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4.5: Pruebas de complementación y alelismo - Biología

4.5: Pruebas de complementación y alelismo - Biología



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- ¿Uno o más de un gen?

Como se explicó anteriormente en este capítulo, la detección de mutantes es uno de los pasos iniciales que utilizan los genetistas para investigar los procesos biológicos. Es decir, son ellos mutaciones alélicas, o mutaciones no alélicas, respectivamente? Esta pregunta se puede resolver usando pruebas de complementación, que reúnen, o combinan, las dos mutaciones consideradas en el mismo organismo para evaluar el fenotipo combinado.

Ejemplo hipotético de flores moradas

La forma más fácil de entender una prueba de complementación es con un ejemplo (figura 4.9). El pigmento de una flor violeta podría depender de una vía bioquímica muy parecida a la vías bioquímicas que conduce a la producción de arginina en Neurospora (revisión en el Capítulo 1). Una planta que carece de la función del gen A (genotipo Automóvil club británico) produciría flores blancas mutantes que se parecían a las flores de una planta que carecía de la función del gen B (genotipo cama y desayuno). (La genética de dos loci se discute más en los capítulos siguientes.) Tanto A como B son enzimas en la misma vía que conduce desde un compuesto incoloro n. ° 1, hasta el compuesto incoloro n. ° 2, al pigmento púrpura. Los bloques en cualquier paso darán como resultado una flor blanca mutante, no púrpura de tipo salvaje.

Las cepas con mutaciones en el gen A se pueden representar como el genotipo Automóvil club británico, mientras que las cepas con mutaciones en el gen B se pueden representar como cama y desayuno. Dado que aquí hay dos genes, A y B, entonces cada una de estas cepas mutantes puede representarse más completamente como aaBB y AAbb . (NOTA DE APRENDIZAJE: Los estudiantes a menudo olvidan que los genotipos generalmente solo muestran loci mutantes, sin embargo, uno debe recordar que se supone que todos los demás genes son de tipo salvaje).

Si estas dos cepas se cruzan, la progenie resultante será toda AaBb. Tendrán tanto un gen A funcional de tipo salvaje como un gen B y, por tanto, tendrán una flor púrpura pigmentada, un fenotipo de tipo salvaje. Esto es un ejemplo de complementación. Juntas, cada cepa proporciona lo que le falta a la otra (AaBb). Las mutaciones se encuentran en diferentes genes y, por lo tanto, se denominan mutaciones no alélicas.

Ahora, si se nos presenta una tercera cepa mutante de flor blanca derivada de forma independiente y de reproducción pura, inicialmente no sabremos si es mutante en el gen A o en el gen B (o posiblemente en algún otro gen en conjunto). Podemos utilizar las pruebas de complementación para determinar qué gen está mutado. Para realizar una prueba de complementación, se cruzan dos individuos homocigotos con fenotipos mutantes similares (Figura ( PageIndex {10} )).

Si la progenie F1 tiene todos el mismo fenotipo mutante (Caso 1 - Figura ( PageIndex {10} ) A), entonces inferimos que el mismo gen está mutado en cada padre. Estas mutaciones se denominarían entonces mutaciones alélicas, en el mismo locus del gen. Estas mutaciones NO SE COMPLEMENTAN entre sí (siguen siendo mutantes). Estos podrían ser exactamente los mismos alelos mutantes o diferentes mutaciones en el mismo gen (alélico).

Por el contrario, si toda la progenie F1 parece ser de tipo salvaje (Caso 2 - Figura ( PageIndex {10} ) B), entonces es muy probable que cada uno de los padres sea portador de una mutación en un gen diferente. Estas mutaciones se denominarían entonces mutaciones no alélicas, en un locus génico diferente. Estas mutaciones se COMPLEMENTAN entre sí.

Nota: Para que las mutaciones se utilicen en las pruebas de complementación, son (1) generalmente de reproducción verdadera (homocigotas en el locus mutante) y (2) deben ser mutaciones recesivas. La mutación dominante NO PUEDE usarse en pruebas de complementación. Además, recuerde, algunas cepas mutantes pueden tener más de un locus genético mutado y, por lo tanto, no podrían complementar mutantes de más de otro locus (o grupo).

UNA.B.

Figura ( PageIndex {10} ) A - Observación: En una prueba de complementación típica, se desconocen los genotipos de dos progenitores (aunque deben ser mutantes homocigotos de reproducción pura). Si toda la progenie F1 tiene un fenotipo mutante (Caso 1), no hay complementación. Si la progenie F1 es de tipo salvaje, las mutaciones se han complementado con éxito entre sí.

Figura ( PageIndex {10} ) B - Interpretación: Los progenitores mutantes homocigotos, de reproducción pura, tenían genotipos desconocidos antes de la prueba de complementación, pero se podría suponer que tenían mutaciones en los mismos genes (Caso 1) o en genes diferentes (Caso 2). En el caso 1, toda la progenie tendría el fenotipo mutante, porque todos tendrían el mismo genotipo homocigoto que los padres. En el caso 2, cada padre tiene una mutación en un gen diferente, por lo tanto, ninguno de los F1 la progenie sería mutante homocigótica en cualquier locus. Tenga en cuenta que el genotipo en el caso 1 podría escribirse como aa o aaBB. (Original-Deyholos-CC: AN)

Dominancia incompleta es cuando la combinación heteroalélica de dos alelos da como resultado un fenotipo que es intermedio entre las dos combinaciones homoalélicas.
En algunas flores, los pétalos c + c + son rojos y los pétalos c'c 'son blancos.
Sin embargo, en lugar de que uno u otro sea completamente dominante, el heterocigoto c + c 'es rosa.
De manera similar, en el ganado Shorthorn, la descendencia de un Shorthorn rojo y un Shorthorn blanco es un ruano (una mezcla de pelo rojo y blanco).
En el ganado Shorthorns, r + r + es de pelo rojo, r'r 'es blanco y r + r' es ruano.

Si un alelo es completamente dominante, una copia (en lugar de dos dosis) de un gen producirá suficiente producto génico para dar una función normal.
En otras palabras, la mitad de la dosis del gen es suficiente: el gen es haplosuficiente.
En raras ocasiones, esto no es cierto (y la mitad de la dosis del gen NO es suficiente): se dice que el gen es haploinsuficiente.

Codominancia ocurre cuando dos alelos producen productos diferentes.
En los grupos sanguíneos ABO humanos, un individuo puede ser portador de hasta dos alelos del gen I (I A I B, o i).

Genotipo Tipo de sangre
Yo A I A o I A i A
I B I B o I B i B
Yo A yo B AB
yo yo O

Recuerde que el tipo de dominancia está determinado por las funciones moleculares de los alelos de un gen y por el nivel de análisis investigativo.
La anemia de células falciformes es una enfermedad recesiva (Hb S Hb S).
En heterocigotos que tienen glóbulos rojos anormales en algunas condiciones (el rasgo de células falciformes), revelan una presencia codominante de diferentes formas de hemoglobina.
La electroforesis (separación de moléculas en un soporte sólido (por ejemplo, gel) por corriente eléctrica) de las proteínas de las células sanguíneas muestra las dos formas diferentes de hemoglobina.

