cationes es K + & # x02009 & # x0003e & # x02009Na + & # x02009 & # x0003e & # x02009Mg 2+ & # x02009 & # x0003e & # x02009Ca 2+ (kosmotropes, donde el cloruro está a la izquierda) generalmente se considera la línea divisoria entre estos dos tipos de comportamiento. En consecuencia, probamos el efecto de Na2ASI QUE4, KCl, NaCl y NaClO4 sobre el plegado del subdominio RED. La Figura & # x200B La Figura 2 2 muestra los resultados de los experimentos de titulación con estas sales. Los espectros de CD de UV lejano del subdominio RED muestran que los rasgos característicos de la estructura secundaria helicoidal alfa surgen tras la adición de todas las sales, es decir, dos bandas negativas a 208 nm y 222 nm y una banda positiva a 193 nm. Los cambios espectrales son consistentes con la observación de que las proteínas cargadas positivamente siguen la serie directa de Hofmeister a altas concentraciones de sal (por encima de 200 & # x02013300 mM de sal monovalente), 21 es decir, la adición de NaClO4 tiene el menor efecto sobre la estructura del subdominio RED. La adición de Na2ASI QUE4 conduce a la mayor cantidad de estructura secundaria helicoidal alfa según la magnitud de la elipticidad a 222 nm (Fig. & # x200B (Fig. 2). 2). Además, en contraste con Na2ASI QUE4, se observa cierta reducción en la intensidad del espectro de CD después de la adición de KCl, NaCl y NaClO4, que puede tomarse como evidencia indirecta de la autoasociación del subdominio RED. Por lo tanto, Na2ASI QUE4 fue seleccionado para experimentos de RMN.

Plegado del subdominio RED en presencia de diferentes sales. Espectros de CD de UV lejano del subdominio RED recogidos en tampón MES acuoso 20 mM a pH 5,0 en presencia de hasta 800 mM de NaClO4 (A), NaCl (B), KCl (C) y Na2ASI QUE4 (D). Las flechas indican concentraciones crecientes de sales. El mayor contenido de alfa & # x02010 helicoidal se observa en presencia de Na2ASI QUE4.

Estructura de la solución de RMN del subdominio RED

El espectro 2D [1 H, 15N] & # x02010HSQC con asignaciones de señales de RMN se muestra en la Figura & # x200B Figura 3. 3. Las asignaciones de resonancia se llevaron a cabo como se describe en la sección Materiales y métodos. Los números de residuos que se muestran en la Figura & # x200B Figura3 3 corresponden a posiciones en la secuencia de transposasa SB original, completa & # x02010 de longitud.7 La secuencia de aminoácidos del subdominio RED se muestra en la Figura & # x200B Figura3 3 como referencia. Los elementos de la estructura secundaria del subdominio RED se identificaron utilizando el software TALOS22 y CSI23. Ambos métodos predicen tres & # x003b1 & # x02010 hélices (residuos 67 & # x0201377, 84 & # x0201393 y 100 & # x02013109 según TALOS y 67 & # x0201374, 84 & # x0201393, 100 & # x02013109 según CSI) para el subdominio RED1 (Fig. ), de acuerdo con los experimentos de CD [Fig. & # x200B [Figura 2 2 (D)].

Estructura de la solución de RMN del subdominio RED. (A) Espectro asignado [15N & # x02010 1 H] & # x02010HSQC del subdominio RED. El espectro se registró en solución acuosa 20 mM (5% D2O / 95% H2O) Tampón MES a pH 5,0 en presencia de Na 650 mM2ASI QUE4. La secuencia de aminoácidos del subdominio RED, que contiene los residuos 63 & # x02013120 de la secuencia de transposasa SB original, se muestra debajo del espectro como referencia. (B) Estructura de la solución de RMN del subdominio RED. C & # x003b1 se muestran los trazos de las 10 estructuras de energía más baja superpuestas (izquierda) y la representación de dibujos animados de la estructura representativa de RED (derecha). Las hélices alfa identificadas están etiquetadas como H1, H2 y H3.

El conjunto de 10 estructuras de energía mínima superpuestas que se seleccionaron para el análisis final se muestra en la Figura & # x200B Figura 3 (B). 3 (B).Estas estructuras tienen RMSD de las coordenadas de los átomos de la columna vertebral C & # x003b1 para residuos bien ordenados (es decir, residuos comprendidos en tres elementos de estructura secundaria) de 0,8 & # x02009 & # x000b1 & # x020090.2 & # x000c5. Las coordenadas de las 10 estructuras de menor energía se depositaron en el Protein Data Bank con el código de acceso pdb 5UNK. El ID de BMRB para esta entrada es 30239. La Figura & # x200B La Figura 3 (B) 3 (B) también muestra una estructura de energía más baja representativa del subdominio RED en una representación de dibujos animados a la derecha. La estructura experimental del subdominio RED muestra la presencia de tres & # x003b1 & # x02010helices. Las hélices abarcan los residuos R67 & # x02010I78 (hélice H1), A84 & # x02010T94 (hélice H2) e I100 & # x02010L112 (hélice H3), donde las hélices H1 y H2 están dispuestas casi paralelas entre sí, y la hélice H3 se pliega encima de ellas. . Las hélices son un poco más largas de lo predicho por TALOS y CSI. El contenido de hélice total del subdominio RED es & # x0223c48%. Las hélices H1 y H2 están conectadas por un giro de cuatro residuos (residuos N79 & # x02010T83), siendo la prolina P80 el segundo residuo. La hélice H2 del motivo de hélice predicho termina con un residuo de glicina y está unida a la hélice H3 por un bucle largo de seis residuos. Este bucle no forma una beta canónica ajustada & # x02010turn, sino que forma una conformación extendida & # x02010like & # x02010. La estructura calculada revela la presencia de un motivo de recubrimiento H2 de hélice C3 & # x02032 & # x02192C3 / C & # x02032G que está formado por los residuos L91 & # x02010EETGTK & # x02010V98 que representan un patrón hxxx & # x02010Gpxh (h & # x02009 = # x02009 & # x02009indiferente, G & # x02009 = & # x02009glicina, yp & # x02009 = & # x02009 residuos polares) .24 C & # x003b2 los desplazamientos químicos pueden predecir el recubrimiento de la hélice y los motivos estructurales de giro beta en proteínas con alta precisión.25 En el caso de los desplazamientos químicos del subdominio RED, C & # x003b2 del tramo de residuos entre L91 y V98 siguen el patrón esperado para el motivo de remate de hélice alfa & # x02010. Los residuos K97 & # x02010I100 están en conformación extendida, conduciendo a la hélice H3.

La estructura del subdominio RED se asemeja a las estructuras del subdominio correspondiente de las transposasas Mos1 y Tc3,15, 26 de Tc1 / mariner estrechamente relacionadas, sin embargo, presenta hélices H2 y H3 más largas y bucles que conectan las hélices (Fig. & # X200B (Fig. 4) ). 4). La hélice H2 en el subdominio RED se extiende por 11 residuos, mientras que en las transposasas Tc3 y Mos1 se extiende por 9 y 5 residuos, respectivamente. La hélice H3 en el subdominio RED abarca 14 residuos frente a 12 residuos en Tc3 y 11 residuos en la transposasa Mos1. El bucle que conecta las hélices H1 y H2 en el subdominio RED tiene una longitud de 5 residuos, mientras que en las transposasas Tc3 y Mos1 tiene sólo 3 y 2 residuos, respectivamente. El bucle que conecta las hélices H2 y H3 tiene una longitud de 6 residuos en el subdominio RED y una longitud de solo 4 residuos en las transposasas Tc3 y Mos1. La alineación de secuencia de acuerdo con la correspondencia de las tres estructuras realizada con PROMALS3D servidor de alineación de secuencia y estructura múltiple 27 refleja estas diferencias (Fig. & # X200B (Fig.4 4).

Alineación estructural del subdominio RED de la transposasa SB y los subdominios de unión de ADN terminal C & # x02010 & # x02010 de las transposasas Tc3 (código pdb 1U78 26) y Mos1 (código pdb 3HOS 15). Las estructuras de proteínas se superpusieron y luego simplemente se desplazaron a lo largo X (eje horizontal. La alineación estructural se realizó utilizando el servidor de alineación de estructura y secuencia múltiple PROMALS3D. Las tres hélices alfa están etiquetadas como H1, H2 y H3. El motivo helix & # x02010turn helix en los subdominios Tc3 y Mos1 está formado por las hélices H2 y H3. El alineamiento de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la correspondencia de las tres estructuras muestra una similitud de secuencia de aminoácidos baja entre el subdominio RED y los subdominios correspondientes de las transposasas Tc3 y Mos1, y los únicos tres residuos en las posiciones conservadas están subrayados. Los residuos que forman hélices alfa se muestran en rojo. La posición de las hélices en el subdominio RED también se indica mediante rectángulos rojos sobre la secuencia de aminoácidos.

La unión del subdominio RED al ADN del transposón

Anteriormente, hemos determinado que el subdominio RED, cuando es parte del dominio de unión completo & # x02010length DNA & # x02010, se une al sitio de unión externo en la repetición terminal invertida del transposón SB, aunque débilmente.17 Sin embargo, debido a un ensanchamiento severo de esencialmente todas las señales de RMN que se originan en el subdominio RED, no se pudo determinar el sitio de unión del ADN & # x02010. Para localizar el sitio de unión del ADN & # x02010 en el subdominio RED, investigamos la interacción del subdominio RED aislado con la secuencia de ADN correspondiente al sitio de unión externo ubicado en la repetición terminal invertida izquierda del ADN del transposón, Lo, mediante el seguimiento de los cambios de desplazamiento químico en el espectro ROJO [1 H, 15N] & # x02010HSQC en presencia de concentraciones crecientes de ADN. Estos experimentos se llevaron a cabo a 650 mM de Na2ASI QUE4, debido a que a una concentración de sal más baja, muchas señales que se originan a partir de residuos en las hélices mostraron un ensanchamiento significativo debido al régimen de intercambio conformacional intermedio a lento entre las conformaciones plegadas y desplegadas, por lo que no fueron observables o fácilmente distinguibles en el espectro. La presencia de sal 650 mM redujo parcialmente la contribución electrostática a la unión, pero el componente no electrostático independiente de la sal, que proviene de los efectos de la deshidratación, las interacciones de van der Waals y los enlaces de hidrógeno, no se vio afectado.28 Se observaron pequeños cambios en el [1 H & # x02010 15 N] & # x02010HSQC espectro del subdominio RED tras la adición de una proporción molar de Lo de hasta 1: 1, de acuerdo con la imagen obtenida del análisis anterior de que la interacción entre el subdominio RED y el ADN del transposón es débil y dinámico.17 Debido a pequeños cambios espectrales, no es posible determinar un valor constante de disociación para la interacción RED & # x02010Lo. La Figura & # x200B La Figura 5 (A) 5 (A) ejemplifica los cambios de señal causados ​​por la unión a la secuencia Lo. Tanto el desplazamiento químico como la intensidad de algunas señales cambian, lo que indica que la unión está en el régimen de intercambio lento intermedio caracterizado por un desplazamiento moderado y un ensanchamiento significativo de las señales [1 H, 15N] & # x02010HSQC desde su posición libre. Las resonancias de las amidas que experimentan el cambio químico más grande al unirse al ADN, experimentan el ensanchamiento de línea más extenso en el espectro [1 H, 15N] & # x02010HSQC. El espectro completo se muestra en la Figura S2. Se observaron cambios de desplazamiento químico y pérdidas de intensidad de señal para las amidas en toda la proteína. Los residuos afectados por la presencia de Lo están codificados en color azul en la estructura del subdominio RED [Fig. & # x200B [Figura 5 (B)]. 5 (B)]. Sin embargo, el efecto fue más pronunciado para los residuos que se agrupan alrededor de las hélices H3 y el bucle que conecta las hélices H3 y H2, en línea con las predicciones de que la hélice H3 es el sitio principal para la interacción con el ADN en una variación del motivo hélice & # x02010turn & # x02010helix .29, 30 Este resultado es consistente con la ubicación esperada del sitio de unión del subdominio RED basado en la comparación con las estructuras conocidas X & # x02010ray de las transposasas Tc3 y Mos1 resueltas en la forma unida al ADN & # x0201015, 26 y a la recientemente propuesta modelo estructural de SB transposasa & # x02010DNA complex.14 También es consistente con la ubicación del ADN & # x02010 sitio de unión en el dominio terminal C & # x02010 de otros dominios bipartitos de ADN & # x02010 que se unen PAIRED, con los cuales el ADN & # x02010 dominio de unión de la transposasa SB muestra similitud .31, 32, 33, 34 Además, la hélice H3 es anfipática con las cadenas laterales de residuos polares y cargados positivamente (S101, T102, K104, R105, Y108 y R109) que sobresalen ing de la superficie, capaz de hacer contactos con el ADN.

Unión del subdominio RED al ADN. (A) Sección del espectro [15N, 1H] & # x02010HSQC del subdominio ROJO puro (azul) y del subdominio ROJO en presencia de una relación molar de 1: 0,5 (cian) y 1: 1 (rojo) de la secuencia de ADN correspondiente al sitio de unión de la transposasa externa en el ITR izquierdo (Lo). Los espectros se recogieron en solución acuosa (5% D2O / 95% H2O) tampón MES 20 mM a pH 5,0 en presencia de Na 650 mM2ASI QUE4. (B) La estructura de dibujos animados del subdominio RED muestra los residuos afectados por la unión a la secuencia Lo en azul. Las hélices H2 y H3 y el enlazador entre ellas que forman una conformación similar a una vuelta corresponden al motivo de la hélice y la hélice identificada en las transposasas relacionadas Tc3 y Mos1. (C) Superficies electrostáticas trazadas en una estructura representativa del subdominio RED. El potencial electrostático se ha calculado utilizando el solucionador adaptativo de Poisson & # x02010Boltzmann (APBS) 52 y se ha visualizado con PYMOL.51 Las superficies están coloreadas por carga (el rojo es negativo, el azul es positivo, el blanco no está cargado o es hidrófobo). La escala se muestra debajo de las superficies. El subdominio ROJO se muestra en dos orientaciones giradas 180 & # x000b0 alrededor de su eje vertical.

Algunos residuos alejados de la hélice H3, por ejemplo, ubicados en la hélice H1, también mostraron cambios tras la adición de ADN. Para obtener más información sobre el ADN del subdominio RED y las propiedades de unión # x02010, analizamos la superficie electrostática del subdominio RED. Figura & # x200B Figura 5 (C) 5 (C) muestra el potencial electrostático mapeado en la superficie del subdominio RED en dos orientaciones, una es similar a la orientación en la Figura & # x200B Figura 5 (B) 5 (B) y otra es girado 180 & # x000b0 sobre el eje vertical. El subdominio RED es una molécula altamente cargada positivamente que contiene 9 residuos de arginina y 7 de lisina. Cinco de estos residuos están ubicados en la hélice H3, cuatro en la hélice H1 y dos lisinas están ubicadas en la hélice H2 con cadenas laterales orientadas hacia afuera en la dirección de la hélice H3. La superficie electrostática muestra una gran región cargada positivamente formada por residuos en las hélices H3 y H2 y en el extremo C & # x02010 consistente con esta región que forma un sitio de unión al ADN & # x02010. Sin embargo, hay otra región cargada positivamente formada por la hélice H1 en el lado opuesto de la molécula. Dado que la interacción entre el subdominio RED y el ADN es débil, este parche de carga positiva también podría participar en interacciones transitorias entre el subdominio RED, al menos de forma aislada, y Lo ADN. Esto sería coherente con la actividad de unión del ADN no específico del subdominio RED señalado anteriormente.9 En consecuencia, son plausibles varias razones para el cambio en el desplazamiento químico y la intensidad de los residuos que se alejan de la hélice H3. Primero, como el cambio químico es muy sensible a cualquier tipo de variación estructural, es probable que estos residuos se vean afectados indirectamente por posibles cambios conformacionales en la proteína al unirse al ADN. De hecho, las cadenas laterales de algunos de estos residuos están orientadas hacia el interior de la proteína (por ejemplo, D68, E69 y V76). En segundo lugar, las interacciones transitorias con el ADN a través del segundo parche cargado positivamente formado por la hélice H1 también pueden contribuir a cambios en la señal (por ejemplo, R70, R74 y K75).


Discusión

Hemos determinado la estructura de la solución de apo p63-DBD usando espectroscopia de RMN (Fig. 1) y caracterizado la interacción con varios sitios de unión de ADN (Figs. 3 y 4) y el miembro antiapoptótico de la familia Bcl2 BclxL (Fig. 5). p63-DBD adopta una estructura casi idéntica a p53-DBD (Fig. 2b). Sin embargo, existen diferencias en la especificidad de unión al ADN y en su estabilidad termodinámica que hacen que p63 sea un objetivo atractivo para comprender la base estructural de la especificidad de unión al ADN y la estabilidad de la proteína entre la familia de proteínas p53.

A pesar de la disponibilidad de información estructural y datos de unión al ADN, la especificidad del gen diana de p63 aún no está clara. La transactivación de genes diana de p53 que regulan la detención del ciclo celular por p63 ha sido demostrada por en vivo Los ensayos de unión de ADN 58 y los experimentos de ChIP con fibroblastos de embriones de ratón que expresan E1A revelaron la unión de p63 a genes diana de p53 proapoptóticos, así como a MDM2, cuya expresión conduce a la degradación de p53 59. Otro factor es la aparición de variantes de p63 truncadas que carecen de su dominio de transactivación (TA) N-terminal (ΔNp63). Estas variantes adoptan una función de represión de la transcripción 4 y son capaces de inhibir la transcripción de genes diana de p53. Además, p63 y p73 contienen un SAM 26 C-terminal y un dominio regulador 25 que influyen en su capacidad para transcribir genes diana. Otra capa de complejidad se agrega por la presencia de diferentes estados oligoméricos, donde el dímero parece ser la especie inactiva para la transcripción y el tetrámero la especie activa. La formación de tetrámeros y la activación de unión al ADN de p63 resultante es promovida por la fosforilación 13.

Se ha demostrado que la eliminación de p63 y p73 no afecta la transcripción de genes que regulan la detención del ciclo celular, como p21 59. Sin embargo, p63 y p73 parecen ser necesarios para la inducción eficaz de genes dependientes de p53 proapoptóticos. Estos resultados indican que los genes relacionados con la apoptosis están regulados específicamente dentro de toda la familia p53. Por otro lado, el desarrollo epitelial mediado por p63 no se ve afectado por la desactivación de p53. Nuestros ensayos de unión de ADN (Fig. 3) indican la interacción de p53 y p63 con elementos de respuesta de ADN involucrados en la detención del ciclo celular, apoptosis y desarrollo en diversos grados. Se ha informado previamente que la unión al ADN de p53 se basa en el establecimiento de un puente de sal doble 41, una característica específica de p53. Por lo tanto, introdujimos un puente de sal doble en p63-DBD y analizamos el cambio en la afinidad de unión en comparación con p63 de tipo salvaje. La suposición es que p63-DBD capaz de formar un puente salino se une a genes dependientes de p53 con mayor afinidad, mientras que menos genes dependientes de p53 mostrarían una dependencia más débil o nula de la presencia del puente salino doble. De acuerdo con publicado en vivo datos 59 el mayor cambio en la afinidad se pudo observar para p21 RE, lo que confirma un papel menos dominante de p63 en la inducción de la detención del ciclo celular. Un sitio de consenso específico de p53 (con2 × 5) mostró una dependencia similar de la presencia del puente de sal doble. La participación del puente de sal doble en la unión cooperativa de ADN de alta afinidad también podría confirmarse mediante estudios de perturbación del cambio químico de RMN con p53-DBD versus wt-p63-DBD (Figura 4). Estos datos demuestran que p53 ha evolucionado para una unión de alta afinidad al ADN y, por lo tanto, debe regularse estrictamente mediante un equilibrio de degradación y producción de proteínas cuidadosamente equilibrado. Por el contrario, la unión a la Bax RE no se ve afectado significativamente por el puente de sal doble, lo que confirma que los genes proapoptóticos podrían ser menos específicos de p53. El RE dependiente de p63 de Jag-1 48, un gen involucrado en la diferenciación y proliferación celular, muestra un patrón de afinidad independiente del puente de sal similar al de Bax. Estudios recientes demostraron que p63 es menos propenso a degradarse a través de la vía ubiquitina-proteasoma 60, debido a una menor afinidad entre Mdm2 y p63. Por lo tanto, es probable que la concentración celular de p63 sea más alta que la de p53, lo que permite que p63 se una de manera eficiente a elementos de ADN e incluso compita con p53.