Serie alélica


Las pruebas interespecíficas de alelismo revelan el momento evolutivo y el patrón de acumulación de mutaciones de aislamiento reproductivo

A pesar de la extensa teoría, se sabe poco sobre la acumulación empírica y el momento evolutivo de las mutaciones que contribuyen a la especiación. Aquí combinamos análisis QTL (Quantitative Trait Loci) del aislamiento reproductivo, con información sobre las relaciones evolutivas de las especies, para reconstruir el orden y el momento de las mutaciones que contribuyen al aislamiento reproductivo entre tres especies de plantas (Solanum). Para evaluar si los QTL de aislamiento reproductivo que parecen coincidir en más de un par de especies son homólogos, utilizamos pruebas cruzadas de alelismo y encontramos evidencia de alelos homólogos y específicos de linaje (no homólogos) en estos loci colocalizados. Estos datos, junto con el aislamiento QTL exclusivo de pares de especies individuales, indican que & gt85% de las mutaciones que causan el aislamiento surgieron más adelante en la historia de la divergencia entre especies. Los análisis filogenéticamente explícitos de estos datos apoyan modelos no lineales de acumulación de incompatibilidad híbrida, aunque el modelo de mejor ajuste específico difiere entre los rasgos de esterilidad de la semilla (interacciones por pares) y del polen (interacciones de múltiples locus). Nuestros hallazgos corroboran la teoría que predice una aceleración ("bola de nieve") en la acumulación de loci de aislamiento a medida que los linajes divergen progresivamente, y sugieren diferentes bases genéticas subyacentes para el polen frente a la esterilidad de las semillas. La esterilidad del polen en particular parece deberse a interacciones genéticas complejas, y mostramos que esto es consistente con un modelo de bola de nieve donde las mutaciones que surgen más tarde tienen más probabilidades de estar involucradas en interacciones de pares o múltiples locus que involucran específicamente alelos ancestrales, en comparación con las que surgen antes. mutaciones.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Cifras

Figura 1. Esquema de una especie cruzada ...

Figura 1. Esquema de una prueba de alelismo de especies cruzadas para determinar la homología en ...

Figura 2. Prueba de alelismo en polen ...

Figura 2. Prueba de alelismo en el locus de esterilidad del polen pf7.2 .

A) Ubicación cromosómica (sombreada) de…

Figura 3. Prueba de alelismo en la semilla ...

Figura 3. Prueba de alelismo en el locus de esterilidad de la semilla sss1.2 .

A) Ubicación cromosómica (sombreada) de…

Figura 4. Prueba de alelismo en la semilla ...

Figura 4. Prueba de alelismo en el locus de esterilidad de la semilla sss2.1 .

A) Ubicación cromosómica (sombreada) de…

Figura 5. Ubicación inferida de todos los detectados ...

Figura 5. Ubicación inferida de todos los loci de aislamiento detectados que actúan sobre (A) la fertilidad del polen y ...

Figura 6. El número de posibles daños ...

Figura 6. El número de interacciones potencialmente perjudiciales entre alelos derivados únicamente (paneles de la izquierda), o ...


Complementación cuantitativa: la próxima generación

La complementación genética es un enfoque estándar en genética molecular que se utiliza para determinar si las mutaciones recesivas con el mismo fenotipo son alelos del mismo gen (Hawley & # x00026 Gilliland 2006). Si las dos mutaciones son cada una recesiva, pero se encuentran en genes diferentes, entonces cada una será "complementada" por el alelo de tipo salvaje correspondiente en un cruce F1. Si todavía se observa el fenotipo recesivo en el F1, las mutaciones "no se complementan", lo que respalda la hipótesis de que son alelos del mismo gen. Hay algunas condiciones en las que la falta de complemento puede deberse a epistasis más que a alelismo, pero cuando las mutaciones se encuentran en un contexto común, estos casos son la excepción y no la regla (Yook et al. 2001 Badano y # x00026 Katsanis 2002 Hawley y # x00026 Gilliland 2006). Imagine, por ejemplo, que un fenotipo puede ser producido por una mutación homocigótica recesiva en los genes A o B, pero que ser heterocigoto para ambos simultáneamente puede producir este mismo fenotipo. Se espera que esto sea raro a menos que estos dos genes interactúen directamente, o estén al menos en la misma vía, por lo que esta falta de complemento es potencialmente confusa pero también puede revelar interacciones y vías (Yook et al. 2001 Badano y # x00026 Katsanis 2002 Hawley y # x00026 Gilliland 2006).

La prueba de complementación cuantitativa (QCT) se diseñó como una aplicación de este enfoque para los rasgos cuantitativos (Long et al. 1996 Mackay & # x00026 Fry 1996). En este caso, se espera que dos cepas naturales cualesquiera tengan alelos diferentes en múltiples loci que afecten el rasgo de interés, y estos alelos podrían tener cualquier relación de dominancia. En un cruce F1 entre cepas, los efectos de estos diversos alelos se promediarán si son codominantes o enmascarados si son recesivos. Sin embargo, si cada cepa natural se hibrida con una cepa con un alelo conocido de pérdida de función, el alelo natural en ese locus no será promediado ni enmascarado por ningún otro alelo. Como se ideó originalmente, el QCT cruzó dos o más aislamientos naturales con una cepa con una mutación de pérdida de función inducida y un alelo de control (fig. 1). Si hay una interacción estadística significativa entre la mutación con pérdida de función y la cepa natural, esto apoya la hipótesis de que la variación natural en ese locus afecta el rasgo de interés (fig. 2).

Esquemas para realizar complementación cuantitativa. La prueba, tal como se diseñó originalmente, se muestra en la parte A. Las cepas naturales (roja y azul) con diferentes alelos en el locus objetivo (A y B) se cruzan con una cepa de control (gris) heterocigótica para un alelo de pérdida de función (X) y un alelo de control (C). Se comparan los valores de los rasgos de cuatro genotipos: AC, BC, AX y BX. La prueba alternativa, que se muestra en la parte B, se puede realizar cuando se pueden producir mutaciones con pérdida de función dentro de cepas naturales. Entonces, la comparación principal es solo entre AX y BX, ya que estas cepas tienen el mismo trasfondo genético, la adición de un genotipo AB agrega información sobre los efectos de la dosis.

Resultados alternativos de la prueba de complementación cuantitativa. La prueba original, que compara cuatro genotipos, se muestra en la parte A (izquierda). El resultado que se muestra en la parte superior es un resultado negativo, aunque parece haber un efecto de los antecedentes genéticos (A frente a B) y la dosis de genes (X frente a C). El resultado a continuación muestra una interacción entre el fondo (A frente a B) y la presencia del alelo de control (X frente a C). Esto podría deberse a alelos en el locus objetivo o una interacción entre la dosis del gen y los otros alelos que difieren entre los antecedentes A y B. La versión alternativa se muestra en la parte B (derecha). El resultado en la parte superior muestra un efecto de dosificación, pero no hay evidencia de variación alélica a continuación, es un resultado positivo para los alelos aditivos. A diferencia de A, una interacción entre el trasfondo genético y la dosis produciría el resultado negativo en la parte superior, no el resultado positivo a continuación, porque los genotipos AX y BX tienen el mismo trasfondo genético.

El QCT es una forma inteligente de utilizar los recursos genéticos moleculares para estudiar la genética de poblaciones. En Drosophila melanogaster, donde se empleó inicialmente la prueba, muchas mutaciones con pérdida de función se pueden solicitar simplemente por correo a los centros de almacenamiento. Además, se han producido muchas cepas con grandes deleciones que abarcan muchos genes (Cook et al.2012 Ryder et al. 2004). Si el QCT fuera confiable, estas deleciones serían excepcionalmente útiles para el mapeo, porque la escala de las regiones eliminadas es independiente de la tasa natural de cruzamiento en un locus dado. Si un QTL se asigna a un intervalo de 10 Mb, por ejemplo, las eliminaciones superpuestas que abarcan ese intervalo podrían usarse para seleccionar este locus y mapear con precisión los alelos (por ejemplo, De Luca et al. 2003). Una vez que la región candidata se reduce a un puñado de genes, los alelos de pérdida de función en estos genes podrían usarse para determinar qué genes albergan alelos causales.