La importancia de p63 en la inducción de apoptosis se subraya por su interacción con la proteína anti-apoptótica BclxL (Fig. 5). La superficie de interacción entre ambas proteínas consiste en la interfaz de unión al ADN cargada positivamente en p53 / p63-DBD (Fig. 3 complementaria) y un área superficial cargada negativamente en BclxL 50,57. Como se mostró anteriormente para p53, la interacción directa con las proteínas Bcl2 induce una rápida apoptosis mitocondrial 49,50,54,55,56 de forma independiente de la transcripción. Para cumplir su función en la protección del desarrollo epitelial y de las extremidades, p63 podría utilizar vías de apoptosis tanto directas como indirectas. El potencial apoptótico de p63 también está en consonancia con su papel en la protección de la línea germinal femenina y su fuerte patrón de expresión en los ovocitos 13, donde participa en la muerte de los ovocitos inducida por daños en el ADN, independientemente de p53.

En comparación con p53, p63-DBD muestra una estabilidad térmica aumentada de más de 20 ° C (Fig. 2c). Una variedad de mutaciones puntuales de p53-DBD relacionadas con el cáncer conducen a una desestabilización significativa de la proteína ya frágil, lo que impide el plegamiento adecuado y la transactivación génica. La base de la baja estabilidad de p53-DBD es el empaquetamiento desfavorable de su núcleo hidrófobo, causado por cadenas laterales polares aisladas y cavidades internas (Fig. 2f). Se han realizado enormes esfuerzos para diseñar variantes de p53-DBD con mayor estabilidad para estudios estructurales 31,32,33,43,44 que eventualmente podrían usarse para enfoques terapéuticos genéticos 61. Para uno de estos estudios, nuestra estructura de solución p63-DBD sirvió como plantilla para el diseño semirracional de las variantes de p53 44. Además, se han informado moléculas pequeñas que estabilizan la conformación activa para p53 34,35. La calidad del empaquetamiento hidrofóbico se mejora significativamente en p63-DBD (Fig. 2e) y las variantes de p53 optimizadas, en consecuencia, muestran el mismo tipo de aminoácido en posiciones críticas que se encuentran en p63 o en ortólogos de p53 más estables. Debido a su alta estabilidad termodinámica, es menos probable que la actividad de unión al ADN de p63 disminuya por mutaciones puntuales en su núcleo proteico, como se muestra en el caso de p53. Además, no se han encontrado mutaciones desestabilizadoras dentro de p63-DBD en tejidos cancerosos [19]. Por tanto, se ha sugerido que p63 actúa como un oncogén y no como un supresor de tumores. La forma oncogénica de p63 es la variante ΔN que carece de su dominio de transactivación N-terminal. Esta variante todavía puede unirse a elementos de ADN y competir con p53 y p63 de longitud completa para suprimir la apoptosis 62. Se han identificado mutaciones en p63 en enfermedades del desarrollo, como EEC 63 y ADULT 64, que afectan la capacidad de unión al ADN y no la estabilidad de la proteína. Hasta ahora, no está claro qué factores gobiernan la especificidad de unión y las funciones celulares de los miembros individuales de la familia p53. Aunque hay mucha información disponible para p53, p63 y en particular p73 están mucho menos exploradas. Se requieren futuros estudios estructurales y funcionales para aclarar estas preguntas abiertas.


Herramientas para popularizar MD

La preparación para la simulación implica el seguimiento de una serie de operaciones que distan mucho de ser rutinarias. Primero, la estructura inicial proviene del experimento. Los problemas esperados incluyen regiones o residuos no estructurados o faltantes, ligandos no estándar o incluso estructuras con errores en la interpretación de los datos experimentales. Cuando se simula un solo sistema, todo el esfuerzo en la preparación del sistema vale la pena, ya que asegura la calidad del resultado de la simulación. Esta configuración se suele realizar de forma manual, con un esfuerzo humano considerable. Un procedimiento estándar para configurar un sistema implica una serie de procedimientos bien conocidos: corrección de errores de estructura ionización de aminoácidos titulables adición de moléculas de agua estructurales, contraiones y minimización de solventes y energía y equilibrio del sistema a la temperatura deseada. Un modelador experto normalmente lleva a cabo estos procedimientos utilizando un conjunto de programas auxiliares. Dicho experto tiene los conocimientos necesarios para superar problemas específicos que puedan surgir. Por ejemplo, el flujo de trabajo utilizado en el proyecto MoDEL84 estaba programado para ejecutarse automáticamente, pero una fracción nada despreciable de más de 1.500 proteínas preparadas falló en algún punto del proceso. Con este escenario, para los recién llegados a la simulación MD, incluso una sola configuración del sistema podría representar un problema inasequible. Peor aún, los usuarios no expertos tienden a usar ciegamente los procedimientos predeterminados que conducen fácilmente a trayectorias de artefactos, que son difíciles de distinguir de las correctas. Esto contribuye en gran medida a la falta de popularidad de las simulaciones biomoleculares entre la bioinformática o la comunidad bioquímica. Las simulaciones de MD se han restringido a los grupos de investigación que cuentan con la experiencia necesaria. La solución de este problema requiere una configuración automática del sistema de simulación. Estaríamos buscando una caja negra inteligente para los no expertos, pero también un paquete de software robusto que pueda dar cuenta de un gran conjunto de estructuras de proteínas no relacionadas. Todos los códigos MD principales 56 & # x0201359 vienen con un conjunto de programas adjuntos, que realizan la mayoría de los pasos de la preparación. Además, una serie de iniciativas, que combinan esas herramientas con una interfaz fácil de usar, han entrado en escena para abordar este problema. CHARMM-Gui85 y CHARMMing, 86 para CHARMM o Guimacs, 87 Gromita, 88 y jSimMacs, 89 para GROMACS, proporcionan la funcionalidad de configuración automática. VMD90 proporciona una serie de complementos que permiten iniciar simulaciones con NAMD. La mayoría de estas herramientas proporcionan un entorno amigable para preparar sistemas para la simulación sin la necesidad de un conocimiento profundo de las operaciones subyacentes, facilitando así el acceso al campo para los recién llegados. Desafortunadamente, debido a la falta de un estándar para la representación de datos de simulación molecular, la mayoría de las aplicaciones auxiliares están restringidas a un solo paquete MD y los datos no son fácilmente intercambiables. Además, aunque la mayoría utiliza algún tipo de lenguaje de secuencias de comandos integrado, la automatización de procedimientos no es una tarea sencilla. Las lecciones aprendidas en la elaboración de la base de datos MoDEL, por nuestro grupo, llevaron a la generación de un nuevo conjunto de herramientas, MDMoby y MDWeb91, que intentan cubrir ambos aspectos del problema. Por un lado, MDMoby proporciona un conjunto completo de servicios web, que cubre todas las operaciones de configuración, simulación y análisis. La naturaleza modular de dicha colección de servicios web permite incorporarlos como un kit de herramientas para el diseño de protocolos de configuración complejos y ejecutarlos mediante programación. A su vez, MDWeb, una interfaz basada en web, proporciona un banco fácil de usar donde el usuario puede verificar la calidad de la estructura de entrada, personalizar sus propios protocolos de configuración o usar una colección de protocolos predefinidos.


CONCLUSIONES / PERSPECTIVAS

A pesar de los tremendos avances en el campo de la biología estructural de motivos i en los últimos años, muchos aspectos aún requieren más investigación. Los datos actuales sugieren fuertemente que los motivos i se forman transitoriamente en la célula. Sin embargo, más en vivo definitivamente se necesitan estudios para confirmar la formación del motivo i en diferentes fases del ciclo celular. Además, más investigación sobre el reconocimiento de motivos i por proteínas y ligandos pequeños in vitro y en vivo son esenciales para dilucidar el papel de los i-motivos en diferentes procesos biológicos. Debido a la naturaleza dinámica de los i-motifs, estos estudios se ven obstaculizados, particularmente en vivo, por la dificultad de discriminar entre el reconocimiento de secuencias ricas en C o el reconocimiento de la estructura del motivo i real. Las construcciones sintéticas de motivo i estabilizadas por modificaciones químicas (por ejemplo, 2′F-ANA) pueden facilitar estas investigaciones al "congelar" estas secuencias intrínsecamente dinámicas en la conformación del motivo i potencialmente activo. Los motivos i químicamente modificados, estables en una amplia gama de condiciones en comparación con sus homólogos no modificados, también se pueden utilizar para experimentos de cribado para identificar nuevas proteínas y pequeños ligandos que reconocen específicamente esta estructura.

Aún queda mucho por saber sobre las estructuras i-motif. En comparación con los G4, solo hay unas pocas estructuras de motivo i determinadas por métodos cristalográficos o de RMN. En la actualidad, no es posible predecir la estabilidad de un motivo i basándose en su secuencia. Por lo tanto, se necesita más información estructural para comprender completamente el efecto de las interacciones de limitación y los bucles que conectan los tractos C en la estabilidad del motivo i. A pesar de los recientes descubrimientos de ligandos de motivos i, el número de aglutinantes específicos de motivos i conocidos es muy limitado en comparación con los ligandos G4. Aún no se ha determinado la estructura tridimensional de un complejo i-motivo / ligando. Este será un gran logro para el desarrollo de fármacos potenciales basados ​​en el reconocimiento de i-motif.

Desde los primeros años del siglo, varios aspectos de los G4 han ganado un interés considerable en la investigación, principalmente debido a su estabilidad termodinámica en condiciones fisiológicas. Sin embargo, la estructura del motivo i ha sido el patito feo en la familia de estructuras de ADN no canónicas durante muchos años. Los resultados recientes arrojan una nueva luz sobre el campo de i-motif, que florecerá en los próximos años.