Hay dos obstáculos para implementar la prueba de complementación cuantitativa en sistemas de modelos emergentes. En primer lugar, las eliminaciones y eliminaciones de genes generalmente no se envían a través del servicio postal. Este desafío de repente se ha vuelto menos intimidante debido a los avances en la manipulación genómica, especialmente el sistema CRISPR / Cas9 (Cong et al. 2013 Malí et al. 2013). Después de un año de desarrollo vertiginoso (una búsqueda en Pubmed de 'CRISPR' arroja 314 resultados para 2013), hay optimismo de que esta técnica permitirá la eliminación de genes específicos en todo el árbol de la vida (p. Ej., Chang et al. 2013 Gratz et al. 2013 Shan et al. 2013 Wang et al. 2013b). CRISPR, abreviatura de "repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas", se descubrió recientemente que es un componente de las respuestas inmunitarias de bacterias y arqueas (Barrangou et al. 2007). Los ARN producidos a partir de estas repeticiones se asocian con proteínas asociadas a CRISPR (Cas) para apuntar a secuencias de ADN específicas para su degradación. Esta maquinaria ahora ha sido diseñada para producir mutaciones de forma específica en otros organismos (Jinek et al. 2012 Malí et al. 2013), y parece funcionar en una amplia variedad de taxones (Pennisi 2013). Se pueden producir la proteína Cas9 y el ARN dirigido en vivo incorporando transgenes en el genoma objetivo (Kondo y Ueda 2014), pero también pueden producirse in vitro y coinyectado en el organismo objetivo (Gratz et al. 2014). Se pueden usar múltiples ARN de orientación simultáneamente, lo que permite la edición del genoma multiplexado (Jao et al. 2013 Cong et al. 2013). CRISPR también se puede utilizar para insertar construcciones de ingeniería (Cong et al. 2013 Malí et al. 2013 Tzur et al. 2013), como los utilizados en D. melanogaster para crear deleciones (Cook et al.2012 Ryder et al. 2004). De manera similar, CRIPSPR podría usarse para intercambiar alelos naturales entre antecedentes genómicos, lo que evitaría la necesidad de pruebas de complementación. Sin embargo, sospecho que el reemplazo de loci del tamaño de un gen seguirá siendo más laborioso que producir knock-outs en el futuro previsible. Incluso en un genoma compacto como D. melanogaster, muchos genes abarcan intervalos considerables: transcripciones de accesorio de tenascina puede exceder los 200 kb, como se indica en flybase.org. Si se sospechaba que este gen albergaba una variación natural, esta variación podría encontrarse dentro de este intervalo de 200 kb o en regiones reguladoras fuera de él. A menos que se puedan intercambiar fragmentos tan grandes de ADN entre aislamientos naturales, dicho gen candidato tendría que investigarse en muchos fragmentos, dos genes codificadores de proteínas (hasta ahora) también están anotados para que se encuentren dentro de los intrones de accesorio de tenascinay complicaría la inferencia. Por lo tanto, es probable que la complementación cuantitativa proporcione una adición útil a los conjuntos de herramientas genéticas durante algún tiempo.

El segundo desafío al que se enfrenta el QCT es la confusión derivada de la epistasis. Cualquiera de los dos genotipos muestreados de la naturaleza son diferentes en una miríada de loci, y si alguna de estas diferencias interactúa epistáticamente con el alelo de pérdida de función, esto podría producir un falso positivo (Service 2004). Este enfoque se ha utilizado con éxito a pesar de este problema (por ejemplo, Coyne et al. 1999 De Luca et al. 2003 Presgraves 2003 Kopp et al 2003 Meiklejohn et al. 2013), pero la prueba no produce un alto nivel de evidencia por sí sola. Este desafío también es superable: se puede realizar una versión similar pero menos problemática del QCT cuando se pueden producir mutaciones de pérdida de función dentro de las cepas en estudio en lugar de en una cepa de referencia (fig. 1). Con este QCT modificado, el valor del rasgo de un genotipo heterocigoto se puede comparar con ambos genotipos hemicigotos, todos con un trasfondo genético común. Esto se compara favorablemente con el reemplazo de genes: si los alelos se intercambiaran entre antecedentes de tipo salvaje, los valores de los rasgos del heterocigoto podrían compararse con ambos homocigotos en un trasfondo genético común. En ambos casos, cualquier interacción epistática entre la dosis y el trasfondo genómico se mantendría en los genotipos en comparación. En el QCT, es posible que los alelos comparados se comporten de manera anormal en un estado hemicigótico si hubiera alguna dominancia no transitiva, pero este problema parece análogo al potencial limitado de confusión epistática en la prueba de complementación tradicional. Las interacciones epistáticas con el trasfondo genómico pueden dar lugar a resultados que no se replican en otros trasfondos, pero esto también se aplica al reemplazo alélico (Chandler et al. 2013). Si el reemplazo se realiza en líneas endogámicas, esto puede conducir a mayores efectos de fondo en comparación con el fondo F1 en el QCT modificado (aunque en cruces entre especies, los resultados en el fondo híbrido podrían no ser repetibles dentro de la especie Rebeiz et al. 2009 Maheshwari y Barbash 2011). Este QCT modificado se ha utilizado previamente para mapear la divergencia morfológica entre D. melanogaster y D. simulanos al gen hox Ubx (Stern 1998).

Un enfoque conceptualmente equivalente está disponible incluso usando knock-outs en cepas de referencia: si el trasfondo genético no se puede controlar, aleatorizarlo. En el caso especial de líneas endogámicas recombinantes, por ejemplo, los alelos están presentes en muchos antecedentes genómicos (por ejemplo, King et al. 2012). Al cruzar un conjunto de líneas endogámicas recombinantes con un alelo knock-out y de control, los efectos de los alelos locales se pueden promediar a través de los antecedentes genómicos (Kopp et al. 2003 Mezey et al. 2005). Lo mismo ocurre con la validación de genes de estudios de asociación de todo el genoma (GWAS). Para validar la hipótesis de que la variación en un gen determinado afecta el rasgo en estudio, los alelos knock-out y control podrían cruzarse con un conjunto de individuos muestreados directamente de la naturaleza. Después de cuantificar los valores de los rasgos de los individuos F1, se pudo extraer el ADN para determinar la clase de genotipo de cada individuo (AX, AC, BX, BC en las figuras 1 y & # x200B y2). 2). A menos que haya alelos en otras partes del genoma que 1) interactúen epistáticamente con la mutación de pérdida de función y 2) estén en desequilibrio con los alelos naturales en estudio, esta prueba sería comparable a la QCT modificada. Tenga en cuenta también que este método estima el efecto de un alelo en el acervo genético en lugar de en un solo fondo, lo que puede conducir a una alta reproducibilidad.


Alelos múltiples: significado, características y ejemplos | Genes

La palabra alelo es un término general para denotar las formas alternativas de un gen o un par de genes contrastantes que denota la forma alternativa de un gen que se llama alelo. Estos alelos fueron considerados previamente por Bateson como un socio hipotético en la segregación mendeliana.

En la herencia mendeliana, un locus determinado del cromosoma estaba ocupado por 2 tipos de genes, es decir, un gen normal (para la forma de semilla redonda) y otro su gen recesivo mutante (forma de semilla arrugada). Pero es posible que el gen normal muestre todavía muchas mutaciones en el guisante además de la de las arrugas. Aquí el locus estará ocupado por el alelo normal y sus dos o más genes mutantes.

Por tanto, tres o más tipos de genes que ocupan el mismo locus en un cromosoma individual se denominan alelos múltiples. En resumen, muchos alelos de un solo gen se denominan alelos múltiples. El concepto de alelos múltiples se describe bajo el término & # 8220multiple allelism & # 8221.

Dawson y Whitehouse en Inglaterra propusieron el término panallele para todas las mutaciones genéticas en un locus dado en un cromosoma. Estos difieren del factor múltiple en un aspecto que los factores múltiples ocupan diferentes loci mientras que los alelos ocupan el mismo locus.

& # 8220 Tres o más tipos de genes que ocupan el mismo locus se denominan alelos múltiples. & # 8221 Altenburg

Características de múltiples Alelos:

1. El estudio de múltiples alelos se puede realizar en población.

2. Múltiples alelos están situados en cromosomas homólogos en el mismo locus.

3. No hay cruce entre los miembros de múltiples alelos. El cruce tiene lugar entre dos genes diferentes solamente (recombinación intergenérica) y no ocurre dentro de un gen (recombinación intragénica).

4. Múltiples alelos influyen únicamente en uno o el mismo carácter.

5. Múltiples alelos nunca muestran complementación entre sí. Mediante la prueba de complementación, los genes alélicos y no alélicos pueden diferenciarse bien. La producción de fenotipo de tipo salvaje en un trans-heterocigoto para 2 alelos mutantes se conoce como prueba de complementación.

6. El alelo de tipo salvaje (normal) es casi siempre dominante mientras que los otros alelos mutantes de la serie pueden mostrar dominancia o puede haber un efecto fenotípico intermedio.

7. Cuando se cruzan dos de los múltiples alelos, el fenotipo es de tipo mutante y no salvaje.

8. Además, F2 las generaciones de tales cruces muestran una relación monohíbrida típica para el personaje en cuestión.

Ejemplos de Multiple Alelos:

1. Alas de Drosophila:

En Drosophila, las alas son normalmente largas. Ocurrieron dos mutaciones en el mismo lugar en diferentes moscas, una causó alas vestigiales (reducidas) y otra mutación que causó alas con cuernos (menos desarrolladas). Tanto el vestigio como el asta son alelos del mismo gen normal y también entre sí y son recesivos al gen normal.

Supongamos que el vestigio está representado por el símbolo & # 8216vg & # 8217 y el ala con cuernos por & # 8216vg a & # 8216. El alelo normal está representado por el símbolo +.

Por tanto, hay tres razas de Drosophila:

(iii) Cornamentas vg a vg a (vg a / vg a)

A continuación se representa un cruce entre una mosca normal de alas largas y otra que tiene alas vestigiales o alas con cuernos:

Cuando una mosca con vestigio de ala se cruza con otra mosca que tiene alas con astas, la F1 los híbridos tienen una longitud de ala intermedia, lo que muestra que ninguno de los genes mutados es dominante sobre el otro. Este híbrido se dice algunas veces como el compuesto de asta vestigial y contiene dos genes mutados en el mismo locus. Muestran segregación y recombinación mendeliana.

Además del ala vestigial y con cornamenta descrita anteriormente, hay varias otras mutaciones que ocurren en el mismo lugar y que dan como resultado alas melladas, alas de tirante o sin alas, etc. Todos estos son alelos múltiples.

Estrecho vínculo versus alelismo:

Si asumimos que estos genes mutantes, vestigial y cornamenta no están localizados alélicamente en diferentes loci en lugar de ubicarse en el mismo locus en diferentes cromosomas tan estrechamente vinculados que no existe un cruce entre ellos, el gen mutante suprimirá la expresión de los normales adyacentes. alelo hasta cierto punto.

Estos genes estrechamente relacionados se denominan pseudoalelos y esta supresión es el resultado del efecto de posición. Por lo tanto, los casos visibles o aparentes de alelismo pueden explicarse asumiendo un vínculo estrecho.

Otro ejemplo de alelos múltiples es el color de ojos en Drosophila. El color normal de los ojos es rojo. La mutación cambió este color de ojos rojos a blanco. Se produjeron otras mutaciones en el locus blanco que cambiaron el color de ojos rojos a varios tonos más claros como cereza, albaricoque, eosina, cremoso, marfil, sangre, etc., también son visibles y se deben a múltiples alelos.

Un cruce entre las dos formas mutantes, produce un tipo intermedio en la F1 excepto las razas blanca y albaricoque que no son alelos sino genes estrechamente ligados.

2. Color del pelaje en conejo:

El color de la piel de los conejos está influenciado por una serie de alelos múltiples. El color normal de la piel es marrón. Además de eso, hay razas blancas llamadas albinas y del Himalaya como las razas mutantes. El Himalaya es similar al albino pero tiene nariz, orejas, pies y cola más oscuros. Los genes mutantes albino (a) e Himalaya (a h) ocupan el mismo locus y son alélicos. Tanto el albino como el del Himalaya son recesivos a su alelo normal (+).

Un cruce entre un albino y el Himalaya produce un Himalaya en la F1 y no intermedio como es habitual en el caso de otros alelos múltiples.

3. Autoesterilidad en plantas:

Kolreuter (1764) describió la autoesterilidad en el tabaco (Nicotiana longiflora). La razón fue hecha por East. Describió que la autoesterilidad se debe a una serie de alelos designados como s1, s2, s3 ys4 etc. Los híbridos S1/S2 o S1/S3 o S3/S4 son autoestériles porque los granos de polen de estas variedades no se desarrollaron, pero los pólenes de S1/S2 fueron eficaces y capaces de fertilizar con S3/S4.

Los genes que causan la autoesterilidad en las plantas probablemente producen sus efectos controlando la tasa de crecimiento de los tubos polínicos. En combinaciones compatibles, el tubo polínico crece cada vez más rápidamente a medida que se acerca al óvulo, pero en las no adecuadas, el crecimiento del tubo polínico se ralentiza considerablemente, de modo que la flor se marchita antes de que pueda tener lugar la fecundación.

4. Grupos sanguíneos en el hombre:

Varios genes en el hombre producen múltiples series alélicas que afectan una característica fisiológica interesante e importante de los glóbulos rojos humanos. Los glóbulos rojos tienen propiedades antígenas especiales por las que responden a ciertos componentes específicos (anticuerpos) del suero sanguíneo.

La relación antígeno-anticuerpo es una de las grandes especificidades entre cerradura y llave. Cada antígeno y su anticuerpo asociado tienen una configuración química peculiar. Landsteiner descubrió en 1900 que cuando los glóbulos rojos de una persona se colocan en el suero sanguíneo de otra persona, las células se aglutinan o aglutinan.

Si se realizaban transfusiones de sangre entre personas de dos de estos grupos sanguíneos incompatibles, era probable que las células transfundidas se aglutinaran y cerraran los capilares del receptor, lo que a veces resultaba en la muerte.

Sin embargo, tales reacciones ocurrieron solo cuando las células de ciertos individuos se colocaron en suero de ciertas otras personas. Se encontró que todas las personas podían clasificarse en cuatro grupos con respecto a la propiedad antigénica de las células sanguíneas.

Se ha clasificado a un gran número de personas en estos cuatro grupos mediante la prueba de aglutinación y se ha estudiado la distribución de grupos sanguíneos en la descendencia de padres de grupos sanguíneos conocidos. La evidencia muestra que estas propiedades de la sangre están determinadas por una serie de tres genes alélicos I A, I B e i, de la siguiente manera:

I A es un gen para la producción del anti-gin A. I B para el antígeno B e i para ninguno de los antígenos. La existencia de estos alelos en el hombre y el caso con el que se pueden identificar los grupos sanguíneos tienen aplicaciones prácticas obvias en transfusión de sangre, casos de porcentaje disputado y descripción de poblaciones humanas.

Los alelos de estos genes que afectan a una variedad de propiedades bioquímicas de la sangre, actúan de tal manera que en el compuesto heterocigoto I A I B, cada alelo exhibe sus propias características y efecto específico. Las células del heterocigoto contienen tanto antígenos A como B. Por otro lado, I A e I B muestran dominancia completa sobre i, que carece de ambos antígenos.

Tabla que muestra los posibles tipos de sangre de niños de padres de varios grupos sanguíneos.

5. El grupo sanguíneo & # 8216Rhesus & # 8217 en el hombre:

Se ha descubierto una serie muy interesante de alelos que afectan a los antígenos de la sangre humana gracias al trabajo de Landsteiner, Wiener, Race, Levine, Sanger, Mourant y muchos otros.

El descubrimiento original fue que los glóbulos rojos son aglutinados por un suero preparado inmunizando conejos contra la sangre de mono Rhesus. En consecuencia, el antígeno responsable de esta reacción se denominó factor Rhesus y el gen que causa esta propiedad se denominó R-r o Rh-rh.

El interés en este factor fue estimulado por el estudio de Levine sobre una forma característica de anemia, conocida como Erythroblastosis foetalis, que ocurre ocasionalmente en recién nacidos.