Parte 2: Dentro de una máquina de empalme de ARN

00: 00: 07.19 Soy Anna Marie Pyle de la Universidad de Yale
00: 00: 09.27 y hoy les voy a contar sobre la estructura
00: 00: 12.20 y la función de una máquina de empalme de ARN,
00: 00: 15.10 que es una molécula de ARN que puede cortar catalíticamente
00: 00: 18.15 y religar trozos de ARN, uniéndolos.
00: 00: 24.28 La máquina en la que me voy a centrar hoy se llama intrón autoempalmado del Grupo II
00: 00: 29.03 y esta molécula es una ribozima muy grande, o ARN catalítico,
00: 00: 33.19 que puede catalizar su propio empalme y su propia transposición,
00: 00: 37.02 lo que significa volver a los sitios de empalme anteriores.
00: 00: 41.09 Y estas son enzimas muy, muy grandes
00: 00: 44.01 y se encuentran entre las ribozimas más grandes de la naturaleza.
00: 00: 47.27 Y como puede ver aquí,
00: 00: 49.09 esta es la reacción que catalizan, pasa por dos pasos.
00: 00: 52.21 En el primer paso, el intrón se pliega en una estructura
00: 00: 56.11 que puede catalizar la reacción de empalme,
00: 00: 59.18 que está mediado por el agua,
00: 01: 01.12 o el grupo 2 'hidroxilo (2'-OH) de una adenosina dentro del intrón.
00: 01: 05.15 Después de ese paso, obtienes un lazo intermedio y,
00: 01: 09.00 en el segundo paso de empalme,
00: 01: 10.16 el grupo 3'-OH del sitio de empalme 5 'ataca de nuevo,
00: 01: 14.22 liberando un intrón de lazo y exones ligados.
00: 01: 19.07 Esto debería resultarte familiar
00: 01: 20.13 porque es el mismo tipo de reacción que se cataliza
00: 01: 23.12 por su espliceosoma nuclear,
00: 01: 25.06 que es la máquina de empalme que es importante para procesar todos nuestros ARN.
00: 01: 30.14 Para poner esto en perspectiva,
00: 01: 32.10 darse cuenta de que la mayoría de sus pre-mRNA, o mensajes precursores,
00: 01: 37.15 tienen hasta 10 intrones y, a veces, más.
00: 01: 40.29 Y estos deben eliminarse mediante la función de su espliceosoma.
00: 01: 44.16 Así que es muy importante que entendamos la especificidad
00: 01: 47.02 y el mecanismo de esta reacción.
00: 01: 50.02 Como sistema modelo,
00: 01: 50.25 Me he centrado en el sistema de auto-empalme de intrones del Grupo II.
00: 01: 55.03 La diferencia entre estos sistemas es que la estructura plegada
00: 01: 58.07 del intrón mismo cataliza esta reacción
00: 02: 01.25 en ausencia de proteínas,
00: 02: 03.25 mientras que el espliceosoma requiere cientos de proteínas
00: 02: 07.23 y un conjunto de moléculas de ARN muy conservadas
00: 02: 09.28 para catalizar la misma reacción.
00: 02: 12.08 Así que son sistemas en paralelo útiles para comprender la mecánica del empalme.
00: 02: 19.21 Así que centrémonos un poco más en cómo se ven los intrones del Grupo II:
00: 02: 23.02 su arquitectura de dominio y estructura secundaria se compone de seis ramas o dominios
00: 02: 27.27 que irradian desde una rueda central como esta.
00: 02: 31.13 Dominio 1, o el dominio más grande,
00: 02: 33.14 siempre se transcribe y se dobla primero
00: 02: 36.23 y es una especie de dominio de andamiaje en el que se acoplan todos los demás dominios.
00: 02: 40.28 También contiene secuencias para reconocer objetivos
00: 02: 44.08 que atacará y partirá,
00: 02: 46.02 especialmente su propio exón 5 '.
00: 02: 49.10 Los otros dominios no son críticos para la catálisis,
00: 02: 52.03 pero la parte más importante de un intrón del Grupo II
00: 02: 54.20 es este pequeño bucle de horquilla llamado Dominio 5.
00: 02: 58.16 Es la única parte de un intrón del Grupo II que es
00: 03: 00.29 casi invariable entre las diferentes especies
00: 03: 03.25 y esto es interesante porque los intrones del Grupo II son moléculas enormes.
00: 03: 07.20 Tienen un tamaño de 400-1000 nucleótidos
00: 03: 10.23 y es irónico que solo este poquito de 34 nucleótidos aquí
00: 03: 14.20 es su característica más conservada.
00: 03: 17.16 Otra parte importante de un intrón del Grupo II es el Dominio 6,
00: 03: 20.12 y este es el dominio que contiene la adenosina
00: 03: 22.28 que lleva el nucleófilo para el primer paso del empalme.
00: 03: 26.15 Sin embargo, muchos intrones del Grupo II usan agua como nucleófilo para el primer paso.
00: 03: 31.11 Ese es el plan organizativo básico para un intrón del Grupo II.
00: 03: 36.03 ¿Cuál es su mecanismo de reacción?
00: 03: 38.03 Bueno, catalizan una reacción SN2 muy simple,
00: 03: 41.11 que es un ataque nucleofílico en línea,
00: 03: 43.18 mediante el cual un alcohol, que es el grupo 2'-OH en
00: 03: 48.23 otra ribosa, o agua,
00: 03: 50.27 ataca en línea a este fosfato,
00: 03: 53.05 dándole un intermedio bipiramidal trigonal
00: 03: 57.07 y la liberación de este grupo fosfato y 3'-OH
00: 04: 01.06 con inversión de configuración.
00: 04: 03.29 Usando técnicas de biología química,
00: 04: 05.27 Joe Piccirilli descubrió que esto es una reacción
00: 04: 09.28 eso es catalizado por iones metálicos en el núcleo del intrón del Grupo II.
00: 04: 14.26 Y así, los intrones del Grupo II, como muchas ribozimas,
00: 04: 17.07 pero no todos,
00: 04: 17.22 es una metaloenzima y utiliza metales de la siguiente manera.
00: 04: 23.25 Mostró que los magnesios coordinan el grupo saliente
00: 04: 26.26 y el nucleófilo
00: 04: 27.28 para estabilizar la acumulación de carga negativa
00: 04: 30.23 en este estado de transición.
00: 04: 33.03 Entonces es una reacción relativamente simple
00: 04: 34.27 y es casi la misma reacción tanto en el primer como en el segundo paso
00: 04: 37.26 de empalme.
00: 04: 42.10 Entonces, conocíamos el plan corporal básico de estos ARN
00: 04: 44.20 y sabíamos qué tipo de reacción estaban catalizando,
00: 04: 47.12 pero realmente no entendimos el mecanismo preciso de la catálisis química.
00: 04: 51.19 Y también sabíamos que este ARN probablemente
00: 04: 53.22 para tener todo tipo de motivos estructurales terciarios interesantes.
00: 04: 57.24 Entonces, si quisiéramos comprender la arquitectura de esta molécula
00: 05: 00.27 y su mecanismo preciso,
00: 05: 03.00 necesitábamos una estructura de cristal de alta resolución.
00: 05: 06.18 Básicamente, lo que necesitábamos poder hacer era pasar de la estructura secundaria,
00: 05: 10.25 o mapa de atropello de la molécula, como me gusta llamarlo,
00: 05: 14.06 a la estructura terciaria.
00: 05: 16.12 Y les voy a contar un poco sobre ese viaje
00: 05: 18.15 y cómo comenzamos a visualizar el núcleo de una máquina empalmadora.
00: 05: 25.01 Todo comenzó con la identificación de un intrón del Grupo II
00: 05: 28.02 que cristalizaría fácilmente.
00: 05: 29.28 Y buscamos esta molécula durante unos 10 años,
00: 05: 32.24 mirando muchos, muchos tipos diferentes de intrones del Grupo II
00: 05: 35.08 y tratando de encontrar uno que fuera excepcionalmente estable y cristalizable.
00: 05: 39.09 Finalmente encontramos uno que cristalizó fácilmente
00: 05: 42.29 en la secuencia de la eubacteria Oceanobacillus iheyensis.
00: 05: 47.07 Y cuando transcribimos esta molécula,
00: 05: 49.01 encontramos que se empalmó y se estabilizó
00: 05: 51.20 a iones y temperaturas fisiológicas de magnesio muy bajas.
00: 05: 56.08 Y entonces era un candidato prometedor.
00: 05: 59.27 Luego procedimos a hacer alrededor de 120 construcciones diferentes de esta molécula
00: 06: 04.20 para intentar empacar
00: 06: 07.11 y haz bonitos cristales
00: 06: 09.01 a partir del cual podríamos resolver la estructura.
00: 06: 12.07 Y el número 87, de todos estos constructos,
00: 06: 14.27 finalmente cristalizó a una resolución de 3.1 Angstrom,
00: 06: 18.11 que está en el rango objetivo para resolver la estructura.
00: 06: 21.04 Y solo para mostrarte cómo modificamos esta molécula
00: 06: 23.23 para mejorar la cristalización gradualmente,
00: 06: 25.17 debe saber que modificamos las longitudes de todos estos diferentes tallos,
00: 06: 29.00 la composición del bucle,
00: 06: 30.25 cambió muchas, muchas cosas diferentes
00: 06: 32.12 para optimizar el empaquetamiento y la cristalización de la molécula.
00: 06: 37.10 Entonces, finalmente, al lograr ese nivel de calidad del cristal,
00: 06: 43.03 pudimos resolver su estructura usando cristalografía de rayos X.
00: 06: 47.07 Y la razón por la que me gusta mostrarles esta figura,
00: 06: 49.07 que ilustra la densidad electrónica del intrón Oceanobacillus,
00: 06: 53.28 es para mostrarte eso,
00: 06: 55.03 cuando, por primera vez, vislumbra la densidad de electrones,
00: 06: 58.09 o el resultado del experimento cristalográfico,
00: 07: 00.22 puedes ver las hermosas hélices que son aparentes
00: 07: 04.06 y puedes ver muy bien el plan general de la molécula
00: 07: 07.22 en el caso de ARN.
00: 07: 09.07 En las proteínas, a menudo es más difícil de ver
00: 07: 11.19 las características estructurales secundarias que en un ARN.
00: 07: 16.18 Así que este fue el ejemplo de nuestro primer vistazo de esta molécula.
00: 07: 21.14 Cuando finalmente pudimos modelar todos los nucleótidos en este mapa,
00: 07: 26.08 pudimos resolver básicamente la estructura completa de este intrón.
00: 07: 32.00 Y puedes ver de inmediato que esta es una forma notablemente globular.
00: 07: 37.01 Esto no es una simple doble hélice
00: 07: 38.14 y no es una serie desordenada de hebras,
00: 07: 40.26 es una molécula globular muy compacta,
00: 07: 43.09 mucho de lo que pensarías sobre una proteína globular.
00: 07: 46.03 Y hay una serie de características arquitectónicas que vale la pena señalar
00: 07: 49.10 y me concentraré en esto en un momento.
00: 07: 51.24 Pero puedes ver que hay una especie de andamio en la parte superior aquí,
00: 07: 56.13 y crea una cavidad en la que se inserta el sitio activo.
00: 08: 00.26 El sitio activo es este dúplex rojo,
00: 08: 03.26 y ese es el Dominio 5 del que les hablé antes.
00: 08: 06.27 El ARN muy, muy altamente conservado
00: 08: 09.06 que sabemos desde hace algún tiempo es probable que sea el sitio activo.
00: 08: 12.21 Y, curiosamente, estas hélices que proyectan los extremos aquí,
00: 08: 18.16 estos a menudo contienen espacios en los que los intrones del Grupo II pueden codificar
00: 08: 21.28 marcos de lectura abiertos para proteínas que se transportan dentro de la propia secuencia del intrón.
00: 08: 27.00 Y es interesante porque puedes ver que si este ARN fuera mucho más grande
00: 08: 31.19 se extendería y no se interpondría en el camino de
00: 08: 34.04 el sitio activo de ribozima tal como está doblado aquí.
00: 08: 42.17 Entonces, al mirar cuidadosamente esta molécula,
00: 08: 44.23 pudimos aprender muchas cosas,
00: 08: 46.09 y el primer tipo de cosas que les voy a contar
00: 08: 49.05 es cómo nos informó sobre las interacciones terciarias
00: 08: 52.08 y características estructurales terciarias en el ARN.
00: 08: 54.26 Esta molécula reveló muchos conceptos nuevos.
00: 08: 57.11 y la mayoría de ellos estaban dentro del Dominio 1 del intrón.
00: 09: 01.20 Recuerde que dije que el dominio más 5 'de un intrón del Grupo II
00: 09: 05.04 se pliega primero y se pliega de forma autónoma
00: 09: 07.16 en una estructura terciaria específica.
00: 09: 10.14 Dentro de la estructura del intrón del Grupo II,
00: 09: 12.22 podemos ver esto aquí.
00: 09: 14.24 El resto del intrón lo he desvanecido en gris
00: 09: 17.04 para que pueda concentrarse en el Dominio 1 en todos estos colores.
00: 09: 22.11 Dentro de este dominio hay una serie de motivos muy interesantes
00: 09: 24.11 y te mostraré algunos de ellos.
00: 09: 27.25 Por ejemplo, aquí se muestran dos de ellos en los que me gusta enfocarme.
00: 09: 32.09 Y para mostrarte dónde están en la estructura,
00: 09: 35.07 y esta región aquí en la estructura secundaria es un cruce de cinco vías,