Se encontró que los bebés que padecen esta anemia suelen ser Rh positivos y también lo son sus padres, pero sus madres son Rh negativas. El origen de la enfermedad se explicó de la siguiente manera: El feto Rh + que se desarrolla en el útero de una madre Rh & # 8211 provoca la formación de anticuerpos anti-Rh en el torrente sanguíneo de la madre.

Estos anticuerpos, especialmente como resultado de una sucesión de varios embarazos Rh +, adquieren suficiente fuerza en la sangre de la madre para que puedan atacar los glóbulos rojos del feto. La reacción entre estos anticuerpos de la madre y los glóbulos rojos del feto provoca hemólisis y anemia que pueden ser lo suficientemente graves como para provocar la muerte del recién nacido o el aborto del feto.

El torrente sanguíneo de una madre que ha tenido un bebé eritroblastótico es un reactivo mucho más potente y conveniente que el suero de conejos, inmunizado con sangre de mono rhesus & # 8217s para analizar la sangre de otras personas para distinguir Rh + de Rh & # 8211 individuos utilizando tales sueros de mujeres que tenían bebés eritroblastóticos, se descubrió que: no existen uno, sino varios tipos de personas Rh + y Rh-. Hay varios antígenos Rh diferentes que se detectan mediante antisueros específicos.

Por lo tanto, una mujer Rh & # 8211 inmunizada durante el embarazo por los niños Rh + puede tener anticuerpos en el suero sanguíneo, que aglutinan no sólo los glóbulos rojos Rh + sino también las células de unas pocas personas que se sabe que son Rh & # 8211.

By selective absorption two kinds of antibodies may be separated from such a serum, one known as anti-D which agglutinates (= coagulates) only Rh + cells, the other known as anti-C which agglutinates particular rare types of Rh – . Another specific antibody, known as anti-c agglutinates all cells that lack C.

With these three antisera, six types of blood can be recognized. Studies of parent and children show that persons of type Cc are heterozygous for an allele C determining C anti-gena. CC persons are homozygous for C and cc are homozygous for c. There is obviously no dominance, each allele producing its own antigen in the heterozygote as in the AB blood type.

No anti serum is available for detecting d, the alternative to D. D + persons may be heterozygous or homozygous. However, the genotypes of such persons may be diagnosis from their progeny for example D + person who has a d – child is thereby shown to be Dd.

Two other specific antibodies, anti-E and anti-c have been found. These detect the antigens E and e determined by a pair of alleles E and e. The three elementary types of antigens C-c, D and E-e, occur in fixed combinations that are always inherited together as alleles of a single gene. Wiener and Fisher showed the existence of a series of eight different alternative arrangements of these three types of Rh antigens and expressed them by means of following symbols.

The Rh System of Alleles:

Thus, allelism is determined by cross-breeding experiments. If one gene behaves as dominant to another the conclusion is that they are alleles and that they occupy identical loci in homologous chromosomes when two genes behave as dominant to other gene. They should occupy identical loci in the chromosome. When more than a pair of alleles occur in respect of any character in inheritance the phenomenon is known as multiple allelism.

There is not much difference between the two theories of Wiener and Fisher. Wiener opinion is that there are multiple variations of one gene whereas according to the view of Fisher three different genes lying very close together are responsible for differences.

The opposite of polygene effect is known as pleiotropism i.e., a single gene influence or govern many characters. For example, gene for vestigial wing influence the nature of halters (modified balancers of Drosophila). The halters are not normal but reduced in flies with vestigial wings. The vestigial gene also affects position of dorsal bristles which instead of being horizontal turn out to be vertical.

This gene also affects the shape of spermatheca i.e., the shape of spermatheca is changed the number of egg strings in the ovaries is decreased compared to normal when the vestigial larvae are well fed but relatively increased when they are poorly fed length of life and fruitfulness or fertility are lowered, and there are still other differences.

Theories of Allelism:

Various theories have been put forward to explain the nature of allelism origin and occurrence.

1. Theory of Point Mutation:

According to this theory multiple alleles have developed as a result of mutations occurring at same locus but in different directions. Hence all the different wing lengths of Drosophila are necessarily the result of mutations which have occurred at same long normal wing locus in different directions.

2. Theory of Close Linkage or Positional Pseudoallelism:

According to this view the multiple alleles are not the gene mutations at same locus but they occupy different loci closely situated in the chromosome. These genes closely linked at different loci are said to as pseudo alleles and affect the expression of their normal genes i.e., position effect.

3. Heterochromatin Theory of Allelism:

Occasionally heterochromatin becomes associated with the genes as a result of chromosomal breakage and rearrangement. These heterochromatin particles suppress the nature of genes in question due to position effect.

In maize the position effect are some times due to transposition (act of changing place or order) of very minute particles of heterochromatin. There are also sign or token that particles of different kinds of heterochromatin suppress the expression of normal gene to different degrees.

In Drosophila the apricot might be a partially suppressed red (normal) and white completely suppressed red while apricot and white hybrid may give rise to red or intermediate by unequal crossing over. The above theories in some way or other do not explain clearly the particular case of allelism and it is possible that all the three theories are applicable in different cases.

Importance of Multiple Allelism:

The study of multiple alleles has increased our knowledge of heredity. According to T.H. Morgan a great knowledge of the nature of gene has come from multiple alleles. These alleles suggest that a gene can mutate in different ways causing different effects. Multiple allelism also put forward the idea that different amounts of heterochromatin prevent the genes to different degree or space.

1. Pseudo alleles:

Alleles are different forms of the same gene located at the corresponding loci or the same locus. Sometimes it has been found that non-homologous genes which are situated at near but different loci affect the same character in the same manner as if they are different forms or alleles of the same gene. They are said as pseudo alleles. These pseudo alleles which are closely linked show re-combinations by crossing over unlike the alleles.

2. Penetrance and Expressivity:

Simply a recessive gene produces its phenotypic effect in homozygous condition and a dominant gene produces its phenotypic effect whether in homozygous or heterozygous condition. Some genes fail to produce their phenotypic effect when they should. The ability of a gene to produce its effect is called penetrance.

The percentage of penetrance may be altered by changing the environmental conditions such as moisture, light intensity, temperature etc. A gene that always produces the expected effect is said to have 100 percent penetrance. If its phenotypic effect is produced only 60 percent of the individuals that contains it then it is said to show 60 percent penetrance.

In Gossypium a mutant gene produces crinkled leaf. While all the leaves produced in the normal season are crinkled but some of the leaves which are produced late in the season do not show this character and are normal. It represents that penetrance is zero or in other words the gene is non-penetrant. Sometimes there is great variation in the manner in which a character is expressed in different plants.

In Lima beans there is a variety named venturra where a dominant gene is responsible for tips and margins of the leaves of the seedlings to be partially deficient in chlorophyll. Sometimes only the margins are effected and sometimes only the tips. In other words, this single gene may express itself in a variety of ways that may resemble a number of characters. This gene is then to exhibit variable expressivity.

Whether a gene is expressed at all is denoted by the term penetrance whereas the term expressivity denotes the degree of its expression.

3. Lsoalleles:

Sometimes, a dominant gene occurs in two or more forms. These multiple dominant alleles will produce the same phenotypic effect in homozygous condition but their effect will show a small difference in heterozygous state.

In Drosophila, thus, the gene for red eye colour is dominant over white. The red gene will produce dark red colour in the homozygous condition but in combination with the white allele the gene for red colour produces a dark red colour in flies from Soviet Russia but the same combination in the flies coming from the U.S.A. produces a light red colour. It does mean that dominant gene for red colour occurs in two forms. These are said as isoalleles.

4. Phenocopy:

Characters are the result of interaction between the genotype and the environment. When a gene mutates, its phenotypic effect also changes. Some times, a change in the environment produces a visible change in the phenotype of the normal gene which resembles the effect as already known mutant.

The effect of the normal gene under the changed environment is a mimic or imitation of the mutant gene. Such an imitation induced by environmental changes has been termed as phenocopy by Goldschmidt.

In fowls, a mutant gene is responsible for the character, ruinplessness, in which the caudal vertebrate and tail feathers do not develop. Rumplessness is also induced as a phenocopy when normal eggs which do not have the gene for rumplessness, are treated with insulin before incubation.

Phenocopies of other mutant genes are also produced in Drosophila by high temperature treatment of the larvae for short periods. It has also been found that different or non- allelic genes can produce the same phenotype. This phenomenon is said as genetic mimic or genocopy.

5. Xenia and Metaxenia:

The immediate effect of foreign pollen on visible characters of the endosperm is called xenia. The ‘xenia’ term was given by Focke (1800). This has been studied in maize plant. If a white endosperm variety is open pollinated in the field where there are also plants of the yellow endosperm variety then the cobs that develop will contain a mixture of yellow and white seeds.

The yellow colour of the endosperm in the yellow seeds is the result of fertilization by pollen from the yellow variety. The yellow colour indicates that the seeds are hybrids and the white seeds are homozygous.

The yellow colour of the endosperm is dominant over white and when the plants raised from the yellow seeds are self-pollinated, yellow and white seeds are produced in the ratio of 3:1. Another example of xenia may be exemplified. If a sweet corn (maize) is pollinated by a starchy variety, the endosperm is starchy because the starchy gene introduced by the pollen is dominant over its sugary allele.

6. Metaxenia:

It is the term used to describe the effect of foreign pollen on other tissues belonging to the mother plant, outside the endosperm and embryo. It is sometimes evident in the fruit and seed coats.

In cucurbitaceous fruits, the skin colour is affected by the pollen grains in oranges, the colour and flavour of the fruit is influenced by the pollen parent. The same is true of fuzziness and hair length in cotton. It has been suggested that metaxenia effects may be due to certain hormones secreted by the endosperm and embryo.


4.5: Complementation tests and Allelism - Biology

©2000 written by Gary Roberts, edited by Timothy Paustian, University of Wisconins-Madison

VII. COMPLEMENTATION

VII A. DEFINITION

A complementation analysis asks if two putative alleles 1 , when in the same cell 2 and acting independently 3 , can supply all functions necessary 4 for a wild-type phenotype 5 . Complementation is therefore a test of function. The superscripts in this definition are explained below:

The "two putative alleles" refers to two versions of the same region of the chromosome, each of which separately confer a mutant phenotype. They are termed "putative" alleles since it is their very "allelism" which will be determined in this test (they are allelic if they are in the same complementation group). Each allele ought to be present in a single copy number in the cell and it is crucial that the entire relevant region be present in diploid in the cell. Such a partially diploid cell is termed merodiploid. An inverse genetics application is "cloning by complementation", but this will have many of the same concerns as standard complementation with the added concern of copy effects if multi-copy plasmids are used.

The two alleles can either be present on the chromosome or on extra-chromosomal elements. If either version is in more than one copy, there can be both regulatory complications (e.g. titration of a regulatory factor) and difficulties in interpretation (e.g. you do not know if a positive result is due to inappropriate quantities of the product encoded by the multi-copy gene).

Care must be taken that the mutations cannot recombine to form a wild-type genotype so that typically Rec- strains are used.

Only functions absolutely necessary for the desired phenotype, under the conditions used, are "demanded" by a complementation test. Mutations affecting genes whose products are not essential for the desired phenotype will not be tested for in complementation analysis.

The ""wild-type" phenotype" demanded by this analysis should be more rigorously called an "apparently wild-type phenotype under the conditions used". The phenotype is typically scored as "growth" or "no growth", but biochemical assays of the encoded gene product can be performed for more precise quantitation.

Figure 29 gives an idea of the results one could expect from straightforward complementation tests. In these examples when the two mutations in the separate mutant alleles affect the same gene, then neither is capable of generating a wild-type product of that gene and the resultant merodiploid strain is mutant in phenotype. On the other hand, if the two mutations affect different genes, so that each copy of the region is able to generate some of the gene products required (and between them all necessary gene products are synthesized) then the resulting strain is phenotypically wild-type. One problem with this set of examples is that no one(in doing bacterial genetics) routinely puts the two alleles in the " cis "-configuration as a control for complementation (you do build such strains for other purposes, however). It is too hard (for reasons we will cover when we get to Mapping) and it provides very little information, since the presence of the wild-type allele on the other copy will nearly always be dominant. It is, however, often appropriate to consider effects of a mutation on genes in cis , but this is not the same as generating "double mutants" affected in the same small region.

There are three sorts of controls useful in analyzing the results of complementation experiments (see Fig. 30): (a) If either copy of the merodiploid contains a wild-type region, the phenotype of the resulting strain should be a wild-type phenotype, and the wild type is said to be dominant to the mutant. If it is not, the mutant allele is said to be trans -dominant to the wild-type (see section VII B). In either case the merodiploid has the phenotype of whichever allele is dominant. (b) A merodiploid strain constructed with the same mutant allele in each copy should display the mutant phenotype. If it does not, it suggests that mere diploidy for the region of interest can confer a wild-type phenotype. One way of this occurring would be if the mutation conferred a leaky phenotype so that a double dose might yield a pseudo wild-type response. (c) The result should not depend on the location of the alleles i.e. the same result should obtain no matter which allele is on the chromosome. If this is not true, it indicates that the two locations are not equivalent and therefore the test has marginal validity. This is a variation on the concerns noted for multi-copy plasmids above.

Chromosomal Allele
Plásmido
Alelo
1 - 2 - 3 - 4 - wt
1 - -----
2 - -++++
3 - -+-++
4 - -+--+
wt-++++

VII B. COMPLICATIONS IN COMPLEMENTATION ANALYSIS

The above examples would seem to suggest that if two mutations complement each other, then they must affect different genes and gene products. This would suggest that the results of complementation analysis would be to define the number of genes in the region. In fact, what complementation analysis does is to define the number of cistrons or complementation groups. More often than not, the number of cistrons will be coincident with the number of genes, but there are a number of special cases where this correlation will not hold. The complications that give rise to these special cases are discussed below and they fall into two general classes: when the non-complementing mutations actually do map to separate complementation groups (paragraphs 1 and 2 below), and when complementing mutations actually map to the same complementation group (paragraph 3 below). Examples of the first class will be detected when the appropriate controls are done, as described above. The second class will be seen as an anomaly in the actual complementation results.

Cis -dominant mutations are a reasonably common type of complication in complementation analyses. Cis-dominant mutations are those that affect the expression of genes encoded on the same piece of DNA (as the mutation itself), typically transcriptionally downstream, regardless of the nature of the trans copy. Such mutations exert their effect, not because of altered products they encode, but because of a physical blockage or inhibition of RNA transcription. There are two dissimilar examples of these sorts of mutations: (a) If a mutation in a transcriptionally upstream gene exhibits strong polarity onto downstream genes, then that mutation has the property of eliminating more than one gene product function. (b) Similarly, a mutation in the promoter or in other regulatory regions outside the translated area, may well eliminate transcription of the entire operon and thus be negative in complementation for all gene functions encoded by that operon. In each of these cases, the mutation is eliminating the function of genes that are themselves genotypically wild type. The mutations are said to be cis -dominant because the expression of the genes downstream on the same piece of DNA will be turned off regardless of the genotype present in the trans copy.