00: 09: 38.25 que, como puedes imaginar,
00: 09: 40.01 tiene que adoptar una arquitectura bastante compleja para todas estas hélices
00: 09: 44.03 para apuntar en la dirección correcta y para que se forme el pliegue terciario.
00: 09: 48.02 Entonces, déjame mostrarte esta unión de cinco vías en un espacio tridimensional.
00: 09: 52.11 Esa es esta estructura aquí.
00: 09: 55.00 Es un conjunto notable de interacciones terciarias
00: 09: 57.16 y motivos concatenados.
00: 10: 00.18 Mi favorito, aquí arriba, se llama motivo de bucle en T,
00: 10: 03.23 y lo que ves es que este giro azul aquí
00: 10: 07.09 recuerda un motivo que vemos con frecuencia en las estructuras,
00: 10: 11.21 llamado GNRA tetraloop,
00: 10: 15.21 pero es casi como si tuviera un agujero:
00: 10: 18.01 falta una base en esta posición
00: 10: 20.07 y está lleno de una adenosina que viene
00: 10: 23.00 de esta parte gris de la molécula.
00: 10: 25.02 Entonces, gran parte de este ARN se mantiene unido de la misma manera
00: 10: 28.16 se habría construido una mesa antigua,
00: 10: 30.25 con clavijas que encajan en las ranuras y se mantienen juntas
00: 10: 34.00 todo el andamio de esa manera,
00: 10: 35.27 y estabilizado principalmente por interacciones de apilamiento de bases.
00: 10: 40.04 Y puede ver más interacciones de apilamiento conservadas
00: 10: 43.14 y las redes que se forman en esta posición aquí.
00: 10: 47.16 Otro tipo de parte favorita de la molécula para mí se llama ancla Z.
00: 10: 52.01 Y en la estructura secundaria,
00: 10: 54.08 podemos ver que este es el mecanismo
00: 10: 57.03 por el cual la hélice verde se vuelve realmente perfectamente paralela
00: 11: 02.09 con la hélice naranja, aquí, como puede ver en esta estructura.
00:11: 05.18 Así que estas dos hélices tienen que volverse una al lado de la otra.
00: 11: 09.00 ¿Cómo funciona?
00: 11: 10.24 Dos bucles dentro de ellos se funden de la siguiente manera.
00:11: 14.25 Así que aquí está la hélice naranja, aquí está parte de la hélice verde,
00: 11: 19.01 y lo que ocurre cuando surge la hélice naranja,
00: 11: 22.09 ves que tus pares de bases normales aquí abajo,
00: 11: 25.20 y luego una de las bases se voltea
00: 11: 27.29 y en lugar de formar un par de bases con otra hebra naranja,
00: 11: 31.06 forma un par de bases con la hebra verde.
00: 11: 34.00 Su próximo vecino viene y forma un par de bases
00: 11: 36.24 con otra hebra naranja,
00: 11: 38.14 y luego la siguiente base se voltea una vez más,
00: 11: 41.14 formando este zigzag de conexiones entre bases y dos hebras,
00: 11: 46.02 en lugar de una sola hebra.
00:11: 49.03 Entonces, esta estructura de tres hilos es una forma realmente interesante
00:11: 51.27 que los ARN pueden diversificar el reconocimiento de una hebra central.
00: 11: 59.09 Otro tipo de concepto para los tornillos y tuercas
00: 12: 01.29 por juntar el ARN que fue revelado
00: 12: 04.08 y ejemplificado por el intrón del Grupo II
00: 12: 09.11 es el motivo de la cremallera ribosa.
00: 12: 11.03 Esto fue descrito por primera vez por Cate y Doudna en 1996.
00: 12: 14.09 en una de las primeras estructuras cristalográficas de alta resolución
00: 12: 17.16 de una molécula de ARN compleja.
00:12: 20.16 Y lo que mostraron es este importante concepto:
00: 12: 24.11 que el grupo 2'-OH del azúcar ribosa es muy pegajoso
00: 12: 27.07 y puede formar enlaces de hidrógeno bifurcados
00: 12: 29.28 que pueden unir hebras de ARN.
00:12: 32.23 Entonces, si tiene una hebra de ARN aquí,
00: 12: 34.25 y una hebra de ARN aquí,
00: 12: 36.19 pueden unirse
00: 12: 39.06 por interdigitación de sus grupos 2'-OH.
00:12: 42.23 Y eso es exactamente lo que vemos en muchos lugares dentro del intrón del Grupo II.
00: 12: 47.05 Específicamente, aquí arriba,
00: 12: 49.16 hay una interacción de bucle de besos de largo alcance llamada alfa-alfa ',
00:12: 53.25 y les estoy mostrando estos pares de bases en esta representación aquí mismo,
00: 12: 58.15 al final de esa interacción,
00: 13: 00.07 las hebras de ARN se acercan mucho, muy juntas, como puede ver aquí.
00: 13: 04.19 Y cuando hacen eso,
00: 13: 05.21 cierran la cremallera y las ribosas y los grupos 2'-OH forman esta red
00: 13: 11.20 que sirve para unir todo el conjunto.
00: 13: 18.21 Entonces, hemos hablado de las interacciones terciarias
00: 13: 20.25 que fueron revelados por esta compleja estructura.
00: 13: 23.14 Ahora quiero hablarte un poco más sobre lo que está pasando.
00: 13: 25.24 en el sitio activo del intrón
00: 13: 28.02 y cómo cataliza la química.
00: 13: 30.29 Así que una de las cosas que me desconcertó durante mucho tiempo
00: 13: 33.00 cuando estaba mirando la estructura secundaria
00: 13: 36.13 y las características de conservación del intrón del Grupo II fueron que,
00: 13: 39.11 aunque el Dominio 5 estaba muy altamente conservado,
00: 13: 42.16 hubo un extraño y alto nivel de conservación
00: 13: 45.10 en este cruce entre los dominios 2 y 3.
00:13: 48.24 Y me pregunté, ¿por qué esos pocos nucleótidos en esa unión
00: 13: 52.16 tan conservado como el Dominio 5.
00: 13: 55.15 Y la respuesta vino de la estructura, que reveló
00: 13: 57.01 que la razón por la que se conservan al mismo nivel
00: 13: 59.29 es que son parte de la misma entidad estructural.
00: 14: 03.12 Puede ver que ese cruce está entrando
00: 14: 05.08 y se unen en el surco principal de esa hélice roja.
00: 14: 10.05 De cerca, se ve algo como esto:
00: 14: 12.09 forma una hermosa triple hélice,
00:14: 14.17 por lo que estos nucleótidos de unión entran
00: 14: 18.01 y forman enlaces de hidrógeno con el borde de la ranura principal
00: 14: 21.17 de la raíz inferior del dominio 5
00: 14: 24.05 y se forma otro a partir de otro sector del Dominio 5.
00: 14: 30.04 Entonces, esta triple hélice,
00: 14: 32.28 junto con una fuerte torcedura en la columna vertebral del ARN en esta posición,
00:14: 37.14 crean una plataforma de iones metálicos muy fuerte dentro del núcleo del intrón del Grupo II.
00:14: 43.15 Y la razón por la que esto está sucediendo es que te puedes imaginar aquí,
00: 14: 46.27 que hay muchos, muchos fosfatos que se están juntando
00: 14: 50.02 en un espacio muy, muy pequeño,
00: 14: 51.24 entonces el potencial electrostático en esta región de la molécula
00: 14: 55.02 se está volviendo extremo
00:14: 56.28 y se está volviendo muy, muy propicio
00: 14: 58.23 a la unión de iones metálicos en puntos específicos.
00: 15: 02.00 Y de hecho ves
00: 15: 03.14 que dos cationes divalentes se unen en esta posición
00: 15: 06.17 exactamente a 3.9 Angstroms de distancia.
00: 15: 10.13 Y esto a menudo es una firma para las enzimas
00: 15: 14.01 que catalizan la escisión del enlace de ribosa o desoxirribosa
00: 15: 18.14 a través de un mecanismo de iones de dos metales.
00: 15: 23.12 Entonces, a través de ese trabajo y el trabajo adicional que hicimos,
00: 15: 26.03 llegamos a saber que los metales 1 y 2 en esas posiciones
00: 15: 30.01 son de hecho los iones metálicos catalíticos que se requieren para empalmar,
00: 15: 33.26 tal como Joe Piccirilli había predicho a partir de experimentos de biología química.
00: 15: 37.29 Y están colocados justo sobre el eslabón de escisión
00: 15: 40.13 para romper esa unión en un sustrato objetivo.
00: 15: 45.10 Así que esto fue muy satisfactorio porque estaba claro
00: 15: 47.07 que teníamos una metaloenzima que era similar en algunos aspectos a otras enzimas
00:15: 51.28 y, sin embargo, sabíamos que esta no era toda la historia.
00: 15: 55.05 Y eso es porque, en la resolución cristalográfica
00: 15: 59.01 que estábamos usando para estudiar esta molécula,
00: 16: 01.02 vimos una densidad de electrones adicional que era consistente con otros iones metálicos.
00:16: 05.21 Pero los datos no eran lo suficientemente buenos como para interpretar sin ambigüedades su posición.
00: 16: 09.22 Así que trabajamos más duro en esto,
00: 16: 11.26 aumentando la resolución y usando dispersión anómala,
00: 16: 14.15 que es una herramienta para precisar la posición de los iones metálicos.
00: 16: 19.25 Específicamente, cuando mejoramos la resolución de nuestros cristales,
00: 16: 24.07 vimos que era muy probable que hubiera iones metálicos
00: 16: 27.06 también en esta posición y en esta posición.
00: 16: 30.18 Y debido a la forma en que el ARN circundante interactuaba con ellos,
00:16: 34.03 era muy probable que fueran iones de potasio.
00: 16: 37.09 Así que esto nos sorprendió,
00: 16: 38.26 que podría aparecer un catión monovalente simple
00: 16: 41.10 para jugar un papel tan importante en el sitio activo.
00: 16: 45.02 Para poder realmente hacer una fuerte declaración sobre esto,
00: 16: 46.26 tuvimos que identificar inequívocamente su posición,
00: 16: 49.21 y esto se hizo reemplazándolos con un ion pesado
00: 16: 52.26 que difracta los rayos X excepcionalmente bien
00: 16: 56.20 y eso es un buen imitador del potasio.
00:16: 58.28 Así que resolvimos 14 estructuras cristalinas más.
00: 17: 02.08 del intrón en todas estas diferentes combinaciones de metales.
00: 17: 06.09 Y, en particular, llamaré su atención sobre esta condición,
00: 17: 09.01 en el que el potasio fue reemplazado por talio
00:17: 12.18 y el magnesio se mantuvo igual.
00: 17: 15.06 Y en esta estructura,
00: 17: 16.16 se puede ver en un mapa de diferencias
00: 17: 18.16 que el talio está ocupando las posiciones exactas
00: 17: 22.23 que teníamos como hipótesis estaban ocupados por potasio.
00: 17: 25.25 Y debido a su similitud en radio iónico y función
00: 17: 29.23 y también la similitud con datos de rubidio paralelos,
00: 17: 32.23 que hace lo mismo,
00: 17: 34.16 confiamos en que habíamos ingerido potasio
00: 17: 37.09 como un componente importante del sitio activo.
00: 17: 43.00 Entonces, en este conjunto particular de estructuras,
00: 17: 46.00 estábamos mirando el intrón libre,
00: 17: 48.05 sin ningún sustrato unido,
00: 17: 50.06 con una buena resolución razonable.
00:17: 52.09 Y pudimos ver en este caso la siguiente imagen:
00: 17: 55.08 pudimos ver que había dos iones metálicos divalentes
00: 18: 00.16 (a falta de sustrato se coordinaron con agua)
00: 18: 01.14 y estaba claro que había potasio que estaban muy, muy cerca de ellos.
00: 18: 05.18 Y llamamos a los cercanos K1 y K2.
00: 18: 09.12 Una inspección minuciosa reveló que K1 es casi como una piedra angular
00: 18: 13.08 para la formación del sitio Metal 2 (M2).
00: 18: 16.03 Así que este ion metálico catalítico, que es absolutamente necesario para la química,
00: 18: 19.20 se mantiene en su lugar mediante la disposición de ligandos
00: 18: 22.25 que son posicionados por este potasio.
00: 18: 25.16 Y las estructuras posteriores mostraron,
00: 18: 27.03 como les contaré en un momento,
00: 18: 28.29 si estropeas este sitio por mutación
00: 18: 33.00 o reemplazo con un ion metálico del tamaño incorrecto,
00: 18: 35.14 El metal 2 no se une y mata la ribozima.
00: 18: 41.14 Así que esto fue solo un experimento de control para decirnos
00: 18: 43.17 que en todos estos extraños y anómalos iones de dispersión,
00: 18: 46.29 si seguíamos obteniendo química de las ribozimas o no.
00: 18: 50.26 Así que esta es la condición normal,
00:18: 52.23 donde ves un ARN precursor que se escinde en el fragmento intrón y los fragmentos exónicos.
00:18: 58.24 Y aquí puedes ver eso en talio,
00: 19: 01.02 es casi más feliz: ves que el precursor va al intrón y los componentes exónicos,
00: 19: 06.17 e incluso a través de un estado intermedio,
00: 19: 08.06 a un ritmo más rápido que en el caso del potasio.
00:19: 10.18 Así que incluso en el talio y el magnesio solos,
00: 19: 12.28 esta es una enzima muy feliz,
00:19: 14.21 así que tiene sentido que el talio reemplace los sitios de potasio.
00:19: 20.11 Así que todo lo que les he mostrado hasta ahora ha sido con el estado producto del intrón.
00: 19: 25.27 Este es un estado biológicamente relevante
00: 19: 28.09 porque ese intrón libre es capaz de realizar un empalme inverso
00:19: 32.16 en ARN de secuencia similar e incluso en ADN.
00: 19: 36.14 Así que sí importa,
00: 19: 37.29 pero al mismo tiempo tenía mucha curiosidad sobre
00: 19: 39.29 el papel del sitio activo en el empalme,
00:19: 42.20 y quería visualizar el primer paso del empalme.
00: 19: 45.21 Para ver el empalme, debes tener un exón de 5 '
00:19: 48.04 que está conectado al primer dominio del intrón.
00:19: 51.19 Así que, si bien esta era la construcción
00: 19: 52.24 que se usó para la información que les conté anteriormente,
00: 19: 56.29 tuvimos que crear uno nuevo
00: 19: 58.13 y resuelve un conjunto de estructuras completamente nuevo
00: 20: 01.25 con el exón 5 'adjunto.
00: 20: 03.18 Y lo hicimos.
00: 20: 06.07 Además, en presencia de todos esos iones metálicos inusuales.
00: 20: 09.28 Y ves lo siguiente interesante
00: 20: 11.29 cuando tiene adjunto el exón 5 ':
00: 20: 14.20 se puede ver el vínculo de escisión, donde va a suceder la química,
00: 20: 17.20 insertado justo sobre los iones catalíticos de magnesio
00: 20: 21.18 y puedes ver el fosfato cortante
00: 20: 23.13 ser atacado por un agua nucleofílica,
00: 20: 25.29 que también pudimos observar.
00: 20: 28.24 Y puedes ver los dos potasio
00: 20: 30.13 desempeñando su importante papel en el apoyo al sitio activo.
00: 20: 33.24 Obtuvimos esta estructura en presencia de calcio
00: 20: 36.22 y en este estado particular, el fosfato no se escinde.
00: 20: 40.03 Pero cuando agrega magnesio,
00: 20: 42.12 ves escote
00: 20: 43.25 y ves migrar el fosfato escindido
00: 20: 46.05 de esta posición al potasio 2.
00: 20: 49.27 Esto nos dice que el potasio 2 juega un papel clave en el mecanismo:
00: 20: 53.26 es importante para estabilizar
00: 20: 55.18 el producto de la reacción del primer paso.
00:20: 58.12 Entonces, cada ion metálico tiene un papel importante en todo el proceso.
00: 21: 06.05 Así que les acabo de hablar sobre K1 y K2,
00: 21: 07.29 M1 y M2,
00: 21: 09.09 pero no dejes que eso te haga pensar
00:21: 11.18 que esos son los únicos metales importantes en la estructura.
00:21: 14.13 Esos son los que son muy importantes para la química,
00: 21: 16.21 pero más trabajo que hemos hecho sobre la ocupación de iones metálicos
00:21: 20.22 en todo este ARN nos muestra que hay muchos, muchos iones metálicos
00: 21: 24.29 que tienen una alta ocupación en todo este ARN
00: 21: 27.24 y que apoyan los diversos motivos de la estructura terciaria.
00: 21: 31.28 Los iones metálicos juegan un papel esencial en la organización de las moléculas de ARN
00:21: 36.28 y por eso continuamos investigándolos también.
00:21: 43.12 Entonces, ¿qué hemos aprendido hasta ahora?
00:21: 46.05 El intrón nos ha enseñado sobre el mecanismo de empalme de pre-ARNm a nivel químico,
00:21: 50.07 pero también ha revelado algunas ideas nuevas sobre el ARN como catalizador.
00:21: 54.18 Nos muestra los siguientes conceptos:
00:21: 57.03 que, no solo los iones divalentes son importantes para la química de las ribozimas,
00: 22: 01.19 iones monovalentes también pueden jugar un papel,
00:22: 04.13 y el potasio es particularmente importante tanto en estructura como en catálisis.
00: 22: 09.29 Durante el empalme de intrones del Grupo II,
00: 22: 11.14 vemos que el potasio 1 y 2 juegan un papel cada uno
00:22: 14.24 en el mecanismo que es importante.
00:22: 16.26 Esto significa que los intrones del Grupo II,
00: 22: 18.00 y posiblemente otras ribozimas,
00:22: 19.22 no son simples enzimas de dos iones metálicos.
00: 22: 23.00 De hecho, al igual que las enzimas proteicas,
00: 22: 24.18 pueden estar usando grupos de metal,
00:22: 26.26 que es un caso muy, muy común en el mundo de las proteínas.
00: 22: 30.23 Entonces, grupos de metales heteronucleares compuestos de diferentes tipos de iones,
00:22: 34.13 puede ser un tema importante.
00:22: 37.19 Y esto también nos lleva al hecho de que cuando superpones
00: 22: 40.01 el sitio activo del intrón del Grupo II con enzimas proteicas,
00: 22: 43.07 puedes ver importantes paralelismos
00:22: 44.13 en la forma en que están haciendo química.
00:22: 49.13 Así que ahora les voy a contar un poco sobre
00:22: 51.11 lo que aprendimos de la forma de sodio de esta estructura,
00:22: 54.23 porque nos reveló por primera vez que hay un
00: 22: 57.26 conformación alternativa dentro del sitio activo del intrón del Grupo II.
00:23: 01.14 Y les diré cómo interpretamos eso.
00: 23: 05.00 Entonces, sabemos desde hace mucho tiempo que si accidentalmente creaba sus búferes,
00: 23: 08.18 o agregó sodio a una reacción que involucra
00:23: 11.22 cualquiera de los intrones del Grupo II con los que hemos trabajado,
00:23: 14.05 no ves ninguna reacción química.
00:23: 15.24 No ve ningún empalme.
00:23: 17.17 Entonces esto tiene sentido porque el sodio no tiene el mismo radio iónico que el potasio.
00:23: 21.16 y no encaja en los sitios de potasio.
00:23: 24.12 Y efectivamente, vemos que la forma sodio del intrón
00: 23: 27.11 adopta una conformación alternativa de sitio activo.
00:23: 32.14 Vemos lo que parece ser una palanca conformacional
00: 23: 35.01 entre los dos pasos de empalme que implican la rotación de dos bases,
00:23: 39.11 uno aquí y otro aquí.
00:23: 42.14 Lo que vemos es que en la forma anterior del intrón,
00:23: 44.24 tienes este gran triplex de groove aquí abajo
00:23: 47.29 y tienes ese giro cerrado en la columna vertebral del ARN,
00: 23: 50.20 y en forma de sodio, dos de esas bases se han volteado.
00: 23: 54.22 En un caso, 70 grados
00:23: 56.05 y en un caso una de las moléculas catalíticas de guanosina
00: 23: 59.21 se mueve desde esta posición hasta aquí,
00: 24: 02.17 ahora interactuando con un dominio completamente diferente: Dominio 3.
00: 24: 06.26 Cuando ocurre este tipo de reordenamiento arquitectónico,
00:24: 10.02 los iones metálicos en el sitio activo realmente salen
00: 24: 13.02 y crea un gran agujero abierto dentro del sitio activo.
00: 24: 17.02 Eso es realmente necesario
00: 24: 18.08 porque entre los pasos de empalme
00: 24: 21.02 los reactivos para el primer paso tienen que salir del camino
00: 24: 23.24 y los reactivos para el segundo paso deben ingresar.
00: 24: 26.10 Y entonces hemos planteado la hipótesis de que esto puede ser
00: 24: 29.10 el reordenamiento que debe ocurrir entre los pasos
00: 24: 32.03 para que pueda realizar los cambios necesarios
00: 24: 34.04 para estimular el segundo paso del empalme y completar el proceso.
00:24: 38.15 Entonces, si imagina que el empalme de intrones del Grupo II
00: 24: 40.29 tiene lugar con estos dos pasos, como expliqué antes,
00: 24: 44.11 de cerca puede ocurrir de la siguiente manera.
00: 24: 47.14 Sabemos que la disposición del sitio activo, antes,
00: 24: 51.00 y justo después del primer paso de empalme,
00:24: 52.29 se parece a esto,
00: 24: 54.11 con los dos iones de metales catalíticos y los potasios de soporte.
00: 24: 58.19 Y planteamos la hipótesis de que en un intermedio
00:25: 01.05 entre los dos estados implica la rotación de dos bases.
00: 25: 06.18 Después de que eso ocurra y se configure el segundo paso de empalme,
00: 25: 09.22 obtienes reforma del sitio activo
00: 25: 13.05 y los iones metálicos, y volver al estado inicial.
00: 25: 20.16 Entonces, si pensamos en la organización del sitio activo
00: 25: 24.22 para el primer paso de empalme,
00: 25: 26.08 es decir, el sitio que es competente para la química,
00: 25: 30.10 hemos podido tomar esa información
00: 25: 33.12 y aprenda mucho sobre la evolución del empalme
00: 25: 37.18 en eucariotas.
00:25: 40.03 Y la razón es que la estructura del intrón del Grupo II
00: 25: 43.02 sirvió como una especie de hoja de ruta para pensar en cómo la arquitectura
00:25: 46.16 del espliceosoma eucariota podría estar organizado.
00:25: 50.21 Y la razón por la que creo que es la siguiente.
00:25: 53.14 Dominio 5, este motivo altamente conservado que contiene todos los elementos del sitio activo,
00: 25: 58.10 se muestra aquí en una estructura secundaria como esta.
00:26: 01.16 Y estos, en líneas punteadas,
00: 26: 03.11 indicó las interacciones terciarias que fueron reveladas por nuestra estructura cristalina.
00:26: 08.01 Y sabemos que una de las moléculas de ARN realmente conservadas
00: 26: 12.05 en su espliceosoma,
00: 26: 13.13 llamado ARN nuclear pequeño U6,
00: 26: 16.00 tiene una estructura secundaria que siempre recuerda mucho al Dominio 5 en los intrones del Grupo II,
00:26: 22.05 y durante muchos años la gente planteó la hipótesis de que había una similitud entre ellos.
00:26: 25.11 Incluso unieron dos iones metálicos en lugares similares.
00:26: 29.11 Pero la estructura que resolvimos
00: 26: 31.17 sugirió que una porción de U6
00: 26: 33.19 podría hacer las mismas interacciones moleculares
00:26: 36.03 que habíamos observado en el intrón del Grupo II.
00:26: 39.14 Y trabajo reciente de los laboratorios de Joe Piccirilli
00: 26: 42.18 y John Stahley en la Universidad de Chicago,
00: 26: 45.08 usando ARN espliceosomales,
00: 26: 48.02 han demostrado de hecho que el sitio activo espliceosomal
00:26: 50.26 se ve muy, muy similar al del Grupo II.
00:26: 53.24 Y de hecho, M1 y M2 del espliceosoma
00: 26: 57.02 se colocan de la misma manera,
00: 26: 58.28 y según las bases previstas,
00: 27: 00.12 como se observa en el intrón del Grupo II.
00:27: 03.08 Esto es emocionante porque significa que,
00: 27: 05.19 como se predijo hace mucho tiempo,
00: 27: 07.29 que los intrones del Grupo II y el espliceosoma
00:27: 09.20 pueden compartir un ancestro evolutivo común.
00:27: 15.04 Entonces, para concluir,
00: 27: 17.28 a través de estudios de los intrones Oceanobacillus Grupo II,
00:27: 20.17 hemos visualizado la estructura y el sitio activo de una máquina de empalme de ARN,
00:27: 24.21 hemos identificado los iones metálicos en el núcleo del Grupo II,
00:27: 27.21 encontrando roles importantes tanto para monovalentes como para divalentes
00: 27: 30.18 en estructura y química.
00:27: 32.24 Esta ribozima utiliza un nuevo grupo de iones metálicos,
00:27: 35.25 Lo que significa que la química del ARN no es tan diferente de la química de las proteínas.
00: 27: 40.02 El grupo de metal está intacto incluso sin el sustrato,
00:27: 42.21 lo que significa que es casi como si esta enzima tuviera dientes
00:27: 45.08 lo cual tiene sentido porque los intrones del Grupo II son retroelementos que pueden atacar el ADN.
00:27: 51.04 Y creemos que hemos visto un cambio estructural
00: 27: 53.06 entre los dos pasos de empalme
00:27: 55.02 y que podemos empezar a caracterizar sus rasgos.
00:27: 58.25 Y, debido al trabajo de otros,
00: 28: 00.11 ahora está claro que los intrones del Grupo II y el espliceosoma
00:28: 03.03 tienen un sitio activo casi idéntico.
00: 28: 06.15 Entonces, la estructura del Grupo II ha sido realmente útil
00:28: 07.27 porque nos enseñó química, estructura y evolución.
00:28: 12.29 Así que todo este trabajo fue realizado por tres personas muy talentosas:
00: 28: 16.19 Navegador,
00: 28: 17.29 Marco Marcia,
00: 28: 19.09 y Kevin Keating,
00: 28: 20.11 con gran ayuda de Raj Rajashankar
00: 28: 22.12 y Olga Fedorova.
00:28: 23.09 Y estoy muy en deuda con estas personas por su arduo trabajo y dedicación.
00:28: 26.26 Y muchas gracias por escuchar esta presentación.