Negative complementation . Another complication involves the very rare phenomenon known as negative complementation or trans -dominant mutations with mutant phenotypes. Mutations of this type cause the resultant merodiploid strain to have a mutant phenotype even when the other copy of the region is genotypically wild type. The phenotype of the mutant allele is thus trans -dominant to the wild type (obviously the reason that wild type is dominant to most mutants is because it supplies the function that they have lost by mutation). There are three general schemes that can be envisaged for mutations causing this sort of phenotype. In each of them, it is necessary to propose that the mutant allele generates a product that, while not wild type, nevertheless possesses some activity that leads to the mutant phenotype. Possibilities include (a) multimeric enzymes where the merodiploid strain would generate multimers whose subunits come from both the mutant and wild-type genes in a random assortment. As shown in figure 31, if the protein was a tetramer, and if any multimer containing one or more mutant subunits was completely inactive, then the presence of the mutant chain would decrease the amount of functional wild-type gene product by approximately 8-fold (this number ignores regulation and assumes a two-fold dosage of the product due to a two-fold dosage of the gene). (b) The mutant gene might cause the generation of an altered protein that interfered in some reaction with the cell and thus caused a deleterious phenotype. In this case, the presence of a wild-type allele would restore the function missing in the mutant but would not eliminate the deleterious phenotype caused by the mutant protein. Thus, the mutant phenotype would be dominant to wild type. (c) It is also conceivable that the mutant copy generates an altered protein that, while it could not carry out the wild-type function, might be competitive with the wild-type gene product. In each case, an altered product is responsible for the trans dominance. Remember, these are rare, special cases: in general, the wild-type allele is dominant to the mutant since the latter typically involves loss of function which is "replaced" by the product of the wild-type gene. Such trans -dominant mutants are very appropriate for further biochemical analysis because the protein product has alteredfunction, rather than merely a lack of function.

Intragenic complementation is yet another possible complication in complementation analysis. This term refers to cases where two mutations that do affect the same gene, and therefore the same gene product, are able nonetheless to give a wild-type phenotype in a complementation analysis. There are two general cases of such a phenomenon: (a) If the product of the gene in question is a bi-functional protein, especially when those functions are independent of one another, then the gene itself will often show intragenic complementation. Such an example is easiest to understand if the product is pictured as "two beads on a string". If each "bead" had an independent enzymatic function, one could imagine that a mutation affecting either (but not both) of the two functions might well leave the other function intact. If two such mutations were put in a merodiploid situation, each would be able to produce one of the two required enzymatic functions, giving rise to a wild-type phenotype. In the case of such a gene, intragenic complementation would be fairly common such that many mutations would affect only one of the two functional regions. This model also predicts that mutations affecting each of the two functions would cluster at either end of the gene creating two clear complementation groups. (b) It is also possible, though less likely, for pairs of complementing mutants to occur in cases where the gene product is a multimeric protein. In such cases, a particular mutant allele might give rise to a protein product that can only function when allowed to aggregate with another particular mutant allele. Such an example is sketched below. In this case, unlike the case of bifunctional protein above, instances of intragenic complementation will be rare, limited to specific pairs of mutants. Further, there is no a priorireason to predict any clustering of complementing or noncomplementing mutations. Would such a case, where two mutations out of 100 in a given gene are capable of complementation, be sufficient to say the gene had two complementation groups? This question is largely a semantic one, but in general, unless intragenic complementation is fairly common, the few exceptional complementing pairs would not be said to define separate complementation groups.

"Unimportant" genes . Since complementation analysis treats only those functions necessaryto generate the required phenotype, it does not allow the detection of complementation groups unless their products are required for the phenotype in question. If, for example, a region encoding such an "unimportant" product (at least under the conditions of the selection) is transcriptionally polar onto an "important" function, that pair of genes has the complementation properties of a single complementation group. This reflects the fact that the only mutations detected in the transcriptionally upstream gene would be ones polar onto the functionally important gene downstream.

The example described in sample problem 15 illustrates some of the expected results from a complementation analysis of a more complicated region. In this example, transposons have been assumed to be polar and point mutations to be non-polar. These assumptions are not unreasonable but, as the section on transposons describes, there can be transcription emanating from the element so that occasionally some expression of "downstream" genes is detected. If that transcription was high enough, the element might appear to be non-polar in a complementation assay. Similarly, some point mutations (frameshifts and nonsense mutations) display at least some polarity and, (as always) depending on the amount of expression of the downstream genes necessary to provide a wild-type phenotype, will be negative in complementation for downstream function.


Lethal mutations defining 112 complementation groups in a 4.5 Mb sequenced region of Caenorhabditis elegans chromosome III

The central gene cluster of chromosome III was one of the first regions to be sequenced by the Caenorhabditis elegans genome project. We have performed an essential gene analysis on the left part of this cluster, in the region around dpy-17III balanced by the duplication sDp3. We isolated 151 essential gene mutations and characterized them with regard to their arrest stages. To facilitate positioning of these mutations, we generated six new deficiencies that, together with preexisting chromosomal rearrangements, subdivide the region into 14 zones. The 151 mutations were mapped into these zones. They define 112 genes, of which 110 were previously unidentified. Thirteen of the zones have been anchored to the physical sequence by polymerase chain reaction deficiency mapping. Of the 112 essential genes mapped, 105 are within these 13 zones. They span 4.2 Mb of nucleotide sequence. From the nucleotide sequence data, 920 genes are predicted. From a Poisson distribution of our mutations, we predict that 234 of the genes will be essential genes. Thus, the 105 genes constitute 45% of the estimated number of essential genes in the physically defined zones and between 2 and 5% of all essential genes in C. elegans.


There are 5 mutations being tested in these complementation test.

The first gene, carries mutation number 2. In other words, mutation number 2 complements mutations, 1, 3, 4, and 5, and fails to complement itself.

The second gene, carries mutation number 4. In other words, mutation number 4 complements mutations 1, 2, 3, and 5, and fails to complement itself.

The third of the three genes, carries mutation 1, in one strain, mutation 3, in a second strain, and mutation 5, in a third strain. In other words, mutations 1, 3, and 5 all fail to complement each other, yet all three complement mutations 2 and 4.

There are 5 different strains in this experiment, and there are five different mutations (one in each strain), but the five mutations only affect three different genes.


DMAP1 complementation tests

And now time for Ye Olde Fashionede Geneticse. We have 7 lines of flies, each a potential mutation in DMAP1. Four produce homozygous flies with variable levels of viability and fertility and three are lethal (see here). Are they all lesions in the same gene? We expect so, perhaps even more than we might from a standard mutagenesis screen using a chemical mutagen like EMS, because we used a mutator P element so close to our target. But still, all pairwise combinations of crosses between all the lines are necessary, resulting in a grid that is symmetrical on either side of a line separating reciprocal crosses – that is, the same cross repeated with the contributing parents’ gender reversed.

Let’s consider an example of a simple complementation cross assuming five independent mutant lines that are all recessive lethal (so they are all balanced – remember the balancer carries a dominant visible marker that is recessive lethal). A PLUS sign indicates the cross produces transheterozygous progeny that are therefore not balanced: mutant 1/mutant 2. This means the mutations are in different genes, and so the progeny have wild type alleles for the two different genes, and so they complemento each other. The genotype of the progeny is written as:

or more simply (if obliquely):

(If an allele is wild type we tend to make the symbol vanish and just leave the + sign, like the Cheshire cat’s smile).

If the alleles fail to complement, indicated by a MINUS sign, then only balanced progeny are obtained, arguing the independently isolated mutant alleles are in fact in the same gene. In Figure 1, note that mutant 1 fails to complement mutant 2, but complements all the other mutants. So mutant 1 and mutant 2 are in two different genes mutant 2 has only one allele, and mutant 1 has 4 alleles (mutant 1, 3, 4 and 5.)

Another way to visualize this is by using colour. Yellow for failure to complement (alleles of the same gene) and blue for complementation (alleles of different genes) as shown in Figure 2. I chose these colors partly because I get to make what looks like a reverse Swedish flag, and partly to help those with red green colour blindness (but not people with blue yellow colour blindness which is far more rare – highly unlikely that the well over three people reading this blog are afflicted….)Notice the symmetry. Usually, only half the crosses are done, in one direction only, if no parent-of-origin effects are suspected. What are parent-of-origin effects? An example is imprinting, discussed in an earlier post. Something that causes the expression of otherwise identical alleles to change, depending on the sex of the parent from which they were inherited. If no parent-of-origin effects are suspected (often a rather rash conclusion), only half the cells in the table are provided with data, the undescribed cells on the flip side of the line of symmetry are assumed to be the same, as shown for our hypothetical example in Figure 3.

So what about our DMAP1 mutants? The first and most important crosses to carry out use a different genetic background with a known lesion in the DMAP1 region. ¿Por qué? Look here for an explanation of the importance of genetic backgrounds.

My colleague Kathleen Fitzpatrick ordered in some fly stocks with deficiencias in the region – molecularly or cytologically defined deletions of genetic material. Since these deficiencies remove many essential genes, they are usually recessive lethal, and so are balanced. Kathleen ordered two different deficiencies (two different genetic backgrounds) that remove DMAP1, and one that does not, but which is located very near DMAP1. Take a look at this map from Flybase: the regions DELETED by the deficiencies are indicated by red bars.

The three relevant deficiencies (indicated with asterisks) are Df(404) (DMAP1 still present), Df(403) and Df(701), (both of which delete DMAP1, but were generated from different screens and so have different genetic backgrounds). I crossed all the putative DMAP1 lethals to each other Kathleen introduced the deficiencies. Figure 5:

So here is the first surprise (and inevitable disappointment). Remember that YELLOW means failure to complement, and BLUE complements. Yellow all down the diagonal as we expect – all the stocks involved in these crosses have recessive lethal mutations or deletions. First look at the inter se crosses between the putative DMAP lesions. Notice that 10-14 complements the other two putative DMAP1 lesions – 22-13 and K-14 – which fail to complement each other, so there must be hits in at least dos different complementation groups, or genes, here. Already we have information showing that at least a subset of our putative deletions are unlikely to be in DMAP1. Buggah.

The cross to the deficiencies tells the tale, however. All three putative DMAP1 lesions we have made complemento the deficiency that does NOT remove DMAP1 (+DMAP1) but only 10-14 fails to complement the deficiencies that remove DMAP1 (-DMAP1). Notice I have blue hatching to indicate results with K-14. These crosses were not actually done, but since K-14 complements 10-14, and fails to complement 22-13, I suspect K-14 carries the same background lethal as 22-13 (which is odd, because they were isolated in different years, so are bound to be independent events). But it looks like only 10-14, of the three lethal putative DMAP1 male recombination mutants, is actually likely to be a lesion in DMAP1. Which is better than nothing.

What about parent-of-origin effects? DMAP1 stands for DNA methyltransferase 1-associated protein, and DNA methylation plays a crucial role in imprinting, which is an evolutionarily conserved parent-of-origin effect. So we developed a more complicated complementation grid – somewhat incomplete – that shows data from crosses in ambos direcciones. Also, since this test includes potential DMAP1 mutants that produce homozygous progeny, some with fertility issues, I have altered the colouring scheme to reveal potential hypomorphic effects, assuming a reducción in DMAP1 activity, as opposed to a complete loss on function – which we assume to be lethal (see here for argument). Remember that yellow means failure to complement, and blue means full complementation. Use Table 1 to follow how variations in these colours mean variations in viability. The cut-offs are arbitrary, simply based on my experience. For every cross, I scored (counted) at least 100 progeny flies. If you are unsure of where the ratios come from, study Figure 6.

And now here are the actual data (Figure 7):

So it looks like 10-14 is the closest thing we have to a lesion in DMAP1. The other lethals are suspect, and should be chucked. Since the original P hit in DMAP1, used for the male recombination scheme, was not itself a lethal, the lethal lines that complement the deficiencies which take out DMAP1 must have incurred a second hit during the male recombination scheme. That means that the lethal lines 22-13 and K-14 share the same newly induced background lethal. As I mentioned, and you might suspect from the naming system for these mutants, they were isolated in different years (2013 and 2014). So the same lethal was generated twice! I am not a big fan of coincidence, so something interesting (but annoying) happened here. But since DMAP1 wasn’t apparently involved, we really should abandon it. Buggah.

What about the non lethals? 20-11 and K2-13 sort of fail to complement each other. Moreover, 20-11 and 10-14 – our putative DMAP1 lethal – also sort of fail to complement, but only in one direction, when the lethal comes in from the male parent. So maybe we do have a hypomorph here (20-11) that supports an argument for a DMAP1 function in a parent-of-origin effect (like imprinting). To make things messier (why not), note that K2-13 also partly fails to complement 10-14, but in the other direction that we see for 20-11. (K2-13 also partly fails to complement 12-14, which itself pretty much complements 10-14. This is the sort of shop talk that drives normal people nuts). What does that mean? Dunno. I scored 100 flies total for each cross – the numbers (and therefore shading) might be slightly different if a larger number had been scored. Sample size, statistics etc.

So if I were in a chucking mood (which I rarely am, being something of a fly hoarder), which stocks should I chuck, and which should I keep?

Of course I should simply keep 10-14 and possibly 20-11. Alas, all the interesting sterility issues must now be revisited….that wonderful messed-up ovary picture I took was for 20-13, which steadfastly complements everything.

Well it was nice while it lasted.

¿Ahora que? We have pretty much reached the limits of classical genetics. We could cross our 10-14 lesion to increasing numbers of deficiencies to narrow down cytologically where our lesion is. We could do some cytology to look at chromosomes, to try to visualize the actual nature of the lesion. All these things we might have done twenty, thirty years ago. But at this point, we have to go molecular, which is great because we can drill down in much more detail, but also not so great because it costs money.

The best thing would be to do a Southern blot at this point. A Southern is a procedure where genomic DNA is fractionated by cutting it up in a defined manner (using a restriction enzyme that cuts at a specific DNA sequence) and separating out all the fragments by size in a gel. The gel is then blotted with a nylon membrane and the pattern of fragments is transferred to the nylon membrane by capillary action. The membrane is then washed with a labeled piece of DNA (a probe) that matches the region containing DMAP1 (for instance, the probe could be a DNA copy of the mRNA). The probe is labeled with something that can be visualized (colorimetric, radioactivity etc) and the pattern of bands analyzed. This method could tell us (1) if the region containing DMAP1 has been disrupted at the molecular level and (2) what the nature of that disruption might be. It could be a complete deletion of the coding sequence for DMAP1, or partial. Look here for a description from Ed Southern who developed the method in 1975. Initially he couldn’t get the work published, so scribbled it on an envelope for colleagues who really wanted to use it. No blogs then.

But Southerns are expensive. You need labeling materials, special nylon membranes, masses of chemicals etc. Fortunately, there is a cheaper alternative (though it does not give as much information) and that is PCR – polymerase chain reaction.

PCR is the one molecular acronym my freshman biology students usually recognize (outside of DNA), because it shows up in CSI etc. Yey, for science in crime shows (a great source of boo boo material for my exams) but it takes a solid understanding of how DNA replication works to fully appreciate the power of this highly efficient technique. It is also a method that doesn’t have to cost a ton of money. So that’s where we will head. Time to get down to the DNA, and characterize the nature of the 10-14 lesion in DMAP1!


Complementation

As we saw above, rapid lysis (r) mutants were found that mapped to three different regions of the T4 genome: rI, rII, y rIII.

  • those in different regions were not alleles of the same gene.
  • more than one gene product participated in the lysis function.
  • E. coli strain K (which rII mutants can infect but not complete their life cycle) &mdash growing in liquid culture &mdash was
  • coinfected with two different rII mutants (shown in the figure as "1" and "2").
  • each should be able to produce the gene product missing in the other &mdash complementation &mdash and
  • living phages will be produced. (Again, there is no need to count plaques simply see if they are formed or not.)

From these results, you can deduce that these 5 rII mutants fall into two different complementation groups, which Benzer designated

  • A (containing strains 1, 2, and 4) and
  • B (containing strains 3 and 5)
  • If either A or B is mutated on the same DNA molecule ("cis"), there is no function while
  • if A is mutated in one DNA molecule and B in the other ("trans"), function is restored.
  • they are in the "trans" (on different DNA molecules)
  • but not when they are in "cis" (on the same DNA molecule).

Benzer coined the term cistrón for these genetic units of function. But today, we simply modify earlier concepts of the "gene" to fit this operational definition.


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