De la variación de la línea germinal a la variación funcional y las implicaciones para la enfermedad

La mayoría de las mutaciones nt alélicas de IGHV conocidas codifican cambios de aminoácidos, y en muchos genes de IGHV estos sitios no sinónimos se producen de forma desproporcionada en las regiones determinantes de complementariedad del gen de IGHV, 42 que se consideran las más importantes para el reconocimiento de antígenos. 43, 44, 45 Sin embargo, este patrón no se observa en todos los loci de genes del IGHV, lo que sugiere que ciertos genes del IGHV pueden estar bajo diferentes presiones selectivas. 42 Tales hallazgos implican que los polimorfismos de la línea germinal del gen IGHV pueden tener importantes consecuencias funcionales a nivel de proteínas. De hecho, se conocen los roles funcionales de algunos alelos. Por ejemplo, el alelo IGHV3-23 * 03 se une más eficazmente Haemophilus influenzae polisacárido tipo b (Hib) en comparación con el alelo más frecuente, IGHV3-23 * 01. 5 Curiosamente, también se ha demostrado que la frecuencia del alelo IGHV3-23 * 03 varía considerablemente entre las poblaciones, lo que ocurre en el 21% de los asiáticos, pero solo en el 9% en los afroamericanos y el 1,4% en los caucásicos. 29 Además, Sasso et al. 29 mostraron que el número de copias de IGHV3-23 era mayor tanto en asiáticos como en caucásicos que en afroamericanos. No se sabe si las diferencias geográficas en los polimorfismos de IGHV3-23 y CNV son el resultado de la selección, pero si se consideran junto con las diferencias funcionales observadas, estos datos sugieren que tales polimorfismos podrían ser importantes para la susceptibilidad a la enfermedad.

También se ha demostrado que los polimorfismos de la secuencia de la línea germinal en los loci de IG influyen en la expresión de anticuerpos. El ejemplo más conocido proviene del gen IGKV2-29 (anteriormente VA2, ver correspondencia en la tabla 10 de genes IMGT), un gen V de cadena ligera de IG que se encuentra expresado en anticuerpos contra Hib. 46 Una sola mutación nt en el RS del alelo IGKV2D-29 * 02 en este locus disminuye drásticamente la expresión del gen, en comparación con el alelo alternativo, IGKV2D-29 * 01 (refs.47, 48) (IGKV2D-29 * 01 e IGKV2D-29 * 02 se identificaron previamente como VA2a y VA2b, ver correspondencia en la tabla de genes IMGT 10). Curiosamente, este alelo solo ocurre con una frecuencia alta en ciertas poblaciones de nativos americanos y está asociado con la susceptibilidad a Hib en estas poblaciones. 47, 48 Los efectos de los polimorfismos RS sobre el uso del gen IGHV no se han probado explícitamente. De hecho, la RS de la mayoría de los genes V se ha secuenciado sólo una vez 9, por lo que la información sobre la diversidad alélica en los motivos RS del gen IGHV es limitada. Además, las secuencias reguladoras cadena arriba para la mayoría de los genes del IGHV que no están representados en el genoma de ensamblaje (Tabla 1) nunca se han secuenciado. 2 Como resultado, no tenemos datos que vinculen directamente polimorfismos reguladores de genes de IGHV específicos con repertorios expresados. Sin embargo, los sesgos alélicos observados en repertorios ingenuos de individuos heterocigotos en genes de IGHV de copia única implican que los polimorfismos en secuencias reguladoras de genes de IGHV podrían influir en la expresión de alelos particulares, 6 pero esta idea sigue sin probarse.

El impacto de las variantes estructurales en los repertorios expresados ​​también está en gran parte inexplorado. Solo conocemos un estudio que ha probado directamente los efectos de la CNV en el grupo IGHV en los repertorios expresados. Este estudio mostró que el número de copias de IGHV1-69, que varía de 2 a 4 copias por individuo, se correlaciona fuertemente con su prevalencia en los repertorios de anticuerpos expresados. 49, 50 Las deleciones del gen del IGHV, en contraste con los casos de duplicación del gen del IGHV, por definición conducen a la ausencia de estos genes en los repertorios expresados. Hay varios ejemplos de deleciones homocigóticas que contienen genes IGHV funcionales (Tabla 1). 28, 33, 38, 39, 51, 52 Además, un análisis de repertorios de genes de IGHV de células B vírgenes utilizando secuenciación 454 de próxima generación reveló que 15 de los 56 genes de IGHV descritos en estos repertorios se observaron solo en un subconjunto de 12 personas examinadas. 6 Se informó anteriormente que siete de estos quince genes se producían en polimorfismos de inserción / deleción y, por lo tanto, estos "huecos" observados en el repertorio ingenuo probablemente se deban a deleciones homocigotas. También es interesante observar que las proporciones de muchos genes en los repertorios expresados ​​difieren considerablemente entre los individuos. 6 Por ejemplo, la proporción del gen IGHV4-39 en los repertorios expresados ​​osciló entre el 2 y el 8%. Dado que se sabe que IGHV4-39 es parte de un haplotipo de deleción que ocurre con una frecuencia del 17-25% en caucásicos38, 51, 52, es posible que la variación interindividual en la expresión de IGHV4-39 esté relacionada con diferencias en el número de copias. en este locus. Boyd et al. 6 también mostraron proporciones de uso sesgadas en repertorios individuales para múltiples alelos expresados ​​desde el mismo locus; en algunos casos, ciertos alelos se expresaron dos o tres veces más altos que otros alelos en el mismo individuo. Curiosamente, se informaron dos de estos casos de sesgo alélico para loci que se sabe que forman parte de haplotipos duplicados (por ejemplo, IGHV1-69), lo que sugiere que, además de los polimorfismos en las regiones reguladoras, como se discutió anteriormente, la CNV también puede ser la base de algunos de estos diferencias observadas. Sin embargo, es importante señalar que el uso de secuenciación de próxima generación (NGS) en el análisis de repertorios expresados ​​puede introducir ciertos sesgos de artefactos y, por lo tanto, la interpretación de estos datos debe tratarse con cierta cautela.

Un estudio reciente de anticuerpos expresados ​​en dos pares de gemelos monocigóticos reveló por primera vez que la variación en el uso del gen IGHV en repertorios ingenuos tiene un fuerte componente genético, ya que las frecuencias de uso difieren entre individuos no emparentados, pero no entre gemelos genéticamente idénticos 7 similar a los ejemplos como se indicó anteriormente, cuatro de las seis diferencias significativas entre individuos no emparentados estaban en loci del gen IGHV que se sabe que varían en número de copias. Las frecuencias de uso de genes de IGHV también se correlacionaron en repertorios con experiencia en antígenos entre pares de gemelos monocigóticos y, a pesar de diferencias menores para genes de IGHV particulares, el uso de genes en repertorios con experiencia en antígenos reflejó el uso observado en los repertorios ingenuos para muchos genes de IGHV. 7 Según lo discutido por Glanville et al., 7 este hallazgo es de vital importancia para nuestra comprensión del papel de los repertorios expresados ​​en la enfermedad, ya que hay muchos casos en los que el uso de genes sesgados en los repertorios de anticuerpos se ha asociado con enfermedades infecciosas o autoinmunes particulares. También es interesante observar que una investigación reciente de repertorios expresados ​​en muestras de sangre de cordón fetal de dos bebés sugiere que los sesgos de uso del gen IGHV difieren entre los repertorios de sangre de cordón y los repertorios de adultos. 53 Las observaciones de los sesgos de uso del gen IGHV relacionados con la enfermedad, considerados en conjunto con el hecho de que los repertorios ingenuos expresados ​​son heredables, iluminan el potencial de las variantes de la línea germinal para contribuir a las diferencias en los repertorios ingenuos expresados ​​que preparan el escenario para las diferencias entre individuos no emparentados en su susceptibilidad a infecciones o enfermedades autoinmunes, o en su capacidad para responder adecuadamente a las vacunas.

Si bien hay varios ejemplos convincentes de tales sesgos para los genes IGHV (para una revisión de los sesgos de uso del gen V en enfermedades autoinmunes, consulte Foreman et al. 54), discutimos uno de estos para ilustrar la importancia potencial de estos efectos. Tres encuestas de anticuerpos anti-VIH (Abs) han mostrado un uso sesgado de IGHV1-69, 55, 56, 57 y 9 de 12 Abs contra el sitio de unión inducido por CD4 del epítopo del VIH-1, gp120 (CD4i Abs), usado este gen. 58 Además, varios estudios han demostrado que IGHV1-69 se usa preferentemente para neutralizar anticuerpos contra epítopos de hemaglutinina de cepas de influenza particulares a partir de datos en tres poblaciones humanas. 59, 60, 61 La ubicuidad de estos hallazgos ha llevado a algunos a plantear la hipótesis de que el IGHV1-69 puede haber evolucionado para responder temprano en la respuesta inmune contra las infecciones, 62 aunque otros datos muestran que el IGHV1-69 también puede ser importante en la infección crónica. 57 Una característica única de IGHV1-69 es que es el único gen de IGHV que codifica una fenilalanina (Phe, F) en la posición 62 del aminoácido en el CDR2-IMGT (ver IMGT / DomainDisplay), 10 un sitio que se sabe que es crítico para Unión de hemaglutinina. 61 Sin embargo, también es importante señalar que, aunque IGHV1-69 es el único gen de IGHV que codifica una fenilalanina en esta posición, este sitio es polimórfico y solo un subconjunto de los 14 alelos de IGHV1-69 descritos codifica este aminoácido. Además, como se señaló anteriormente, IGHV1-69 es parte de una región polimórfica de número de copias multialélicas que los individuos pueden tener 0-4 alelos con F62 en su CDR2-IMGT, y el número de copias se correlaciona con los niveles de expresión. 49 Curiosamente, recientemente se observó una variación entre los individuos en los niveles de anticuerpos ampliamente neutralizantes contra la hemaglutinina de las cepas H5N1 del suero de los prevaccinees, lo que sugiere un papel para los polimorfismos de la línea germinal del gen del IGHV interindividual. 63 Brevemente expandiéndose más allá de este gen específico, también se han identificado recientemente anticuerpos que utilizan genes de IGHV distintos de IGHV1-69 de individuos infectados con el virus de la influenza H1N1 2009 (IGHV4-31, IGHV4-30-4, IGHV4-39, IGHV3-21, IGHV3-30). 64 Es importante destacar que se sabe que cuatro de estos cinco genes del IGHV de la línea germinal que contribuyen a estos anticuerpos varían en número de copias. 33, 38, 40, 41, 51, 52 En conjunto, estas observaciones proporcionan un ejemplo potencial del cual las descripciones completas de la variación estructural alélica y genómica del gen del IGHV pueden resultar esenciales para comprender la susceptibilidad a las enfermedades infecciosas y ser útiles en la administración de vacunas destinadas a provocando anticuerpos específicos.


Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación Médica y por la Sociedad Sueca del Cáncer. Agradecemos a Samir El Andaloussi, Anna Berglöf y Roger Strömberg, Karolinska Institutet Mark A. Behlke, Integrated DNA Technologies (IDT), Inc. Peter B. Dervan, California Institute of Technology Scott Henry, ISIS Pharmaceuticals Per Trolle Jørgensen, Erik B. Pedersen y Jesper Wengel, Universidad del Sur de Dinamarca y Rula Zain, Hospital Universitario Karolinska, por sus valiosos comentarios. Pedimos disculpas a todos aquellos que han contribuido de muchas formas al desarrollo de las terapias ON que no pudimos citar su trabajo debido a limitaciones de espacio.


Ver el vídeo: Altering the human genome in 3D (Agosto 2022).